专利名称：一种启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子及其应用。
背景技术：
植物在发育到一定时期是会发生自发的器官脱落，当植物遭遇逆境时，也常常脱 落一些器官以度过难关。在不同植物中，叶片、果实、花等器官都可能存在脱落现象。脱落 是主动的生理过程，它是高度协调一致的细胞结构、代谢以及基因表达变化的统一体现。脱落在离层区发生。离层区是指植物本体和将要脱落器官之间几层特殊的细胞。 它们与周围的细胞之间有明显的形态和生化特征差异，对同样的信号，离区细胞和相邻器 官细胞可能做出不同的响应，这也是脱落发生的基础。基因工程在很大程度上是将目的基因以一定的表达量在特定的组织中表达，因而 需要一些调控外源基因有效表达的分子元件，其中启动子是最重要的一个。随着基因工程 的不断发展，为了满足基因工程对不同功能启动子的需要，就必须分离一些新型有效的启 动子。按作用方式和功能，启动子可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动 子。组织特异性启动子(tissue-specific promoter)又称之为器官特异性启动子。在这 些启动子调控下，基因的表达往往仅发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发 育调节的特性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为其存在的基础。 典型的组织特异性启动子如水稻花药特异性启动子0sg6B、番茄花粉特异性启动子LAT52、 烟草花药绒毡层特异性启动子TA29、玉米花粉特异性基因启动子Zml3、矮牵牛花药特异性 启动子ChsA、拟南芥花药特异性启动子A9、油菜花药特异性启动子Bp4A和BplO等。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA片段。本发明所提供的DNA片段为如下1)、2)、3)或4)所示1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA片段；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。所述严格条件可为在0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下杂 交，并用该溶液洗膜。扩增上述DNA片段全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列2所示，另一条引物序列如序列表 中序列3所示。含有上述DNA片段的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的 保护范围。上述DNA片段在使目的基因在植物器官离层区中表达中的应用也属于本发明的
3保护范围。上述应用中，所述植物具体为拟南芥，所述器官具体为花。上述DNA片段在调节植物器官脱落中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述植物具体为拟南芥，所述器官具体为花。植物的器官脱落，尤其是果实的脱落，对农作物是至关重要的性状。实验证明，本 发明的DNA片段是一个离区特异的启动子，可以驱动目的基因特异地在植物的离区组织中 表达，如驱动与脱落相关的基因(如细胞壁的水解酶类)，以促进果实的剥离；再如驱动抑 制脱落的基因，防止在果实在成熟前脱落造成的产量损失。本发明的DNA片段还可以作为 启动子的一部分，连接其它的顺式作用元件后获得其它特性，如增强表达活性或增加诱导 表达能力。利用组织特异性启动子驱动目的基因在特定的组织或器官中表达，可以增强其 表达效率，并减少基因异位表达对宿主植物造成的伤害或不利作用。因此，本发明的DNA片 段具有广阔的应用前景。
图1为pCAMBIA1391质粒的物理图谱。图2为阳性重组大肠杆菌的验证。图3为启动子驱动⑶S基因在离区中特异表达。图4为⑶S基因在不同组织中的表达检测。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、启动子的制备、确认和功能验证一、启动子的制备和确认PMD-18T-easy 载体购自 TaKaRa，产品目录号为 D101A。以1周龄拟南芥野生型植株为实验材料，提取其基因组DNA，并以总DNA为模板， 用下述引物进行PCR扩增，，用pfu酶扩增。引物序列两端分别引如BamHl和EcoRl酶切位 点，引物序列如下上游GGATCCTGTGTGTGATTGTGTTATTGTGTCT(序列 2)，引入 BamHI 酶切位点
下游GAATTCGCAATATGGGACAAGAGAGAAGAG (序列 3)，引入 EcoR I 酶切位点将PCR扩增产物进行电泳，结果显示扩增得到的片段为1250bp。将PCR扩增产物 加尾后连接到PMD-lST-easy载体上，将重组载体转化大肠杆菌，Amp抗性筛选，得到阳性重 组菌；提取阳性重组菌的质粒，测序验证，测得的序列如序列表中序列1所示，将序列1所示 的 DNA 片段记作 AtD0F4. 7promoter_T。二、启动子的特异表达验证pCAMBIA1391质粒(张勇，付绍红，张汝全，牛应泽.甘蓝型油菜PEPC基因保守序 列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建.2008.分子植物育种.第6卷，第4期，第 775-780页)(图1)(由中国农业大学提供)。农杆菌菌株 GV3101 (Holsters M, Silva B, Van Vliet F, Genetello C, De Block
4M，Dhaese P，D印icker A,Inz D,Engler G,Villarroel R,Van Montagu M，Schell J(1980) Thefunctional organization of the nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid 3 =212-230)(由中国农业大学提供)。 将实验一中得到的阳性克隆培养，提取阳性质粒，用BamHI和EcoRI酶切阳性质 粒，酶切产物进行琼脂糖电泳分析，回收小片断(即实验一中扩增得到的DNA小片段)； 用BamHI和EcoRI酶切pCAMBIA1391质粒，回收载体大片段；将DNA小片段和载体大片段用 T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌，Kan筛选阳性克隆，将阳性克隆进行PCR鉴定 和酶切鉴定和测序鉴定，PCR鉴定中使用的引物为序列2和序列3所示。结果如图2所示 (图2，A图为PCR鉴定结果，泳道1和2分别为两个克隆的PCR鉴定结果；B图为酶切鉴定 结果，泳道1和泳道2表示两个克隆的酶切鉴定结果)，测序鉴定表明获得的序列如序列表 中序列1所示。表明获得了阳性克隆，将阳性克隆记作pCAMBIA1391-AtD0F4. 7promoter
GUS。
酶切体系如下
10XK Buffer5uL
BamHIluL
EcoRIluL
PCAMBIA1391 或 AtD0F4. 7promoter_T 阳性质粒 25uL
ddH2018uL
37°C,3hr
连接体系如下
10 X Ligation buffer1 uL
PCAMBIA13912uL
AtD0F4. 7promoter6uL
T4 DNA连接酶luL
4°C连接过夜
提取阳性克隆pCAMBIA1391-AtD0F4. 7promoter :GUS的质粒，通过CaCl2介导转化
农杆菌GV3101，通过抗生素Rif和Kan筛选，得到阳性克隆，将阳性克隆进行PCR鉴定，PCR 鉴定的引物为序列2和序列3所示。结果PCR扩增产物大小为1.2Kb。表明构建的重组农 杆菌正确。将阳性重组农杆菌，用flower dip法转化拟南芥，收取T0代种子；将T0代种子播 种，在添加25mg/L Hyg的MS培养基上筛选抗性苗，获得T1代种子。将T1代种子播种，在 添加25mg/L Hyg的MS培养基上筛选抗性苗，获得抗性稳定遗传的T2代阳性植株。以转入空载体pCAMBIA1391的拟南芥为对照。将T2代阳性植株的根、茎、叶、花、果颊、种子，放入装有lmL⑶S染液的EP管中， 37°C温浴4hr，用50%和70%的酒精依次洗脱12hr，在体视镜和显微镜下观察，并通过(XD 摄取图像。X-Gluc (5-溴-4氯_3_吲哚葡萄糖苷)溶液(即GUS染液)配置(lmL)称取lmg 的X-Gluc，加入1-2滴N，N- 二甲基甲酰胺，使X-Gluc至完全溶解，然后加入980 u L0. lmol/ L磷酸缓冲液(pH7. 0)和10 ii L 5mm/L铁氰化钾水溶液、10 u L 5mm/L亚铁氰化钾水溶液，搅拌，最后加入liiL Triton X-100。提取T2代阳性植株的根、茎、叶、花、果颊、种子的RNA，反转录，再进行PCR扩增，检 测其中⑶S的表达情况。PCR扩增引物为如下所示。GUS-F 5' -GCAACTGGACAAGGCACT-3‘；GUS-R 5' -GCGTCGCAGAACATTACA-3‘)染色结果如图3所示(A 果颊中GUS染色；B ；离层区部位的放大图，箭头分别指向 花瓣和雄蕊离区，比例尺=2mm)。各器官中GUS表达情况的检测结果如图4所示。⑶S表达结果显示，⑶S基因仅在花和果颊中有表达，而在根、茎、叶、种子中均没 有表达。染色结果显示，仅在拟南芥植株果颊的基部有蓝色着色，而果颊的基部为花器官 基部离层区；而在根、茎、叶、花、种子中均没有着色。对照组，在拟南芥植株花器官基部离层 区细胞层没有蓝色的着色，其它部位也没有着色。pCAMBIA1391载体中含有gus基因，本实验将DNA片段AtD0F4. 7promoter插 在gus基因的上游，gus基因的上游除了 DNA片段AtD0F4. 7promoter外，没有其它的启 动子。而gus基因表达，说明是DNA片段AtD0F4. 7promoter启动的结果，证明DNA片段 AtD0F4. 7promoter是启动子。基因表达实验进证明，该启动子只启动⑶S基因在花和果颊 中表达，而在其它组织(根、茎、叶、种子)中不启动表达；染色实验证明，只有在拟南芥植株 果颊的基部(即花器官基部离层区)有蓝色的着色，而在其它组织部位(根、茎、叶、花、种 子)没有着色，表明该启动子是离区特异表达的启动子。
权利要求
一种DNA片段，为如下1)、2)或3)所示1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA片段；3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。
2.扩增权利要求1所述DNA片段全长或其任意片段的引物对。
3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于所述引物对中，一条引物序列如序列表 中序列2所示，另一条引物序列如序列表中序列3所示。
4.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
5.权利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物器官离层区中表达中的应用。
6.根据权利要求5中所述的应用，其特征在于所述植物为拟南芥，所述器官为花。
7.权利要求1所述DNA片段在调节植物器官脱落中的应用。
8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于所述植物为拟南芥，所述器官为花。
全文摘要
本发明公开了一种启动子及其应用。该启动子为如下1)、2)、3)或4)所示DNA片段1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA片段；3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。实验证明，本发明的DNA片段是一个离区特异的启动子，可以驱动目的基因特异地在植物的离区组织中表达，如驱动与脱落相关的基因(如细胞壁的水解酶类)，以促进果实的剥离；再如驱动抑制脱落的基因，防止在果实在成熟前脱落造成的产量损失。因此，本发明的DNA片段具有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/19GK101857863SQ201010155858
公开日2010年10月13日 申请日期2010年4月21日 优先权日2010年4月21日
发明者张秀清, 王学臣, 魏鹏程 申请人:中国农业大学