专利名称：一种微量hpv快速基因分型方法
技术领域：
本发明涉及一种微量HPV快速基因分型方法。
背景技术：
宫颈癌是女性生殖道发病率和病死率最高的恶性肿瘤，全世界每年约有几十万妇 女死于子宫颈癌，为威胁妇女生命最严重的疾病。宫颈癌的发生发展是一个由渐变到突变 的过程，有计划地筛查，对于有效预防和早期治疗宫颈癌及其癌前病变非常关键。推广应用 先进的检测技术，对宫颈癌和癌前病变的早期诊治工作，保障广大妇女生殖健康，具有重大 的社会意义。而临床科学研究表明，人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是导致宫颈癌的直接原因。 HPV可分为高危型和低危型两种，不同的HPV亚型在致癌性方面存在很大的差别。至今发现 的HPV病毒约有120余种，至少有20种高危型HPV持续感染会引发子宫颈癌。所以提早诊 断HPV感染，尤其是对高危型HPV进行检验和分型极为重要，将有助于清除女性生殖道的持 续感染，防止其向宫颈癌演变以及早期发现宫颈癌，降低死亡率。在HPV疫苗尚未在中国人 群中大规模应用之前，实施实用、高效、准确的宫颈癌筛查，是最有效的预防和早期诊断宫 颈癌的途径。传统的筛查检测方法包括宫颈细胞学检查法、阴道镜法等，但这些方法漏检率高， 且不能识别高风险和低风险的HPV感染基因型。运用分子标记进行筛查可以避免形态学诊 断的主观性，提高宫颈细胞学诊断的准确性、一致性和可重复性，有助于早期识别HPV感染 相关性宫颈疾病并给予相应的干预措施，从而有效地阻断宫颈癌的发生。目前HPV的检测方法主要有PCR检测，最常用的就是MY09/11，GP05/06引物扩 ±曾，然后结合ELESA剂PCR反向点杂交，但后续的工作复杂，对实验技术要求高；组合靶基因 自动检测，运用基因芯片和电传感计数对HPV快速分型，但是成本较高；病理组织学结合原 位杂交技术，但是需要对组织进行分析，不适用于早期的筛查工作；杂交捕获DNA分析，但 是仅能检测有限的13种HPV，而且不能进行HPV分型；血液循环中的HPV DNA检测，其不足 之处在于检测阳性率不高，为20%左右，且在现行感染的女性中只有不到一半能在血清中 与宫颈标本中检测到相同亚型的HPV ；此外，Southern Blot是检测HPV感染的方法之一，但 是操作复杂，耗时久，不利于大规模筛查工作。目前常用的是PCR和杂交捕获二代的检测方 法，具体方法比较见表一。其中，杂交捕获检测敏感性高，特异性与细胞学筛查相比稍低，约 64.1% -95. 1%，中国医学科学院肿瘤研究所开展的一项宫颈癌多种筛查方法的比较研究， 得出HPV-DNA捕获法检测的灵敏度和特异度分别为95 %，和85 %，但不能具体区分高危型 和低危型的HPV亚型；以PCR检测灵敏度最高，且能够采用其它手段进行具体分型，分型广 谱，但存在特异性低的问题。表一不同检测方法比较 基于以上所述，尽管已有多种技术应用于HPV的检测，但开发一种简单、准确、重 复性好、适于规范化推广的检测多种微量HPV感染并鉴定其基因型别的方法迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种适用范围广、灵敏 度高、精确高效的微量HPV快速基因分型方法。本方法能准确鉴定HPV亚型，而且分辨率 高，不局限于仅有的13种高危型HPV检测，可以检测出32种型别(包括朋￥-16，18，31，33， 35,39,45,51,52,54,56 ；HPV-6,11，26，34，40，42，43，44，53，58，59，68 ；HPV-57，61，66，70， 72，73，81，82，83)，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的HPV基因型，有利于更为准确 的进行HPV筛查。本发明所采用的技术方案是本发明所采取的分型方法包括以下步骤(1)样本基因组提取；(2)采用三轮巢式PCR扩增HPV Ll保守区域；一轮引物 MY09/MY11 ；二轮引物 MY09/GP5+ ；三轮引物 GP5+/GP6+ ；其中上述引物的序列分别为MY09 5，CGTCCAAAAGGAAACTGATC 3，MYll 5’ GCACAGGGACATAACAATGG 3’GP5+ 5’ TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC 3’GP6+ 5，GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 3，；(3)电泳检测目的产物，判断有无HPV病毒感染；(4)若检测有HPV病毒感染，则对上述目的产物进行测序并分型；a 测序结果若无重叠峰，判定为单一 HPV感染；b 测序结果若出现重叠峰，判定为复合感染，并且将目的产物克隆后筛选阳性克 隆进行测序、分型，得到复合感染的HPV型别。本方法中还包括基因组质量鉴定的步骤，在三轮巢式PCR扩增之前采用 Beta-globin扩增检测所提取的基因组质量，根据扩增效率判断基因组的用量，以及HPV阳 性和阴性的判断。
上述基因组质量鉴定过程中Beta-globin扩增的引物序列如下PC04 5’ CAACTTCATCCACGTTCACC 3’GH20 5，GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 3，。 进一步，上述分型步骤中的三轮巢式PCR的反应体系为IXrTaq Buffer ； dNTP 各 0. 2 0. 4mM ； 1. 5 2. OmM Mg2+ ；引物各 0. 3 0. 5uM ； DNA 0. 5 Ing ；rTaq 1U/uL，加双蒸水至 15uL ；其中优选浓度 dNTP 各 0. 4mM ；1. 5mM Mg2+ ； 引物各0. 4uM。进一步，上述分型步骤中的三轮巢式PCR的反应条件为 本发明的有益效果是首先，以特异设计的巢式聚合酶链式反应(PCR)为基础的 检测方法是用PCR方法先进行目的基因的扩增，然后再用各种方法进行检测。目的基因扩 增是所有DNA分析技术中最灵活和灵敏的手段，所以目前认为以PCR为基础的检测方法是 进行HPV DNA检测及分型的最好方法，它可以应用于检测、病毒负荷定量、DNA测序和突变 分析，也可以进行多重扩增，同时分析多个DNA序列。本发明是一种建立在精确、高效的DNA 测序基础上的基因分型方法，该方法的特点在于采用了三轮巢式扩增HPV Ll保守区域，具 有比其他分型方法灵敏的优势，可以检测微量的HPV DNA ；本方法中基因组提取可以运用于 福尔马林浸泡组织等较难获得高质量的DNA的样本，对于血样和细胞则缩短了提取时间； 在经典的HPV分型方法上加以改进，提高了分型的灵敏性，又不损失原有分型的广谱型。对 广东和江西省195例CINII以上病例以及155例健康对照的HPV筛查结果显示病例中HPV 阳性191例，阴性4例；健康对照中HPV阳性30例，阴性125例。该方法筛查灵敏度、特异 度分别为97. 9%、80. 6%，显著提高了传统通用引物PCR法的特异度，同时灵敏度高于HC-2 检测方法，解决了现有分型方法检测范围小，对样本质量要求高，灵敏度低的问题，同时该 方法实验过程无需特殊仪器，成本低，方便大规模筛查。
具体实施例方式下面就具体实施例对本发明作进一步阐述一、基因组的提取
本方法应用于宫颈癌的早期筛查，适用范围广，可用于检测石蜡切片、福尔马林浸 泡组织、血样、脱落细胞等多种类型样本基因组的提取。1、福尔马林固定的组织块基因组制备A.取0. 01-0. 05g组织，磷酸缓冲液清洗3次；B.液氮中研磨，加入600 μ L裂解液 (裂解液配方10mmol/L Tris-HCl ；0. lmol/L EDTA ；0. 5% (M/V) SDS ；20ug/mg 无 DNase 的 胰 RNase ；PBS 溶液配方8g NaCl, 0. 2g KCl ；1. 44g Na2HPO4 ；0. 24g KH2PO4,800mL 水溶解， HCl调节pH至7. 4，加水定容1L)《分子克隆第二版》和4 μ L蛋白酶K (20mg/mL)，55°C消化过 夜；C. 600uL饱和酚抽提2次，取上层液，600uL氯仿异戊醇(24 1) (V/V)抽提一次，取上层 液；D. 0. 2倍体积的IOM乙酸铵，2倍体积的无水乙醇混合均勻，4°C沉淀过夜；E. 10，OOOrpm 离心20min，加入400uL75%乙醇洗涤，10，000离心；重复洗涤一次，离心；自然晾干后加入 pH8. OTE缓冲液溶解DNA。2、新鲜组织基因组制备A.取0. Olg左右组织；B.液氮中研磨，加入600 μ L裂解液和4μ L蛋白酶K。55°C 消化1小时；C. 600uL饱和酚抽提2次，取上层液，600uL氯仿-异戊醇(24 1)抽提一 次，取上层液；D. 0. 2倍体积的20mM乙酸铵，2倍体积的无水乙醇混合均勻，4°C沉淀过夜； E. 10，OOOrpm离心20min，加入400uL75 %乙醇洗涤，10，000离心；重复洗涤一次，离心；自 然晾干后加入PH8. OTE缓冲液溶解DNA。3、血样基因组制备A.取200uL左右全血于1. 5mL离心管中，加入等体积双蒸水混勻，10，OOOrpm离 心3min ；B.弃上清，再加入两倍体积双蒸水混勻，10，000离心3min ；C.弃上清；加入50mL Conden DNA提取液，混勻15min ；D.加入等体积的氯仿混勻5min后10，000离心5min，小心
取出分层溶液的上层，即用；4、脱落细胞拭子标本基因组制备临床运用拭子取下的脱落细胞，放于盛有生理盐水的一次性试管中；用之前将拭 子在试管中转2-3次，以使脱落细胞混勻浸泡在生理盐水中。A.取150uL左右的混合有脱 落细胞的生理盐水于1. 5mL离心管中，8，OOOrpm离心后弃上清；B.加入50mL Conden DNA 提取液，混勻15min ；C.加入等体积的氯仿混勻5min后10，OOOrpm离心5min，小心取出分 层溶液的上层，备用。5、石蜡切片标本基因组制备取2-3张石蜡切片脱蜡后，加入裂解液和蛋白酶K55°C水浴3小时至消化完全后， 100°C煮沸lOmin，12，OOOrpm离心取上清备用。二、基因组质量鉴定为了提高检测的成功率，采用Beta-globin扩增检测所提取的基因组质量，根据 扩增效率判断HPV分型实验中基因组的用量，以及HPV阳性和阴性的判断。标准基因组中 Beta-glonbin扩增测试如下15uL 体系扩增Beta-globin 引物序列如下 PC045，-CAA CTT CAT CCA CGTTCA CC-3’ ；GH205，-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3，。标准反应体系1X rTaq Buffer ；dNTP (各 0. 2-0. 4mM) ；1. 5-2. OmM Mg2+ ；引物各 0. 3-0. 5uM ；DNA 0. 5_lng ；rTaq 1U/uL，加双蒸水至 15uL。
标准反应条件:95V，5min ；95°C，40s ；55°C 30s ；72°C，Imin ；30cycles ；72°C终延伸5min。琼脂糖检测。1、福尔马林浸泡组织提取基因组中Beta-glonbin的测定Beta-globin扩增反应体系与标准体系相比，反应体系中适当的提高镁离子浓度，反应条件适当延长各个反应阶段的时间，以提高反应效率。2、新鲜血样和组织提取基因组中Beta-glonbin测定取0. 5-lul基因组按上述标准Beta-glonbin扩增。3、脱落细胞提取基因组Beta-glonbin测定视最初离心时候肉眼可见沉淀的量取0.5uL_2uL基因组进行标准Beta-globin扩 增测试。4、石蜡切片提取基因组Beta-glonbin测定约3_5uL进行三轮扩增以及Beta-globin扩增测试。三、巢式PCR扩增采用三轮巢式PCR扩增HPV Ll保守区域，终产物约150bp。MY09 5，CGTCCAAAAGGAAACTGATC 3，MYll 5’ GCACAGGGACATAACAATGG 3’GP5+ 5’ TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC 3’GP6+ 5，GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 3，一轮引物 MY09/MY11二轮引物 MY09/GP5+三轮引物GP5+/GP6+1、标准三轮巢式PCR扩增PCR 反应体系1 XrTaq Buffer ;dNTP 各 0. 2 0. 4mM ;1. 5 2. OmM Mg2+；引物各
0.3 0.5uM ；DNA 0. 5 Ing ；rTaq 1U/uL,加双蒸水至 15uL ；其中优选浓度 dNTP 各 0. 4mM ；
1.5mM Mg2+ ；引物各 0. 4uM。PCR反应条件
第一轮第二、三轮 2、针对福尔马林浸泡过的组织以及石蜡切片中提取的基因组PCR扩增条件PCR反应液体系适当增加镁离子浓度，添加BSA，其余成分浓度不变。PCR反应条件采用上述标准条件三轮巢式扩增。3、血液样品和脱落细胞基因组的PCR扩增条件PCR反应液体系采用上述标准PCR反应体系。PCR反应条件采用上述标准条件三轮巢式扩增。4、对于一次扩增失败扩增的福尔马林浸泡组织基因组的PCR扩增条件PCR反应液体系适当增加基因组用量，其余成分适当调整。PCR反应条件第二轮扩增采取降落PCR扩增58°C降至50°C左右；每个循环降落1°C，然后按标准反应条件扩增20-30个循环。四、电泳检测目的产物取样本各上样4μ L左右，2%琼脂糖电泳检测Beta-globin以及三轮巢式扩增产 物，判断有无HPV病毒感染。对于Beta-globin阳性扩增的样本基因组，三轮HPV Ll区域扩增阴性者，判定为 HPV阴性；对于Beta-globin阳性扩增的样本基因组，三轮HPV Ll区域扩增阳性者，可后续 分型；对于Beta-globin阴性扩增的样本基因组，三轮HPV Ll区域扩增阳性者，经过两 次HPV扩增验证后，确定为HPV阳性，考虑到样本基因组质量可能太差的缘故，Beta-globin 一轮扩增效率有限。五、目的产物测序及分型若确定为HPV阳性后，则可取大量扩增第三轮目的产物，ABI 310 DNAanalyzer目 的产物测序，测序引物为GP5+。运用序列分析软件分析测序结果对于测序结果，序列若 无杂峰，视为单一 HPV 感染,运用 BLAST 2. 0 softwareserver (http //www, ncbi. nih. rov/ BLAST)比对分型，得出HPV型别。若序列为重叠峰的，则视为潜在的多重感染，需要将第三 轮目的产物纯化，克隆后，任挑取5个阳性菌落测序，将挑选出来的PCR产物的5个克隆结 果进行比对，BLAST 2.0 software server (http //www, ncbi. nih. rov/BLAST)，鉴定复合 感染的HPV型别。SEQUENCE LISTING<110>中山大学<120> 一种微量HPV快速基因分型方法<130>
权利要求
一种微量HPV快速基因分型方法，其特征在于，包括以下步骤(1)样本基因组提取；(2)采用三轮巢式PCR扩增HPV L1保守区域；一轮引物MY09/MY11；二轮引物MY09/GP5+；三轮引物GP5+/GP6+；其中上述引物的序列分别为MY09 5’CGTCCAAAAGGAAACTGATC 3’MY11 5’GCACAGGGACATAACAATGG 3’GP5+ 5’TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC 3’GP6+ 5’GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 3’；(3)电泳检测目的产物，判断有无HPV病毒感染；(4)若检测有HPV病毒感染，则对上述目的产物进行测序并分型；a测序结果若无重叠峰，判定为单一HPV感染；b测序结果若出现重叠峰，判定为复合感染，并且将目的产物克隆后筛选阳性克隆进行测序、分型，得到复合感染的HPV型别。
2.根据权利要求1所述的一种微量HPV快速基因分型方法，其特征在于，在三轮巢式 PCR扩增之前采用Beta-globin扩增检测所提取的基因组质量，根据扩增效率判断基因组 的用量，以及HPV阳性和阴性的判断。
3.根据权利要求2所述的一种微量HPV快速基因分型方法，其特征在于，所述 Beta-globin扩增的引物序列如下PC04 5' CAACTTCATCCACGTTCACC 3' GH20 5’ GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 3’。
4.根据权利要求1或2所述的一种微量HPV快速基因分型方法，其特征在于，所述三轮 巢式PCR的反应体系为IXrTaq Buffer ；dNTP 各 0. 2 0. 4mM ；1. 5 2. OmM Mg2+ ；引物各 0. 3 0. 5uM ；DNA 0. 5 Ing ；rTaq 1U/uL，加双蒸水至 15uL。
5.根据权利要求1或2所述的一种微量HPV快速基因分型方法，其特征在于，所述三轮 巢式PCR的反应条件为
全文摘要
本发明公开了一种适用范围广、灵敏度高、精确高效的微量HPV快速基因分型方法。本发明以PCR检测方法为基础，采用了三轮巢式扩增HPV L1保守区域，对目的产物进行电泳检测与测序，然后运用专用分析软件对上述目的产物进行分型，可以准确快速的诊断微量HPV病毒感染，检测鉴别包括高危型及低危型等多种HPV基因型别，灵敏度高，适用范围广，可用于检测石蜡切片、福尔马林浸泡组织、血样、脱落细胞等多种类型样本，方便应用于宫颈癌的早期筛查。
文档编号C12Q1/68GK101838709SQ20101014972
公开日2010年9月22日 申请日期2010年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者吴玉萍, 宁曦, 常利红 申请人:中山大学