在醛脱氢酶存在下产生发酵产物的制作方法

专利名称：在醛脱氢酶存在下产生发酵产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及将植物来源的材料发酵为所期望发酵产物的方法。该发明亦涉及使用 一种或多种发酵生物自植物材料产生发酵产物的方法；可用于本发明方法和/或工艺中的 组合物；转基因植物；和修饰的发酵生物。
背景技术：
大量难以人工产生的商业产品现在通过发酵生物产生。上述产品包括醇类(例 如，乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、 葡糖酸盐、乳酸、琥珀酸、2，5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨 酸)；气体(例如，H2和CO2),以及更加复杂的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉属和 四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、Β12、β-胡萝卜素)；以及激素。发酵亦常用于消费醇 类(例如，啤酒和葡萄酒)、乳类制品(例如，用于生产酸奶和奶酪)、皮革和烟草工业。大量通过发酵由含淀粉和/或木素纤维素材料降解提供的糖产生发酵产物(如乙 醇)的方法是本领域已知的。然而，自植物材料产生发酵产物(如乙醇)仍然成本太高昂。因此，需要提供可增 加所述发酵产物的产量从而减少产生成本的方法。

发明内容
在第一个方面，本发明涉及在发酵培养基中使用发酵生物将植物材料来源的糖发 酵成为发酵产物的方法，其中一种或多种醛脱氢酶存在于所述发酵培养基中。在第二个方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤i)将含淀粉材料液化；ii)糖化所述经液化的材料；和iii)使用发酵生物进行发酵；其中发酵根据本发明的发酵方法进行。在第三个方面，本发明涉及自含淀粉材料 产生发酵产物的方法，包括下述步骤(a)在所述含淀粉材料的起始糊化温度以下的温度糖化含淀粉材料；和(b)使用发酵生物进行发酵；其中发酵根据本发明的发酵方法进行。在第四个方面，本发明涉及自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括下述 步骤(a)预处理含木素纤维素材料；(b)将所述材料水解；(c)使用发酵生物进行发酵；其中发酵根据本发明的发酵方法进行。在第五个方面，本发明涉及包含一种或多种醛脱氢酶的组合物。
在第六个方面，本发明涉及在本发明的发酵方法或工艺中使用醛脱氢酶或本发明 的组合物。在第七个方面，本发明涉及转基因植物材料，其中该植物材料用编码醛脱氢酶的 多核苷酸序列转化。在第八个方面，本发明涉及经修饰的发酵生物，其中所述发酵生物用编码醛脱氢 酶的多核苷酸转化，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达醛脱氢酶。附图简述

图1是关于醛脱氢酶如何能够在过量乙酸和NADH+存在下在发酵过程中逆转乙 醛-至-乙酸平衡的示意2说明了在同时糖化和发酵过程中醛脱氢酶对乙醇得率(yield)的作用。发明详述乙醇发酵是氧化还原中性的(redox neutral) 0然而，在其他细胞过程中产生的 过量NAD (P) H必须由下述机理来平衡，在所述机理中，NAD (P) H重新氧化为NAD (P) +以避免 NAD (P)+/NAD (P) H比例的不平衡。过量乙酸和NAD (P) H的存在可促进产生乙醛的逆反应，而 乙醛可随即转化为乙醇(参见图1)。因此，在发酵过程中醛脱氢酶的存在/添加可导致数 种积极作用，包括1)重新产生NAD(P)+，并增加发酵产物得率(例如，乙醇)，和2)增强发 酵生物(例如，酵母)的生长。因此，本发明的第一个方面涉及在发酵培养基中使用发酵生物将来源于植物材料 的糖发酵为发酵产物的方法，其中在发酵产物中存在一种或多种醛脱氢酶。所述醛脱氢酶可在发酵之前和/或过程中添加/导入。所述醛脱氢酶可来自外源， 和/或可以，例如，在原位通过由所述发酵生物过表达醛脱氢酶来产生。后者可通过制备经 修饰能够表达ALDH的发酵生物(例如酵母)来实现，例如通过用一种或多种ALDH编码基 因转化该酵母或导入增加内源ALDH基因表达的启动子来进行。将ALDH基因导入发酵生物 (如酵母)和/或在发酵生物中过表达ALDH基因的技术，是本领域已知的。醛脱氢酶亦可 以含有和/或表达醛脱氢酶的转基因植物材料的形式存在于/导入所述发酵培养基。醛脱氢酶(ALDH)根据本发明，所谓醛脱氢酶(ALDH)可为任何来源，如哺乳类或微生物来源，如细 菌或真菌来源的任何单独的醛脱氢酶，或两种或更多ALDH的组合。在一个优选实施方案 中，所述ALDH是真菌来源的，优选酵母来源。在一个优选实施方案中，所述ALDH来源于酵 母属(Saccharomyces),如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。ALDH 为 EC 1. 2. 1. 3(醛脱氢酶 NAD⑴)、EC 1.2. 1.4(醛脱氢酶(NADP(+))和 EC 1.2. 1.5醛脱氢酶(NAD(P) (+))分类下的酶。EC分类基于国际生物化学和分子生物学联 合会(IUBMB)命名委员会的推荐。对EC分类的描述可见于互联网，例如，在“expasv. org/ enzyme/”。ALDH是催化下列反应的酶ECl. 2. 1. 3 :S+NAD(+) +H2O O 酸+NADHEC1. 2.1. 4 醛+NADP(+) +H2O 酸+NADPHECl. 2· 1. 5 醛+NAD(P)(+)+H2O 酸+NAD(P)H多种形式存在于哺乳类的胞质溶胶、线粒体和内质网中。其归类为1类(胞质溶胶)、2类(线粒体)和3类(肿瘤和其他同工酶)。在一个实施方案中，所述ALDH归类为ECl. 2. 1. 3。在一个实施方案中，所述ALDH归类为ECl. 2. 1.4。在一个实施方案中，所述ALDH 归类为ECl. 2. 1.5。在一个实施方案中，所述ALDH为1类ALDH。在一个实施方案中，所述 ALDH为2类ALDH。在一个实施方案中，所述ALDH为3类ALDH。ALDH的实例可见于下列参 考文献Saigal 等，1991，J. Bacteriology 173(10) 3199-3208, concerns cloning ofmitochondrial ALDH gene of Saccharomyces cerevisiae。Farres 等(1989) discloses the primary structure of rat and bovine livermitochondrial ALDH。Guan 等(1990) discloses the sequence of precursor bovine livermitochondrial ALDH。Hsu φ, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :3771-3775discloses cloning ofcDNAs for human ALDH land 2。Jones 等，1988，Proc. Nail. AcacL Sci. USA 85 :1782_1786concerns cloningand complete nucleotide sequence of a full-length cDNA encoding a catalyticallyfunctional rumor-associated ALDH。Hempel 等，1984, Eur. J. Biochem. 141 :21_25, discloses the primary structure of ALDH from human liver。Johansson^, 1988,Eur. J. Biochem. 172 :527-533, concerns mitochondrialALDH from horse liver。可市购的ALDH包括来自酿酒酵母的，可从SIGMA，USA得到(产品#A6338)。发酵培养基短语“发酵培养基”指进行发酵的环境，包括发酵底物，S卩，由发酵生物代谢的碳 源，且可包括发酵生物。所述发酵培养基可包括供发酵生物的营养物和生长刺激剂。营养物和发酵刺激剂 广泛用于发酵领域，且包括氮源，如氨、维生素和矿物质，或其组合。在发酵后，所述发酵培养基可进一步包含发酵产物。发酵生物术语“发酵生物”指任何适于产生所期望的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生 物，包括酵母和丝状真菌。所述发酵生物可为C6或C5发酵生物，或其组合。C6和C5发酵 生物在本领域均众所周知。根据本发明合适的发酵生物能够将可发酵的糖(如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、 甘露糖或阿拉伯糖)直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces) 白勺，牛寺另Oi酉良(Saccharomyces cerevisiae) ^C^^i'f## (Saccharomyces uvarum)的菌株，毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株 如树干毕赤酵母CBS 5773或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的菌株；假丝酵母属 (Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candidautilis)，阿糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans),ii^f ESjix^if^fiJ (Candida diddensii), Candida sonorensis,^Ρ^ 塔假丝酵母(Candida shehatae)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假丝 酵母(Candida boidinii)的菌株。其他发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多 形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母 (Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵 母(Kluyveromyces marxianus)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces),特别是粟酒裂殖酵 母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆 菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞 菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细 菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯 氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属 (Clostridium)，特别是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter),特别是产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BGlLl (App 1. Microbiol. Biotech. 77 :61_86)和乙醇热厌氧杆 菌(Thermoanarobacter ethanolicus),，热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterther mosaccharoIyticum)或 Thermoanaerobacter mathrani 的菌株。还想到的是乳杆菌属 (Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌 R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷 酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。在一个实施方案中，所述发酵生物为C6糖类发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。对于发酵木素纤维素来源材料，涵盖了 C5糖发酵生物。大多数C5糖发酵生物也 发酵C6糖。C5糖发酵生物的实例包括毕赤酵母，例如树干毕赤酵母菌种的菌株。C5糖发 酵细菌也是已知的。而且，一些酿酒酵母菌株发酵C5(和C6)糖。实例为能够发酵C5糖 的酵母属菌种的经遗传修饰的菌株，包括，例如，Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology, p. 1852—1859 禾口 Karhumaa 等，2006，Microbial Cell Factories 5 18 禾口 Kuyper 等，2005，FEMS YeastResearch 5925-934 中涉及的菌株。在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培 养基的中活的发酵生物(如酵母)计数为IO5至1012，优选IO7至IOki的范围内，特别是约 5xl07。对于乙醇发酵，酵母是优选的发酵生物。优选的是酵母属的菌株，特别是酿酒酵母 种的菌株，优选对高水平的乙醇(即，高至例如约10、12、15或20vol%或更高的乙醇)具有 抗性的菌株。可市购的酵母包括，例如，RED STAR 和ETHANOL RED 酵母(可由Fermentis/ Lesaffre, USA 得到)，FALI (可由 Fleischmann，s Yeast, USA 得到)，SUPERSTART 和 THERMOSACC 新鲜酵母(可由 Ethanol Technology, WI,USA 得到)，BI0FERM AFT 和 XR(可 由 NABC-North American BioproductsCorporation，GA，USA 得到)，GERT STRAND(可由 Gert Strand AB, Sweden 得到)，以及 FERMI0L(可由 DSM Specialties 得到)。
根据本发明能够自可发酵的糖类，包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖或阿拉 伯糖产生期望的发酵产物的发酵生物，优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将 所述发酵生物导入/添加入所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长 并未发生。该期间称为“迟滞期”，且可看作适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长 速率逐渐增加。经过一个最大生长的期间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。 又一段时间后所述发酵生物进入“死亡期”，其间活细胞数减少。在一个实施方案中，当所述发酵生物处于迟滞期时，将所述醛脱氢酶添加至所述
发酵培养基。在另一个实施方案中，当所述发酵生物处于指数期时，将所述醛脱氢酶添加至所 述发酵培养基。在另一个实施方案中，当所述发酵生物处于稳定期时，将所述醛脱氢酶添加至所 述发酵培养基。发酵产物术语“发酵产物，，意指使用发酵生物通过包括发酵的方法或工艺生成的产物。根 据本发明所包括的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙 酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例 如，吐和0)2)；抗生素(例如，青霉属和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、Β12、β-胡萝卜 素)；以及激素。在优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即， 可饮用的中性酒)；或工业乙醇或用于消费醇类工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业 (例如，发酵的乳制品)、皮革和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、 烈性啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porters)、陈贮啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麦
(malt liquors)、happoushu(胃夕包胃)、冑酉享口卑胃(high-alcohol beer)、f氏酉享口卑胃 (low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。使用的 优选发酵工艺包括醇发酵工艺。根据本发明方法获得的发酵产物(如乙醇)可优选用作燃 料。然而，对于乙醇，其亦可用作饮用乙醇。发酵用于本发明方法或工艺的植物起始材料可为含淀粉材料和/或含木素纤维素材 料。发酵条件基于例如，植物材料的种类、可用的可发酵糖类、发酵生物和/或期望的发酵 产物来确定。本领域技术人员可方便地确定合适的发酵条件。根据本发明的发酵可在通常 使用的条件下进行。优选的发酵方法为厌氧方法。本发明的方法或工艺可作为分批或连续过程进行。本发明的发酵可在超滤系统中 进行，其中在存在固体、水和发酵生物的循环下保持渗余物，而渗透物为所期望的含有液体 的发酵产物。同样涵盖的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法/工艺，其中在存 在固体、水和发酵生物的循环下保持渗余物，而渗透物为所期望的含有液体的发酵产物。在发酵后，发酵生物可自发酵浆料分离并再循环。发酵源自淀粉的糖不同类型的发酵生物可用于发酵来源于含淀粉材料的糖。发酵通常使用酵母，如 酿酒酵母作为发酵生物进行。然而，细菌和丝状真菌亦可用作发酵生物。一些细菌与，例如 酿酒酵母相比较，具有较高的最适发酵温度。因此，在这样的情况下，发酵可在高达75°C，例如，40-70°C，如50-60°C的温度进行。然而，亦已知最适温度显著较低，低至大约室温(约 20°C)的细菌。合适的发酵生物的实例可见于上面的“发酵生物”部分。对于使用酵母产生乙醇，发酵可在一个实施方案中持续24至96小时，特别是35 至60小时。在一个实施方案中，发酵在20至40°C，优选26至34°C，特别是约32°C的温度 进行。在一个实施方案中，pH为pH3至6，优选约pH4至5。其他发酵产物可在本领域技术人员已知适于该发酵生物的温度下进行。发酵通常在3至7，优选pH 3.5至6的范围的？礼如约？!1 5进行。发酵通常持续 24-96小时。发酵木素纤维素来源的糖不同类型的发酵生物可用于发酵来源于含木素纤维素材料的糖。发酵通常由酵 母、细菌或丝状真菌进行，包括在上面“发酵生物”中提及的那些。如果目标是C6可发酵的 糖，条件通常类似于上述的淀粉发酵。然而，如果目标是发酵C5糖(例如，木糖)或C6和 C5可发酵的糖的组合，发酵生物和/或发酵条件可能会不同。细菌发酵可在比通常的酵母发酵更高温度，如高至75°C，例如，40_70°C，如 50-60°C进行，而后者通常在20-40°C的温度进行。然而，亦已知在低至20°C温度的细菌发 酵。发酵通常在3到7范围的pH，优选pH 3.5到6，如约pH 5进行。发酵通常持续24-96 小时。Ml^在发酵之后，可自发酵培养基中分离发酵产物。可蒸馏发酵培养基以提取期望的 发酵产物，或可自发酵培养基中通过微滤或膜过滤技术提取期望的发酵产物。或者，可通过 气提(stripping)回收发酵产物。回收技术在本领域为众所周知的。自含淀粉材料产生发酵产物自经糊化的含淀粉材料中产生发酵产物的方法在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物(特别是乙醇)的方法，所述方 法包括液化步骤，以及顺序或同时进行的糖化和发酵步骤。本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤i)液化含淀粉材料；ii)糖化所述经液化的材料；iii)使用一种或多种发酵生物进行发酵，其中发酵在一种或多种醛脱氢酶的存在 下进行。糖化步骤ii)以及发酵步骤iii)可顺序或同时进行。醛脱氢酶可在同时糖化和 发酵步骤或发酵步骤iii)之前(例如，在液化步骤i)或单独的糖化步骤ii)过程中)和 /或过程中添加。所期望的发酵产物，如特别是乙醇，可任选地在发酵后回收，例如，通过蒸馏进行。 合适的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下面“酶”部分。液 化步骤优选在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶存在的条件下 进行。所述发酵生物优选是酵母，优选酿酒酵母菌株。合适的发酵生物列于上面“发酵生 物”部分。在一个特定的实施例中，本发明的方法在步骤(i)之前还包括下述步骤
χ)减小含淀粉材料的粒度；y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。减少所述含淀粉材料的粒度的方法对本领域技术人员是已知的。特别涵盖的是将 所述含淀粉材料磨制(milling)以减少粒度。含水浆料可含有10_55wt%含淀粉材料的干固体(DS)，优选25_45wt%的干固体 (DS)，更优选30-40%干固体(DS)。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶，优 选细菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化(或稀化(thinning))。在一个实施方案中， 在进行本发明步骤i)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步 使其糊化。液化过程可作为三步热浆方法来进行。将浆料加热至60-95°C，优选80-85°C，并 添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。然后可将浆料在95-140°C，优选105-125°C的温度喷 射蒸煮约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟。使浆料冷却至60-95°C并添加更 多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化方法通常在PH 4. 5-6. 5，特别是在ρΗ 5至 6进行。糖化步骤(ii)中的可使用本领域众所周知的条件进行。举例而言，完全的糖化步 骤可持续约24至约72小时，然而，亦通常仅在30-65°C，通常约60°C的温度进行通常40-90 分钟的预糖化，然后是在同时发酵和糖化(SSF)方法中在发酵过程中的完全糖化。糖化通 常在20-75°C，优选40-70°C，通常约60°C的温度，在约ρΗ 4-5的pH，通常在约ρΗ 4. 5进行。发酵产物，特别是乙醇生产中最广泛使用的方法为同时糖化和发酵(SSF)方法。 其中对糖化没有保持阶段，意思是发酵生物(如酵母)和酶，包括醛脱氢酶可一起添加。 当发酵生物是酵母，如酿酒酵母菌株，而所期望的发酵产物是乙醇时，SSF通常在20°C到 40 V，如28 V到35 °C，优选约32 °C的温度进行。其他发酵产物可在本领域技术人员众所周知适于所用发酵生物的条件和温度下 进行发酵。根据本发明，在发酵过程中温度可上下调节。自未糊化的含淀粉材料产牛发酵产物的方法在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物，而无含淀粉材料的糊化(通 常称作“无烹制”)的方法。根据本发明，可产生期望的发酵产物，如乙醇，而不液化含有含 淀粉材料的含水浆料。在一个实施方案中，本发明的方法包括在起始糊化温度以下，优选在 α -淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下对(例如，经磨制的)含淀粉材料，例如粒状淀粉进 行糖化以产生糖类，所述糖类可由合适的发酵生物发酵成期望的发酵产物。在本发明的实施方案中，期望的发酵产物(优选乙醇)自未糊化的(即，未烹制 的)，优选经磨制的谷类谷粒，如玉米(corn)产生。因此，在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤(a)在所述含淀粉材料的起始糊化温度以下的温度糖化含淀粉材料；(b)使用一种或多种发酵生物进行发酵，其中发酵在一种或多种醛脱氢酶的存在 下进行。在一个优选实施方案中，步骤(a)或(b)同时(即，一步发酵)或顺序进行。所述发酵产物，如特别是乙醇，可任选地在发酵后回收，例如，通过蒸馏进行。合适 的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下面“酶”部分。通常淀粉酶，如葡糖淀粉酶和/或其他糖原生成酶和/或α-淀粉酶存在于发酵过程中。术语“起始糊化温度”意指淀粉发生糊化的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在 约50°C _75°C开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人 员确定。从而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定变种以及生长条件而改变。 在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用由Gorinstein. S.和 Lii. C.，1992Starch/Starke, 44(12) :461_466描述的方法5%的淀粉颗粒丧失双折射的温 度。在步骤(a)之前，可制备含淀粉材料，如粒状淀粉的浆料，其具有10_55wt%含淀 粉材料的干固体(DS)，优选25-45衬％干固体，更优选30-40%干固体。浆料可包含水分和 / 或工艺水(process water)，例如釜溜物(逆流(backset))、洗涤水(scrubber water)、 蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其他发 酵产物设备(Plant)的工艺水。由于本发明的方法在起始糊化温度以下进行，因此不发生 显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1 至约70vol %，优选15-60vol %，特别为约30至50vol %的水和/或工艺水，如釜馏物(逆 流)、洗涤水、蒸发器冷凝物或蒸馏物，来自蒸馏的侧线汽提器水，或来自其他发酵产物设备 的工艺水，或其组合等。可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0. 05至3. Omm,优选0. 1-0. 5mm来制 备含淀粉材料。在进行本发明的方法或工艺后，含淀粉材料中至少85%，至少86%，至少 87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少 95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，或者优选至少99 %的干固体转化为可溶的淀粉水解 物。本发明该方面的方法在低于起始糊化温度的温度进行。当步骤(a)与发酵步骤 (b)分开进行时，温度通常位于30-75°C的范围内，优选45-60°C的范围内。然后下述单独的 发酵步骤(b)在适于发酵生物的温度进行，当所述发酵生物是酵母时，其通常为25-40°C的 范围。在一个优选实施方案中，步骤(a)和步骤(b)作为同时糖化和发酵方法进行。在 这样的实施方案中，当所述发酵生物是酵母时，所述方法通常在25-40°C，如29-35°C，如 300C _34°C，如约32°C的温度进行。本领域技术人员可容易地确定何种方法条件是适合的。在一个实施方案中，进行发酵从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如 6wt%以下，如约3wt%以下，如约2wt%以下，如约Iwt %以下，如约0. 5%以下或0. 25wt% 以下，如约0. 以下。所述低水平的糖可通过简单的使用经调整量的酶和发酵生物来 实现。本领域技术人员可方便地确定使用的酶和发酵生物的剂量/量。酶和发酵生物的 使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为约 0. 5wt%以下，如约0. 2wt%以下。本发明的方法可在pH约3-7，优选pH 3. 5至6，或更优选pH 4至5进行。含淀粉材料根据本发明，可使用任何合适的含淀粉的起始材料，包括粒状淀粉(未烹制的生 淀粉)。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明方法或工艺的含 淀粉的起始材料的实例包括块茎、根、茎、全谷粒、玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、稻、豌豆(pea)、豆(bean)或甘薯，或它们的组合，或谷类。也涵 盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。术语“粒状淀粉”意指未烹制的生淀粉，S卩，以其天然形式存在于谷类、块茎或谷粒 中的淀粉。淀粉在植物细胞中作为微小的不溶于水的颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗 粒可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50°C至75°C的温度，膨胀可为可逆的。然而，在 更高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉质量，优 选至少90 %，至少95 %，至少97 %或至少99. 5 %纯，或者其可为更加粗制的含淀粉材料，其 含有包括非淀粉部分(例如胚残余物和纤维)的(例如，经磨制的)全谷粒。原材料(如 全谷粒)可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两 个方法，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白 质)的良好分离，并通常用于使用淀粉水解物产生，例如，糖浆的场合(location)。干磨和 湿磨在淀粉加工领域都是众所周知的，并等同地涵盖于本发明的方法中。在一个实施方案 中，粒度减少至约0. 05到3. Omm,优选0. 1-0. 5mm,或使得至少30 %，优选至少50 %，更优选 至少70%，甚至更加优选至少90%的含淀粉材料可穿过具有0. 05到3. Omm筛网，优选0. 1 到0. 5mm筛网的筛。自轴蘭麵遍种舗內勿在此方面，本发明涉及自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法。将含木素纤维 素材料转化为发酵产物，如乙醇，具有大量原料(包括木材、农业残余物，草本作物，城市固 体废物等)现成可用的优势。含木素纤维素材料通常主要由纤维素、半纤维素和木质素组 成，并常常称作“生物质”。木素纤维素的结构使其无法直接的接受酶水解。因此，含木素纤维素材料 必需经预处理，例如，通过在足够的压力和温度条件下的酸水解，这是为了打破木质 素的密封(seal)并破坏纤维素的晶体结构。这导致半纤维素和纤维素组分的溶解 (solubilization)。所述纤维素和半纤维素可随即用酶水解，例如通过纤维素分解酶和/ 或半纤维素分解酶，以将碳水化合物聚合物转化为可发酵的糖类，其可经发酵成为所期望 的发酵产物，例如乙醇。任选地，所述发酵产物可通过，例如，也如上所述的蒸馏加以回收。在此方面，本发明涉及自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括下述步 骤 (a)预处理含木素纤维素材料；(b)将该材料水解；(c)使用一种或多种发酵生物进行发酵，其中发酵在一种或多种醛脱氢酶存在的 情况下进行。所述醛脱氢酶可在发酵之前和/或过程中添加。水解步骤(b)和发酵步骤(C)可 顺序或同时进行。在优选实施方案中，所述步骤以SSF、SHF或HHF方法步骤进行，所述步骤 进一步在下面描述。预处理所述含木素纤维素材料可根据本发明在被水解和/或发酵之前经预处理。在一个 优选实施方案中，将经预处理的材料在发酵之前和/或过程中水解，优选酶催化水解。预处 理的目标为分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，且该方法改善了酶水解的速率。根据本发明，预处理步骤(a)可为本领域技术人员已知的常规预处理步骤。预处 理可在含水浆料中进行。含木素纤维素材料可在预处理期间以IO-SOwt%，优选20-50wt% 的量存在。化学、机械和/或生物预处理所述含木素纤维素材料可根据本发明在水解和/或发酵前经化学、机械和/或生 物预处理。机械处理(常常称作物理预处理)可单独使用或和后续或同时的水解(特别是 酶水解)组合使用，从而促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。优选的，所述化学、机械和/或生物预处理在水解和/或发酵之前进行。或者，所 述化学、机械和/或生物预处理可与水解，如与添加一种或多种纤维素分解酶或下面提及 的其他酶同时进行，以释放可发酵的糖类，例如葡萄糖和/或麦芽糖。在本发明的一个实施方案中，所述预处理的含木素纤维素材料在水解步骤(b)之 前或之后经洗涤和/或解毒。这可能改善，例如，稀酸水解的含木素纤维素材料(例如，玉 米秸杆(corn stover))的可发酵性。解毒可以任何合适的方式进行，例如，通过蒸汽气提、 蒸发、离子交换、树脂或木炭处理液体级分或洗涤所述经预处理的材料来进行。化学预处理根据本发明“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/ 或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括用，例如稀酸、石灰、碱、 有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行处理。进一步，湿法氧化和控制PH的水热解 (hydrothermolysis)也是期望的化学预处理。优选的，所述化学预处理为酸处理，更优选，为连续的稀酸和/或弱酸(mildacid) 处理，例如，用硫酸，或其他有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物处理。也可 使用其他酸。弱酸处理在本发明的上下文中意为处理的PH在1-5，优选pH在1-3的范围内。 在一个特定实施方案中，所述酸浓度在0. 1到2. 0衬％酸(优选硫酸)的范围内。该酸可与 根据本发明方法待发酵的材料混合或相接触，且混合物可保持在160-220°C，如165-195 范围内的温度，处理时间为数分钟到数秒，例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可添 加强酸(如硫酸)来移除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。根据本发明也涵盖纤维素溶剂处理，显示其可将约90%的纤维素转化为葡萄糖。 也显示当木素纤维素结构被破坏时，极大增强了酶水解。碱、H2O2、臭氧、有机溶剂(使用水 性醇中的路易斯酸，FeCl3, (Al)2SO4)、甘油、二ρ恶烷，苯酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结 构并促进水解的溶剂(Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96 :673_686)。使用碱，例如NaOH，Na2CO3和/或氨等的碱性化学预处理也在本发明的范围 内。使用氨的预处理方法描述于 WO 2006/110891、WO 2006/110899、W02006/110900、WO 2006/110901，其通过提述并入本文。湿氧化技术涉及使用氧化剂，如，基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包 括用DMSO (二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1到60分钟，如5到30分钟，但可 依赖于待进行预处理的材料进行较短或较长的时间。其他合适的预处理方法的实例描述于Schell等，2003，Appl. Biochem andBiotechn. 105—108 :69_85 禾口 Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96 :673_686，
12以及美国专利申请
发明者刘继银, 宋子良 申请人:诺维信公司