专利名称：对映异构体混合物的去消旋方法
技术领域：
本发明涉及使用酶体系将对映异构体混合物去消旋的方法 现有技术在立体异构领域中，近些年来在消旋和去消旋中已经获得了相当大的进展，消旋 即光学异构体转化成其对应物，以获得外消旋混合物，去消旋是消旋程序的精确逆转。尽管 在立体不稳定化合物的情况中，例如，氰醇、半(硫代)_乙缩醛、α-取代的羰基化合物和 α-取代的乙内酰脲，可以通过简单的、温和的酸或碱催化实现外消旋，但立体稳定化合物， 例如，仲醇和手性胺，外消旋要难得多。后者已经成为可能，例如，通过过渡金属配合物催化的氧化还原过程，其中通过前 手性SP2-杂化中间产物将在手性中心是天然SP3-杂化的一个对映异构体转化成另一个。 参见，例如，0. Pamies 和 J. Ε. Backvall 的研究，Trends Biotechnol. 22，130-135 (2004) 和 Chem. Rev. 103，3247-3261 (2003) ；H. Pellissier, Tetrahedron 59，8291-8327 (2003)； M. J. Kim, Y. Ahn 禾口 J.Park， Curr. Opin. Biotechnol. 13，578—587 (2002) ；V. Zimmermann, M. BelIer 禾口 U. Kragl，Org. Process Res. Dev. 10，622—627 (2006) ；Y. Asano 禾口 S. Yamaguchi， J. Am. Chem. Soc. 127，7696-7697 (2005)。在生物合成领域中，其固有地是高度特异性的，仅有少数“真实”的外消旋酶是 已知的，因为在自然界对外消旋几乎不存在任何需求一这与工业相反。例如，用于α-羟 基羧酸(例如，扁桃酸衍生物)、α-氨基酸和乙内酰脲的外消旋催化的少数一些特异 性酶是已知的(参见，例如，B. Schnel 1，K. Faber 和 W. Kroutil，Adv. Synth. Catal. 345， 653-666(2003))。对于仲醇和伯胺的外消旋，长期以来实际上没有定义的酶是已知的。本发明人的研究组在Chem. Eur. J. 13，8271-8276 (2007)中公开了一种新的外消 旋策略，其是基于反应的热力学观点，替代了反应的动力学观点在由两种对映异构体R和 S以及前手性中间产物P组成的反应体系中，两种光学对映体中的每一种与中间产物是处 于化学和热力学平衡的，即，PSS和R与P。使用两种相反(entgegengesetzt)对映选择性 的醇脱氢酶(下文中称为缩写ADH)的数种组合，这些酶利用相同的辅因子，NAD或NADP (烟 酰胺_腺嘌呤_ 二核苷酸(磷酸))，可以使不同光学活性的仲醇(包括偶姻)外消旋。通 过辅因子量以及氧化和还原形式的之间的比例(即，NAD+NADH和NADP+:NADPH)的合适选 择将醇/酮平衡保持在醇的一侧；对于解释，参见
图1。将NAD(P)+的比例设定为最小时，从纯(S)-异构体出发进行，在几个小时的反应 时间后，获得了所需的外消旋化合物。酮中间产物的量降至低于10%，并且在一些情况中， 降至低于1%。相反，仅使用一种高选择性ADH的比较实验对于大部分测试的ADH是失败 的。只有在一种情况中，在14天的反应时间后，获得了 82% ee的产量(对映异构体过量， 即，光学产量)。在最近才由本发明人公开的研究中(C. V. Voss,C. C. Gruber和W. Kroutil,Angew. Chem. Int. Ed. 47，741-745 (2008))，公开了使用由粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)细
3胞形式的用于醇氧化的对映选择性细菌酶构成的串联系统，立体选择性ADH和NAD作为辅 因子，通过前手性酮作为中间产物的仲醇外消旋化合物的去消旋。通过作为“附加酶”或 “辅助酶”的葡萄糖脱氢酶(下文中，缩写为GHD)平行进行的催化氧化使葡萄糖被氧化成葡 糖酸内酯或葡糖酸，辅因子有效“再生”，即，从氧化形式返回至还原形式；对于解释，参见图 2。在使用冻干粪产碱杆菌细胞的初步实验中，令人惊讶地，发现没有去消旋，而替代 的是作为起始底物的对映异构体纯的醇的消旋化，这归因于作为冻干结果的细胞渗透性的 增强。使用具有完整细胞膜的新鲜收集的细胞，使得氧化和还原彼此分开进行，使得可以选 择性地转化不同仲醇的外消旋化合物，并且所需对映异构体的产量> 99% ee。然而，该现有技术具有几个缺陷。首先，提供用于氧化的酶混合物的粪产碱杆菌体 系不能以精确的术语来限定，使得在其进行的反应中可能存在相当大的变化，并且因此再 现性根本不高。其次，在所有现有的方法中，对于每摩尔异构化醇的辅因子再生，消耗Imol 用于氧化的氧，和化学计量上，Imol葡萄糖，并且作为副产物，另外获得了 Imol葡糖酸或葡 糖酸内酯。因此，本发明的目的是提供改良的去消旋方法，其避免了以上的缺陷。发明描述已经令人惊讶地发现了通过改良的方法实现了这个目的，该方法通过借助立体选 择性醇脱氢酶及其辅因子的氧化和还原反应的结合用于仲醇对映异构体混合物的酶去消 旋，其中光学活性仲醇的一个对映异构体形式上(formal)选择性地被氧化成对应的酮，其 随后选择性地被还原成光学对映体，同时给通过附加酶的还原反应提供辅因子的还原形 式。根据本发明的方法的特征在于使用了两种具有相反立体选择性和不同辅因子选择性的 醇脱氢酶，和两种对应的不同辅因子，用于氧化和还原反应，并且氧化的和还原的辅因子在 使用附加酶的平行酶反应中互变，通过两种醇脱氢酶的选择或使用附加酶对两种辅因子的 选择性差异可以控制去消旋的方向朝向于两种对映异构体之一。通过根据本发明的方法，可以实现具有实质上定量的光学产量的去消旋，即> 99% ee，而不会出现当系统一达到稳定的平衡，平行反应过程中就化学计量地消耗试剂，正 如之后将详细地解释的。此外，精确地限定，使用纯的酶(两种ADH和附加酶)用于催化， 这独有地导致了过程中的可逆反应和极好的再现性。最后，该方法可以在简单的一锅法反 应中进行，就时间或空间而言，不需要各个部分反应之间的分离。所用的醇脱氢酶优选是可购得的或容易获得的醇脱氢酶，例如，来自芽孢杆菌 属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、红球菌属 (Rhodococcus) >^LIfliiM (Lactobacillus)禾口 / 或热厌氧菌属(Thermoanaerobium)的菌 株的细菌酶，例如，来自赤红球菌(Rhodococcus ruber)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefir)或布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobium brockii)菌株的那些或来自酵母菌株的 酶，如曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)或糖酵母属 (Saccharomyces)，因为这些对于对映异构体过量和反应速率特别给予了特别好的结果。然 而，对于合适ADH对的选择是特别关键的需求，两种ADH必须具有相反的立体选择性和不同 的辅因子选择性。辅因子相应地从ADH的特别选择而产生，通常是NAD和NADP，并优选只以 催化的量来使用。
图3说明了本发明方法中的反应过程，其中HTS表示“氢负离子转移体系”，将理解 其表示辅因子“再生”的副反应，其通过称为“Aux”的附加酶来催化，即，氧化和还原形式的 互变。Ic1至k4表示氢负离子转移体系的一级反应的表观速率常数。如图3A中所示的，通过两种相反立体选择性的ADH催化仲醇对映异构体的氧化和 还原反应(图解中未显示)。当进行(S)-来产生(R)-对映异构体的反应时，具有NAD辅 因子优先的(S)-选择性ADH的(S)-异构体的氧化消除了来自醇的氢阴离子，并将其转移 至辅因子的氧化形式NAD+，作为结果，其转化成还原形式NADH。基本上同时地，附加酶Aux 从NADH获取该氢阴离子(这产生了 “Aux-H” )，然后将其转移至氧化形式的第二个辅因子 NADP+,这提供了 NADP+的还原形式NADPH。这通过第二个具有NADP优先的(R)-选择性ADH 依次将氢化物转移至酮中间产物P，这将酮中间产物P还原成(R)-对映异构体。在反方向 中，即，在(R)-异构体转化成(S)-形式中，类似地进行了相反的反应过程。如果表现出酶/辅因子体系保持平衡，同一个氢阴离子通过以上解释的反应，并 最终返回到新的立体反转的醇分子。当附加酶是核苷酸转氢酶时，以上述的简单形式进行氢阴离子通过附加酶从一个 辅因子至另一个的转移。在这种情况中，图3B中的Aux-H表示酶与氢阴离子的复合物。然 而，由于测试的核苷酸转氢酶没有产生令人满意的结果，本发明人在他们对替代物的研究 中发现了替代直接转移氢化物的核苷酸转氢酶，其他的脱氢酶/底物体系来呈现其作用也 是可能的。在这种情况中，Aux-H表示对应于附加酶的底物的还原形式。原则上有用的附加酶包括所有辅因子依赖性氧化还原酶，其不会破坏待去消旋的 仲醇的氧化和还原反应。脱氢酶，优选葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PDH) 和甲酸脱氢酶(FDH)，产生了非常好的结果，并且因此是优选的附加酶。在头两种情况中，作为氢化物转移至底物的结果，葡糖酸或葡糖酸内酯或其6-磷 酸盐被还原成葡萄糖或葡萄糖6-磷酸盐(其产生“Aux-H”)，并立即被再次氧化。在使用 CO2的第三种情况中，情形相似，CO2与作为Aux-H的甲酸盐保持平衡，尽管甲酸盐被氧化成 CO2的反应平衡远离二氧化碳侧，原则上证实了反应的可逆性。因为在根据本发明的方法中 没有(或几乎没有)消耗附加的底物，并因此只需要少量，甲酸脱氢酶/甲酸盐/CO2体系 完全适于本发明的目的，之后的实施例将显示。如上所述，一达到平衡状态，根据本发明的方法就不再导致试剂的化学计算消耗。 由于这取决于具体的酶/底物组合及其选择性，因此预测或预先调节是不可能的。因此，在 实践中，在去消旋过程的开始时建立这种平衡。在该阶段中，其通常持续几分钟，实际上消 耗了少量的附加底物，即，葡萄糖或葡萄糖酸，甲酸盐或co2。其中进行仲醇异构化的方向主要取决于两种ADH的立体选择性和辅因子选择性， 但随后也取决于附加酶对两种辅因子的不同选择性。对于以上方案中所示的实例，其从具 有NAD优先的(S)-选择性ADH和具有NADP优先的(R)-选择性ADH开始进行，实际上可以 通过附加酶的辅因子选择性来预先调整去消旋的方向，这是为什么也可以相当合适地将其 称为“控制酶”。附加酶的氧化或还原模式中的辅因子选择性导致NADH和NADP+转化成NAD+ 和NADPH的作用(图3B中=IiJk3 > k2+k4)，或导致NAD+和NADPH转化成NADH和NADP+的 作用(图3B中ki+k3 < k2+k4)，这在前一种情况中导致(R)-对映异构体的形成，在另一种 情况中导致(S)-对映异构体的形成。当省略控制酶或其底物或控制酶对两种辅因子之一
5不具有选择性时(公认这是非常不可能的)，不仅没有观察到任何去消旋而且_从光学纯 的醇开始进行_实际上是逆反应，即，外消旋，从图4中也能明显看出图4A和4B显示了使 用2-辛醇作为仲醇各自对一种甲酸脱氢酶的反应特征，甲酸脱氢酶具有相反的辅因子选 择性，并且图4C显示了没有FDH的体系的反应特征。然而，也可以通过具有相反立体选择性或辅因子选择性的逆转的ADH对的选择来 逆转去消旋的方向。例如，在以上的方案中，-使用相同的附加酶时-使用了具有NADP优 先的(S)-选择性ADH和具有NAD优先的(R)-选择性ADH，外消旋化合物选择性地形成任选 光学纯的(S)-对映异构体，替代了(R)-对映异构体。根据本发明的方法通常在溶剂中进行，溶剂选自水，水和一种或多种有机溶剂的 单相或多相混合物，和离子液体，尽管出于成本和稳定性的原因，优选使用常规的含水缓冲 体系。理解含水缓冲体系意思是含有物质(例如盐)的含水溶剂，这使得溶液对PH 变化不敏感。已知的含水缓冲体系为，例如，碳酸/碳酸氢盐体系，碳酸_硅酸盐缓冲 剂，醋酸/醋酸盐缓冲剂，磷酸盐缓冲剂，Michaelis巴比妥/醋酸盐缓冲剂，氨缓冲剂， HEPES (4- (2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)和MES (2- (N-吗啉代)乙烷磺酸)。附图简述图1显示了 在通过前手性酮下通过两种特定的ADH的酶催化外消旋的原理图2显示了 具有限定菌株背景的光学拆分和随后的辅因子再生图3显示了 本发明的通过两种特定的ADH和用于辅因子再生的辅助酶(氢负离 子转移体系HTS)的酶-催化去消旋的原理图4显示了 1-苯乙醇的外消旋混合物的迁移A和B 使用甲酸脱氢酶(FDH)，C 没用甲酸脱氢酶(FDH)图5显示了 通过NAD-或NADP-特异性甲酸脱氢酶(FDH)的外消旋混合物的迁移图6显示了 不同反应参数变化对反应平衡的影响图7显示了 不同浓度的附加葡萄糖底物对外消旋平衡的建立的影响，A 不同葡 萄糖浓度对时间的曲线，B 在6小时的反应时间后，ee[% ]与特定葡萄糖浓度的关联。实施例现在参照代表性的、非限制性的工作实施例详细描述本发明。材料、来源和方法酶ADH-A 来自赤红球菌的醇脱氢酶(可从BioCatalytics Inc.购得，现在为 Codexis, Pasadena, USA)。LK-ADH 来自马乳酒样乳杆菌的醇脱氢酶(可从Sigma-Aldrich，Vienna购得， #05643,0. 4IE/mg)。RE-ADH 来自红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)的醇脱氢酶(可从 Sigma-Aldrich, Vienna 购得，#68482, 20IE/ml)。LB-ADH 醇脱氢酶 002 (可从 JUlich Chiral Solutions 购得，现在为 Codexis， #05. 11)。ADH-T 醇脱氢酶 005 (可从 JUlich Chiral Solutions 购得，现在为 Codexis，#26. 10)。ADH-PR2 醇脱氢酶 007(Jiilich Chiral Solutions 购得，现在为 Codexis， #42. 10)。TB-ADH 来自布氏热厌氧杆菌的醇脱氢酶(可从Sigma-Aldrich购得，#A9287, 30-90IE/mg)。G6PDH 来自面包酵母的葡萄糖6_磷酸脱氢酶(可从Sigma-Aldrich购得， #49271,240IE/mg)。GLY-DH 来自白地霉(Geotrichum candidum)的甘油脱氢酶(可从Sigma-Aldrich 购得，#49860，30IE/mg)。LDH-SC 来自葡萄球菌的D-乳酸脱氢酶(可从Sigma-Aldrich购得，#17847， 120IE/mg)。LDH-LS 来自乳杆菌的D-乳酸脱氢酶(可从Sigma-Aldrich购得，#59023，400IE/ mg)。LDH-RM 来自兔子肌肉的L-乳酸脱氢酶(可从Sigma-Aldrich购得，#61311， 500IE/mg)。FDHl :NADP-特异性甲酸脱氢酶001 (可从JUlich Chiral Solutions购得，现在 为 Codexis, #25. 10，47IE/ml)。FDH2 :NADP-特异性甲酸脱氢酶002 (可从JUlich Chiral Solutions购得，现在 为 Codexis, #24.ll，200IE/ml)。FDH3 :NAD_特异性甲酸脱氢酶001 (可从JUlich Chiral Solutions购得，现在为 Codexis, #09. ll,200IE/ml)。FDH4 来自酵母的甲酸脱氢酶(可从 Boehringer Mannheim，GmbH 购得，#204226， 0. 5IE/ml)。FDH5 来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶(来自Martina Pohl的礼物，杜塞尔多夫大学，德国)。GDH-BM :D_ 葡萄糖脱氢酶 001 (可从 JUlich Chiral Solutions 购得，现在为 Codexis, #22. 10,30IE/ml)。GDH-BS :D_ 葡萄糖脱氢酶 002 (可从 JUlich Chiral Solutions 购得，现在为 Codexis, #29. 10，500IE/ml)。酶的特性表1 醇脱氢酶
权利要求
仲醇对映异构体混合物的酶去消旋方法，该方法通过借助立体选择性醇脱氢酶及其辅因子的氧化和还原反应的结合进行，其中光学活性仲醇中的一种对映异构体形式上选择性地被氧化成相应的酮，其随后选择性地被还原成光学对映体，同时为通过附加酶的还原反应提供了还原形式的辅因子，其特征在于使用了两种具有相反立体选择性和不同辅因子选择性的醇脱氢酶以及两种相应的不同辅因子，用于氧化和还原反应，并且用附加酶在平行的酶反应中将氧化的和还原的辅因子互变，通过两种醇脱氢酶的选择或使用附加酶对两种辅因子的选择性差异可以控制去消旋的方向朝向两种对映异构体之一。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所用的醇脱氢酶是细菌的醇脱氢酶。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所用的醇脱氢酶是来自芽孢杆菌属、假单胞 菌属、棒状杆菌属、红球菌属、乳杆菌属或热厌氧菌属的醇脱氢酶。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于所用的醇脱氢酶是来自酵母菌株的酶。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于所用的醇脱氢酶是来自曲霉属、假丝酵母属、毕 赤酵母属或糖酵母属的醇脱氢酶。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其特征在于以1 1的活性比来使用所述两种 醇脱氢酶。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于以IIE的总量来使用所述两种醇脱氢酶。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于以至少2mmol/l的浓度来使用外消旋仲醇。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所用的附加酶是葡萄糖脱氢酶，葡萄 糖6-磷酸脱氢酶，甲酸脱氢酶或核苷酸转氢酶。
10.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于以2IE的量来使用所述附加酶。
11.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于以每mol仲醇至少0.3mol的量来使 用所述附加酶的底物。
12.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于以催化量来使用所述辅因子。
13.根据权利要求9的方法，其特征在于以2至3mol%的量来使用所述辅因子，基于仲
14.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于使用了选自水、水和一种或多种有机 溶剂的单相或多相混合物以及离子液体的溶剂。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于所用的溶剂是含水缓冲体系。
全文摘要
本发明涉及仲醇对映异构体混合物的酶去消旋方法，该方法通过借助立体选择性醇脱氢酶及其辅因子的氧化和还原反应的结合进行，其中旋光活性仲醇中的一种对映异构体形式上选择性地被氧化成相应的酮，其随后选择性地被还原成光学对映体，同时为通过附加酶的还原反应提供了还原形式的辅因子，其特征在于使用了两种具有相反立体选择性和不同辅因子选择性的醇脱氢酶以及两种相应的不同辅因子，用于氧化和还原反应，并且用附加酶在平行的酶反应中将氧化的和还原的辅因子互变，通过两种醇脱氢酶的选择或使用附加酶对两种辅因子的选择性差异可以控制去消旋的方向朝向两种对映异构体之一。
文档编号C12P7/02GK101981197SQ200980111538
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月26日 优先权日2008年4月1日
发明者C·格鲁贝尔, C·沃斯, J·普费弗, U·丁格迪森, W·克劳蒂尔 申请人:赢创德固赛有限责任公司