专利名称：具有提高的稳定性的经修饰的β-糖苷酶的制作方法
技术领域：
该发明涉及经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei) β -糖苷酶。本发明更具体地涉及具有提高的稳定性的经修饰的里氏木霉β-糖苷酶。本发明还涉及包含编码经修饰的糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体、用于从宿主菌株中生产经修饰的糖苷酶的方法，以及经修饰的糖苷酶用于水解纤维素和化合物生产(如用于医药和食品工业中的那些化合物)的用途。
背景技术：
β -糖苷酶包括糖基水解酶家族1和3的成员，所述成员的基本酶功能是水解纤维二糖或可溶性纤维糊精中连接糖残基的糖苷键。一些糖苷酶对纤维二糖或芳基糖苷是特异的，这些被表征的糖苷酶中的大部分具有较宽的特异性并且可以水解多种底物(Bhatia et al，2002)。在一些条件下，这些酶还可以通过逆反应或通过转糖基作用催化糖苷键的合成(Sirmott，1990)。该类酶的水解和合成能力可用于生物技术应用。β -糖苷酶的水解活性的一个主要应用是减轻纤维素酶系统的产物抑制。纤维二糖——纤维素水解的主要产物——强烈地抑制纤维二糖水解酶(EC 3. 2. 1. 91)的活性。加入足量的糖苷酶以水解纤维二糖成为葡萄糖，葡萄糖抑制性减弱，使得在较高程度的底物转化基础上获得显著的活性增长(US 6，015，703)。Mmtia等Q002)已经综述了 β -糖苷酶的很多其他生物技术应用。依赖于其水解活性的应用实例包括医药上重要的化合物从类黄酮和异类黄酮(isoflavanoid)糖苷中释放，和果汁和酒中芳香化合物的释放(US 6，087，131)。合成活性的典型用途是生产用作去污剂的烷基-糖苷(Ducret et al.，2002)。糖基水解酶——包括β -糖苷酶——的活性依赖于所述酶的活性位点中催化氨基酸(谷氨酸或天冬氨酸)具体的质子化状态，所述状态受到PH影响。例如，来自里氏木霉的β -糖苷酶I在5. 0-5. 5的ρΗ范围内最活跃，但在更酸性或者更碱性的条件下活性急剧下降(Woodward and Arnold，1981)。蛋白质活性和稳定性的ρΗ依赖性不一定有关系。酸性或碱性条件的去稳定作用是由于氨基酸侧链的质子化或去质子化，所述氨基酸侧链可能不是催化性的或者甚至不在活性位点附近。PH依赖的变性主要是由于天然和变性状态下特定氨基酸侧链的不同？1值， 这将PH依赖性引入状态间的自由能差异。此外，蛋白质在极端ρΗ下可以变得高度荷电并且分子间静电排斥增强(Fersht，1998)。ρΗ最适值改变的工程酶在新的ρΗ下不一定能长时间稳定。已使一些糖苷水解酶发生突变以改变它们在对工业应用重要的PH值下的活性或稳定性。对于淀粉加工应用，对来自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的α -淀粉酶进行工程改造以包括两个氨基酸替换，Μ15Τ和W88S，这将其低pH(5J)活性增加至野生型的140% (美国专利No. 5，958，739)。第三个突变H133Y的加入进一步将活性增加至所述双突变体的150% 以上。由合理设计方法鉴定到，杆菌内切葡聚糖酶中一个环的替换将其PH最适值转变以用于纺织品应用。用Ala-Gly-Ala替换，pH最适值上移了超过1个pH单位(美国公开文本No. 2005/0287656)。另外一个实例是将氨基酸替换A162P和W62E纳入特异腐质霉 (Humicola insolens)的Cel45内切葡聚糖酶。这些突变将碱性条件(pH 10)下的活性增加至野生型的lM-144% (美国专利No. 5，792，641)。最后一个实例，通过加入替换N10H、 N11D、Y27M和N29L的多种组合显著提高了重组木霉木聚糖酶在超过5. 5的pH下的活性(US 5，866，408)。很少有经工程改造的β -糖苷酶的报道，尽管有调整这些酶的性质的诱变的报道。例如，曲霉属(Aspergillus) β-糖苷酶四倍突变体A16T/G142S/H226Q/D703G的热稳定性增加，从而使得它在65°C下孵育1小时后保持其活性的约50%而野生型变体仅能保持0-5%。该酶的构建使用了随机诱变、位点饱和和改组(shuffling)的结合(美国公开文本No. 2004/01；3401)。里氏木霉β-糖苷酶I的位点43、101、260和Μ3中一个或多个位点的氨基酸置换产生了具有增加的催化效能的经修饰糖苷酶(美国临时申请 No. 61/182，27 。发现以下突变对于增加里氏木霉β _糖苷酶I的催化效能特别有利 V43I、V43C、V101A、V101G、F260I、F260V、F260Q、F260D、I543N、I543W、I543A、I543S、I543G 和 I543L。还注意到具有改变的pH稳定性特征的酶不一定需要具有改变的pH最适值来适于利用。例如，用于表达酶的细胞培养物的PH可不同于所述酶在其作为生物催化剂的应用中的预期工作PH。如果所述酶的稳定性在所述表达pH下被损害，酶活性的总收率将会下降。这已在用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的里氏木霉β _糖苷酶中观察到(Cummings and Fowler, 1996) 0观察到无缓冲剂的表达培养基随着时间变得更酸，从 PH 6. 0降至2. 0-3. 0 ；该pH下降与β -糖苷酶活性的急剧下降相关。由混合所述细胞培养物引起的水力剪切使不稳定进一步加重，特别是由充气引起的气-液界面存在的情况下(Weijers and Van' t Riet, 1992 ；Elias and Joshi, 1998) 通过生产后加工过程——如超滤——中或者其最终应用中存在的剪切应力可进一步灭活一些酶。糖基水解酶的剪切灭活在以下文献中已有记录Jones和Lee(1988)描述了在包含高速叶轮的反应器系统中里氏木霉纤维素酶混合物的灭活，但仅在空气存在的情况下； Sachse等人(1990)报道称与常规搅拌反应器相比在低剪切搅拌反应器中生产的里氏木霉纤维素酶有较高的比活；Reese (1980)也报道通过在水解中摇动灭活里氏木霉纤维素酶， 并且观察到通过使用表面活性剂可改善所述作用；最后，Gimjikar等人Q001)报道了外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β -糖苷酶在混合式反应器中的灭活，灭活的严重程度与使用的混合能成比例。
发明内容
本发明涉及经修饰的里氏木霉β -糖苷酶。本发明更具体地涉及具有提高的稳定性的经修饰的里氏木霉β-糖苷酶。本发明的一个目的是提供具有提高的稳定性的糖苷酶的变体。本发明提供在低pH、低pH和强烈搅动、低pH和强烈搅动或者低pH和高温的水性溶液中具有提高的稳定性的修饰糖苷酶。本发明的糖苷酶可用于需要在低PH和高度充气或强烈搅动的条件下(如微生物发酵中)或者低PH和高温条件下(如通过酶水解有纤维素原料来生产可发酵糖)保持活性的工业方法中。本发明具体地涉及通过在所述β-糖苷酶I或1TrCe 13A序列(SEQID NO 1)的66、 72、101、235、248、369和386位点中的一个或多个位点进行氨基酸置换来生产经修饰的里氏木霉β-糖苷酶。发明人发现对这些位点中的一个或多个位点处的天然氨基酸的置换使得所述β -糖苷酶在低ΡΗ、低ρΗ和高温、低ρΗ和强烈搅动或低ρΗ和高度充气的水性溶液中的稳定性提高至少2倍，例如约2倍至约500倍。所述经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶可衍生自亲本TrCel3Ai3 -糖苷酶，所述亲本扑(^134 0-糖苷酶除了对66、72、101、235、对8、369和386位点中一个或多个位点处天然氨基酸的置换之外，在其他方面与所述经修饰的TrCel3Ai3-糖苷酶相同。此外，所述经修饰的TrCel3A0 -糖苷酶可包含除66、72、101、235、M8、369和386位点之外的位点处的额外氨基酸置换，前提是这些额外的氨基酸置换也存在于相应的亲本TrCel3A中。所述经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶可包含在43、96、260和543位点中一个或多个位点处的额外氨基酸置换。本发明的所述经修饰的TrCel3A β -糖苷酶表现出与SEQ ID NO 1的天然1TrCe 13Α 约80%至约99. 9%的氨基酸序列同一性。例如，所述经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶表现出与SEQ ID NO :1的天然TrCel3A约90%至99. 9%的氨基酸同一性，或与SEQ ID N0:1的天然TrCe 13A约95%至99. 9%的氨基酸同一性。此外，如上定义的经修饰的TrCel3Ai3-糖苷酶在以下条件的水性溶液中表现出稳定性提高至少2倍，例如提高约2倍至约500倍，所述条件为(a)约ρΗ 2至约4. 5 ； (b) 约ρΗ 2至约4. 5，以约0. 1至约100cm/s或约0. 5至5vvm的表观气速(superficial gas velocity)充气；(c)约ρΗ 2至约4. 5，并且通过以约300至约IOOOrpm的摇动来搅动；(d) 约PH 2至约4. 5，并且通过以约0. 5至约lOm/s的外缘速度通过叶轮搅拌来搅动；(e)约ρΗ 2至约4. 5，在以约0. 2至约15hp/100加仑搅动的生物反应器中；或(f)约ρΗ 2至约4. 5， 温度为30°C至60°C。本发明还涉及选自以下的经修饰的TrCel3A TrCel3A-V66I(SEQ ID NO 2)；TrCe13A-S72N(SEQ ID NO 3)；TrCel3A-V101M(SEQ ID NO 5)；TrCel3A-T235S(SEQ ID NO 6)；TrCe13A-N248K(SEQ ID NO 7)；TrCe13A-N369K(SEQ ID NO 8)；TrCel3A-A386T(SEQ ID NO 9)；TrCel3A-V66I-S72N(SEQ ID NO :10)；TrCel3A-S72N-F96L-V101M(SEQ ID NO :11)；TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K(SEQ ID NO :12)；TrCel3A-S72N-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :13)；TrCel3A-V66I-S72N-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :14)；TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :15)；
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TrCel3A-V66I-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :16)；TrCel3A-S72E-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :4)；禾口TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369P-A386T(SEQ ID NO :55).本发明还涉及到指导所述经修饰TrCel3A从宿主微生物中表达和分泌的基因构建体，所述宿主微生物包括但不局限于里氏木霉菌株。本发明的基因构建体包含编码经修饰的TrCel3A的核酸序列，所述经修饰的 TrCel3A 与 SEQ ID NO :1 具有约 80%至约 99. 9% 同一性，并且包含在 66、72、101、235、248、 369和386位点中一个或多个位点处的氨基酸置换，所述氨基酸序列有效连接至调节其从宿主微生物中表达和分泌的核酸序列。例如，调节所述经修饰的TrCel3Ai3 -核苷酶的表达和分泌的核酸序列可来自用于表达所述经修饰的TrCel3Ai3-核苷酶的宿主微生物。所述宿主细胞可以是酵母，如酿酒酵母，或者是丝状真菌，如里氏木霉。本发明还涉及到如上定义的基因构建体，其中由所述基因构建体编码的所述经修饰的TrCe 13A β -糖苷酶还包含除在66、72、101、235、Μ8、369和386位点之外的位点处的氨基酸置换。由所述基因构建体编码的所述经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶可包含在43、96、 260和543位点中一个或多个位点处的氨基酸置换。本发明还涉及到包含基因构建体的基因修饰微生物，所述基因构建体编码所述经修饰的TrCel3A β -糖苷酶，所述基因修饰微生物能够表达和分泌经修饰的TrCel3A β -糖苷酶，所述修饰的iTrCe 13Α β-糖苷酶表现出与SEQ ID NO :1具有约80%至约99. 9%的氨基酸序列同一性并且包含在66、72、101、235、Μ8、369和386位点中一个或多个位点处的氨基酸置换。所述基因修饰的微生物能够表达和分泌经修饰的TrCel3A β-糖苷酶，所述 1^^13々0-糖苷酶还包含除在66、72、101、235、对8、369和386位点之外的位点处的额外氨基酸置换。由所述基因修饰微生物表达和分泌的所述经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶可包含在43、96、260和543位点中一个或多个位点处的额外氨基酸置换。所述基因修饰微生物可以是酵母或丝状真菌。例如，所述基因修饰的微生物可以是酵母属(Saccharomyces)、 毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)、肉座菌属 (Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)或链孢霉属(Neurospora)的禾中。本发明还涉及如上所定义的经修饰的TrCel3Ai3-糖苷酶在水解反应中的用途， 所述水解反应包括纤维素底物和包含所述经修饰的TrCel3Ai3-糖苷酶的纤维素酶混合物。本发明还涉及生产如上定义的经修饰的TrCel3Ai3-糖苷酶的方法，包括用基因构建体转化酵母或真菌宿主，所述基因构建体包含编码所述经修饰的TrCel3A β-糖苷酶的核酸序列；选择表达所述经修饰的TrCel3A β-糖苷酶的重组酵母或真菌菌株；在诱导所述经修饰的TrCel3Ai3-糖苷酶表达的条件下通过深层液体发酵培养所选择的重组菌株； 并通过分离培养物滤出液和宿主微生物回收所述经修饰的TrCel3A β-糖苷酶。本发明的经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶可用于需要在低pH、低pH和高度充气的结合、低PH和强烈搅动的结合或者在pH和高温的结合下的稳定性的工业中的各种应用。例如，如本文描述的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶可用于将木质纤维素底物转变为可发酵糖以生产乙醇或其他产物的工业方法或微生物发酵方法中。
图1描绘了指导由重组酿酒酵母表达和分泌天然和经修饰的TrCel3A的质粒载体 YEp352/PGK91-l/α ss6H_TrCel3A。图2描绘了指导由重组里氏木霉表达和分泌经修饰的TrCel3A的质粒载体pc/ xCel3A-AT003-pyr4o图3示出了野生型I~rCe13A的灭活为pH和温度的函数。(A)在30°C或50°C下，轻微摇动OOOrpm)的pH 3. 0、4. 0或5. 0的水性溶液中残余β -糖苷酶活性对孵育时间的图。 (B)在30°C和pH 3. 0或pH 5. O的水性溶液中残余β -糖苷酶活性对孵育时间的图所述水性溶液在无挡板烧瓶(imbaffled flask)中轻微摇动QOOrpm)；在有挡板烧瓶(baffled flask)中以200rpm摇动(“摇动”)；或者在无挡板烧瓶中机械搅拌(“搅拌”)。图4为分别在pH 3. 5和pH5. O下预孵育后的残余酶活性的散点图。所述数据涉及对包含亲本和经修饰的TrCel3A β -糖苷酶的96孔培养板的筛选。所述亲本TrCel3A数据通过线性回归拟合，其中使得y轴截距固定为零。图5示出了在pH 3. O和30°C下，在有挡板烧瓶中以400rpm摇动O至30小时的亲本和经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶的灭活。这些测定中TrCel3A的浓度为4. 8-10. 8 μ g/ mL，并且如实施例1中所述测量每个时间间隔的残余活性。图6是灭活常量τ (单位为tO对亲本和经修饰的TrCel3A β -糖苷酶的残余活性的图。将野生型的活性设定为1.0并将所有的变体相对于该值进行比较。数据代表三次平行试验的平均值，单个测定的拟48Κ除外，并且误差棒代表+/-1个标准偏差。图7描绘了在pH 3.0和301下，在有挡板烧瓶中以400印111摇动0至100小时的亲本和经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶的灭活。这些测定中的TrCel3A的浓度为4. 8-10. 8 μ g/ mL，并且如实施例1中所述测量每个时间间隔的残余活性。图8描绘了在pH 3. O和30°C下，在有挡板烧瓶中以400rpm摇动O至300小时的经修饰的 (:θ13Αβ -糖苷酶的灭活。这些测定中的I~rCe13A的浓度为4. 8-10. 8 μ g/mL,并且如实施例1中所述测量每个时间间隔的残余活性。图9描述了亲本和经修饰的TrCel3Ai3-糖苷酶的相对稳定性。将在纤维素酶混合物中所述亲本TrCel3A和聚集体经修饰的TrCel3A-ATOO3 0 -糖苷酶(aggregate modified TrCel3A-AT003 beta-glucosidase)的纤维二糖酶比活(在pH 5. 0下测量)表示为比率， 所述纤维素酶混合物是在PH 3.0或pH 5.0下并且在下进行165个小时的试验性里氏木霉发酵中产生的。1.0的比率表明β-糖苷酶在pH 3.0和pH 5.0下同样稳定；较低的值表明相对于PH 5.0在pH 3.0下的稳定性降低。误差棒代表一个标准偏差。图10描绘了亲本和经修饰的β -糖苷酶在可用于纤维素水解的条件下的稳定性。 在pH 3. 0、3. 5、4. 0或5. 0下，在50或60°C下孵育纤维素酶混合物中的亲本和经修饰的 β-糖苷酶。在所示时间从酶中取出样本并在pNPfese分析中进行测试。将一阶指数式衰减模型拟合至所述数据以确定每种酶在每组条件下的平均寿命。将所有数据标准化为由所述模型确定的初始活性的最佳拟合值，并且相对于此最初活性绘制灭活曲线。图11显示了包括TrCel3A——一个家族3 β -糖苷酶共有序列——在内的45个真菌家族3 β -糖苷酶的氨基酸序列比对，以及每个氨基酸序列对TrCel3A的氨基酸序列的序列同一性百分数。在所比对的序列下面示出了在45个真菌家族3β-糖苷酶之中，图11的家族3 β-糖苷酶共有序列的每个位点处氨基酸出现频率的代表图。
具体实施例方式本发明涉及经修饰的β -糖苷酶。本发明更具体地涉及在低ρΗ、低ρΗ和高度充气、 低PH和强烈搅动或者低ρΗ和高温的水性溶液中具有提高的稳定性的经修饰的里氏木霉 β -糖苷酶I (下文称为TrCel3A)，所述提高的稳定性是相对于作为其来源的亲本TrCel3A 来说的。本发明还涉及到包含编码经修饰的TrCel3A的核苷酸序列的基因构建体、从宿主菌株中生产所述经修饰的TrCel3A的方法和所述经修饰的TrCel3A用于减轻纤维素水解中对纤维素酶的产物抑制的用途。本发明还涉及到所述经修饰的TrCel3A用于催化其他化合物的生产的用途，所述化合物包括但不局限于来自医药或食物工业的化合物，所述生产是通过水解、逆水解或转糖基作用完成。以下说明是仅通过举例方式的优选实施方案并且不局限于实现本发明所必需的特征的结合。经修饰的β-糖苷酶术语“ β -糖苷酶”是指归类至EC3. 2. 1. 21并且在氧亲核体之间转移糖基基团(通常导致芳基-β -糖苷、氨基-β -糖苷、烷基-β -糖苷、生氰糖苷、短链寡糖和二糖中连接糖类残基的糖苷键水解)的酶。在包含超过2个糖苷的寡糖中，β-糖苷酶的活性随着链长的增加而下降。糖苷酶通过双取代反应水解β-1，4-糖苷键，导致端基异构构型的净保留。两个酸性氨基酸——天冬氨酸(D)和/或谷氨酸(E)直接参与底物催化。这些残基中的一个起亲核体的作用并且形成酶-糖基中间体。另外一个酸性残基作为酸碱催化剂起作用。在其氨基酸序列以SEQ ID NO :1表示的所述里氏木霉β-糖苷酶1(下文称为TrCel3A)中，在位点236处的天冬酰胺作为亲核体而位点447处的谷氨酰胺是酸碱催化剂。β-糖苷酶是属于糖基水解酶(GH)家族1和3的β-糖苷酶的亚类，使用 Henrissat 和合作者开发的分类系统(Henrissat, B. (1991) ；Henrissat, B. and Bairoch, Α. (1996))。目前使用该分类系统已经鉴定出了 115个GH家族，这登记在糖类活性酶 (Carbohydrate Active Enzyme, CAZy)数据库中(参见 URL :http //afmb. cnrs-mrs. fr/ CAZY/index. html用于参考)。家族1包含来自古细菌、植物和动物的β-糖苷酶。来自一些细菌、霉菌和酵母的糖苷酶属于家族3。就本发明的目的而言，“β_糖苷酶”因此定义为被分类至EC 3.2. 1.21中并且被归类为CAZy系统的家族3糖基水解酶的任何蛋白质。β -D-葡聚糖外切水解酶——一个家族3糖基水解酶——的三维结构由Varghese 等(1999)描述。所述结构为两结构域球状蛋白，包含N-末端(α/β)8ΤΙΜ-筒结构域和 C-末端6-链β-夹层，所述C-末端6-链β-夹层包含5条平行β链和一条反平行β链的β片层，并且在所述片层的任一侧有3个α-螺旋。该结构很可能与其他家族3酶所共有。如图11所示，家族3β-糖苷酶的一级氨基酸序列显示出高度相似性。45个家族 3 β -糖苷酶氨基酸序列之间的多重对比显示，大部分天然存在的真菌起源的家族3 β -糖苷酶显示出与TrCel3A的氨基酸序列的约40%至约100%的氨基酸同一性(图11)。特别是在家族3β-糖苷酶内有一些具有高度氨基酸序列保守的区域，包括，例如氨基酸225-256 和439-459，分别包含催化氨基酸D236和Ε447。“TrCel3A”是指由SEQ ID NO 1中氨基酸序列限定的由里氏木霉产生的家族3糖基水解酶。TrCel3A还被称作里氏木霉β-糖苷酶或BGL1。“天然”或“野生型” TrCel3A是指没有任何氨基酸置换的SEQ ID N0:1的TrCel3A。“经修饰的TrCel3A”是指包含一个或多个氨基酸置换的TrCel3A，所述氨基酸置换是由基因工程技术引入，选自V66X (即位点66 的Val由任意氨基酸乂置换)、572乂、￥10议、12；35乂、拟48乂、吧69乂、4386乂。用于改变氨基酸序列的基因工程技术包括但不局限于定点诱变、盒式诱变、随机诱变、合成寡核苷酸构建、 克隆和本领域技术人员可知的其他基因工程技术(Eijsink VG, et al. 2005)。应理解，经修饰的I~rCe13A可来自于野生型I~rCe13A或来自已经包含其他氨基酸置换的TrCel3A。本发明的经修饰的TrCel3A β -糖苷酶包括那些在以下位点包含氨基酸置换的TrCel3A β -糖苷酶在 V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X 和 A386X 的任一位点；在 V66X、S72X、V101X、 T235X, N248X、N369X 和 A386X 的任意两个位点；在 V66X、S72X、V101X、T235X, N248X、N369X 和A386X的任意三个位点；在V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、N369X和A386X的任意四个位点；在 V66X、S72X、V101X、T2;35X、N248X、N369X 和 A386X 的任意五个位点；在 V66X、S72X、 V101X、T235X, N248X、N369X 和 A386X 的任意六个位点；或者在 V66X、S72X、V101X、T235X, N248X、N369X和A386X的所有七个位点。应理解，所述经修饰的TrCe 13A β -糖苷酶可以来自野生型TrCe 13Α β -糖苷酶或来自于包含其他氨基酸置换的TrCe 13Α β -糖苷酶。例如，所述经修饰的TrCe 13Α β -糖苷酶可包含在43、96、260和543位点中一个或多个位点处的氨基酸置换。或者，在生产包含在 66、72、101、235、248、369和386位点中一个或多个位点处的突变的经修饰的iTrCe 13Α β -糖苷酶之后，随后进一步对它进行修饰以包含额外的氨基酸置换，所述额外的氨基酸置换包括但不局限于上述那些。关于经修饰的TrCel3A β -糖苷酶氨基酸序列，本文使用的“来源自，，是指使用针对相应亲本TrCel3Ai3 -糖苷酶的遗传材料或核酸或氨基酸序列信息分离编码所需经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶的目的核酸序列元件。如本领域技术人员所知的，这样的材料或序列信息可用于通过使用一种或多种分子生物学技术产生编码所需经修饰的TrCel3A β-糖苷酶的核酸序列，所述分子生物学技术包括但不局限于克隆、亚克隆、通过PCR扩增、体外合成等。在本发明的第一个实施方案中，如上所定义的经修饰的TrCel3A显示出与SEQ ID NO 1约80%至约99. 9%的氨基酸序列同一性，或者其间的任意量的同一性。例如，所述经修饰的iTrCe 13A可显示出与SEQ ID NO 1约90%至约99. 9%的氨基酸序列同一性或与SEQ IDNO 1约95%至约99. 9%的氨基酸序列同一性。比对氨基酸序列的方法为本领域技术人员所熟知并且包括可用于对比两个序列的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, 参见 URL blast, ncbi. nlm. nihh. gov/Blast. cgi ；Altschul et al. , J. MoI. Biol. 215 403-410，1990)和用于对比两个或多个序列的CLUSTALW(参见URL :ebi. ac. uk/Tools/ clustalw2/index. html)。序列同一性还可通过人工对比和肉眼检查来确定。在本发明的其他实施方案中，所述经修饰的TrCel3A表现出与SEQ ID N0:1约 80%至约99. 9%的氨基酸序列同一性，和在以下条件的水性溶液中具有至少2倍的稳定性提高，所述条件为(a)约pH 2至约4. 5 ； (b)约pH 2至约4. 5，以约0. 1至约lOOcm/s的表观气速充气；或(c)约pH 2至约4. 5，并且通过以约300至IOOOrpm的摇动来搅动；(d)约 PH 2至约4. 5，并且通过以约0. 5至约lOm/s的外缘速度通过叶轮搅拌来搅动；(e)约pH 2 至约4. 5，在以约0. 2至约15hp/100加仑搅动的生物反应器中；或(f)约pH 2至约4. 5，温度为30°C至60°C。“亲本iTrCe 13A”是指不包含对其66、72、101、235、M8、369或386位点处原始氨基酸的一个或多个置换并且在其他方面与所述经修饰的TrCel3A相同的TrCel3A。这样，所述亲本TrCel3A可包含在多至116个(即582个氨基酸的20% )其他位点处的氨基酸置换， 所述氨基酸置换可由基因工程或其他技术引入。例如，所述亲本TrCel3A可包含在43、96、 260和543位点中一个或多个位点处的氨基酸置换。为了帮助本领域技术人员注意到可以在其处制造氨基酸置换(非V66X、S72X、 V101X,T235X,N248X,N369X和A386X)并且产生活性β -糖苷酶的TrCel3A β -糖苷酶的那些氨基酸位点，在图11中提供了对来自真菌来源的45个家族3 β -糖苷酶与由以最高频率天然出现在每个位点处的氨基酸组成的β -糖苷酶共有序列的比对，以及显示所述共有序列的每个氨基酸在每个位点出现频率的图。使用图11提供的信息，本领域技术人员将识别出对其他家族3 β -糖苷酶低序列保守性的区域。这样的区域的非限制性实例包括，例如位点1-20、303-323和403-414之间的区域，和这些区域中选出的氨基酸位点。如本文所更详细地描述的，已经制备了一些在低PH和搅动的条件下表现出稳定性增加的经修饰的TrCel3Ai3 -糖苷酶。不应被认为以任何方式限制的一些突变体的表在表1中示出。表1 具有增加的稳定性的TrCel3A β -糖苷酶
新突变体TrCe:L6A-S413PSEQ ID NO
TrCel3A-V66I2
TrCel3A-S72N3
TrCel3A-VlOlM5
TrCel3A-T235S6
TrCel3A-N248K7
TrCel3A-N369K8
TrCel3A-A386T9
TrCel3A-V66I-S72N10
TrCel3A-S72N-F96L-VlOlMΠ
权利要求
1.一种经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei) TrCel3A β -糖苷酶，包含选自V66X、 S72X、V101X、Τ235Χ、Ν248Χ、Ν369Χ和Α386Χ的一个或多个氨基酸置换，其中所述经修饰的 TrCel3Ai3-糖苷酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO :1具有约80%至约99. 9%同一性的序列。
2.一种经修饰的里氏木霉！"rCelSA^-糖苷酶，包含选自V66I、S72E、S72N、F96L、 V101M、T235S、N248K、N369K、N369P和A386T的一个或多个氨基酸置换，其中所述经修饰的 TrCel3Ai3-糖苷酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO :1具有约80%至约99. 9%同一性的序列。
3.权利要求1或2任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶，其中所述经修饰的 TrCel3Ai3-糖苷酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO :1具有约90%至约99. 9%同一性的序列。
4.权利要求3的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶，包含与SEQ ID NO=I具有约 95%至约99. 9%同一性的序列。
5.权利要求1至4任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶，其中当在约pH2.0 至约pH 4. 5的水性溶液中孵育时，所述经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3 -糖苷酶与作为其来源的亲本里氏木霉TrCel3Ai3 -糖苷酶相比表现出至少2倍的稳定性提高。
6.权利要求1至5任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶，其中当在约pH2.0 至约pH 4. 5的水性溶液中孵育时，所述经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3 -糖苷酶与作为其来源的亲本里氏木霉TrCel3Ai3 -糖苷酶相比表现出约2倍至约500倍的稳定性增加。
7.权利要求1或2的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶，还包含选自V43X、F96X、 F260X和I543X的一个或多个氨基酸置换。
8.权利要求7的经修饰的里氏木霉I~rCe13Ai3-糖苷酶，还包含选自V43I、V43C、F96L、 V101A、V101G、F260I、F260V、F260Q、F260D、I543N、I543W、I543A、I543S、I543G和 I543L 的一个或多个氨基酸置换。
9.权利要求5或6的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶，其中对所述水性溶液以约 0. 1至约100cm/s的表观气速充气、通过在约300至约IOOOrpm下摇动来搅动或以约0. 5至约10m/S的外缘速度通过叶轮来搅拌。
10.权利要求5的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶，其中对所述水性溶液以约 0. 5至约5vvm的表观气速充气，或者在生物反应器中以约0. 2至约15hp/100加仑搅动。
11.权利要求1或2的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶，其中当在PH为约 2. 0至约4. 5且温度为约30°C至约60°C的水性溶液中孵育时，所述经修饰的里氏木霉 TrCe 13A β -糖苷酶与作为其来源的亲本里氏木霉TrCel3A β -糖苷酶相比表现出至少2倍的稳定性提高。
12.—种分离的基因构建体，包含编码权利要求1至11任一项的经修饰的里氏木霉 TrCe 13Α β -糖苷酶的核酸序列。
13.权利要求12的分离的基因构建体，还包含指导所述经修饰的里氏木霉 TrCel3A^-糖苷酶表达和分泌的调节核酸序列。
14.一种分离的经基因修饰的微生物，包含权利要求12或13所述的基因构建体。
15.权利要求14的分离的经基因修饰的微生物，其中所述微生物是酵母或丝状真菌的种。
16.权利要求15的分离的经基因修饰的微生物，其中所述微生物是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)或里氏木毒(Trichoderma reesei) 0
17.一种用于生产经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶的方法，包括以下步骤在诱导所述经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3 -糖苷酶表达和分泌的条件下培养权利要求14的经基因修饰的微生物，并且从所述培养基中回收所述经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3 -糖苷酶。
18.权利要求17的方法，其中所述培养步骤是在约2.O至约4. 5的pH、约0. 1至约 100cm/s的表观气速和约0. 5至lOm/s的叶轮外缘速度下进行。
19.权利要求17的方法，其中所述培养步骤是在约3.O至约4. 5的pH、约0. 5至约5vvm 的表观气速和约0. 2至15hp/100加仑的搅动下进行。
20.一种用于水解纤维素底物的方法，包括将所述底物与纤维素酶混合物接触，所述纤维素酶混合物包含权利要求1至11任一项的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3 -糖苷酶。
21.权利要求20的方法，其中所述纤维素底物是经预处理的木质纤维素原料。
22.权利要求21的方法，其中将所述经预处理的木质纤维素原料在约3.O至7. 5的pH 和约45°C至75°C的温度下与所述纤维素酶混合物接触约12小时至200小时。
23.一种用于生产里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶的方法，包含以下步骤(i)用如权利要求12定义的基因构建体转化真菌宿主细胞以生产重组真菌菌株；(ii)选择表达所述经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶的重组真菌菌株；并且(iii)在诱导所述经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3 -糖苷酶表达的条件下通过深层液体发酵培养所选择的重组菌株。
24.一种选自以下的经修饰的里氏木霉TrCel3Ai3-糖苷酶 TrCel3A-V66I(SEQ ID NO 2)；TrCe13A-S72N(SEQ ID NO 3)；TrCel3A-V101M(SEQ ID NO 5)；TrCel3A-T235S(SEQ ID NO 6)；TrCe13A-N248K(SEQ ID NO 7)；TrCe13A-N369K(SEQ ID NO 8)；TrCel3A-A386T(SEQ ID NO 9)；TrCel3A-V66I-S72N(SEQ ID NO :10)；TrCel3A-S72N-F96L-V101M(SEQ ID NO :11)；TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K(SEQ ID NO :12)；TrCel3A-S72N-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :13)；TrCel3A-V66I-S72N-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :14)；TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :15)；TrCel3A-V66I-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO :16)；TrCel3A-S72E-F96L-V101M-N369K-A386T(SEQ ID NO 4)；禾口TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369P-A386T(SEQ ID NO :55)。
全文摘要
本发明提供源自里氏木霉TrCel3Aβ-糖苷酶的经修饰的β-糖苷酶，所述修饰的β-糖苷酶在低pH、低pH和高度充气、低pH和强烈搅动或者在低pH和高温的条件下具有提高的稳定性。本发明还提供了包含编码经修饰的β-糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体，用于从宿主菌株中经经生产修饰的β-糖苷酶的方法和所述修饰的β-糖苷酶用于水解纤维素的用途。
文档编号C12N15/56GK102482656SQ200980143477
公开日2012年5月30日 申请日期2009年8月28日 优先权日2008年8月29日
发明者C·希尔, J·托马斯黑克, J·拉维尼, M·惠赛尔 申请人:埃欧金能源公司