专利名称：Obr基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及鹅的分子生物学技术及育种领域，具体是涉及测定与腹脂重、腹脂 率和血浆VLDL浓度等相关特征的遗传标记的存在，更具体地说，是涉及测定显示该些特 征的OBR基因的差异，再进一步具体地说，是测定OBR基因中的多态性，即与腹脂重、腹 脂率和血浆VLDL浓度相关的鹅OB(Obese)基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写为SNP)的存在。
背景技术：
现代家禽遗传育种理论和应用的发展，使肉用家禽特别是肉鸡、肉鸭的生长速度 和饲料效率大幅度提高，生产效率与工厂化生产逐相适应。但同时也容易带来胴体腹部脂 肪和皮下脂肪的大量沉积，导致饲料能量的浪费和胴体品质不佳。OB(obese)基因编码一种瘦蛋白质(L印tin)的肽类激素，可抑制脂肪蓄积和维持 脂肪细胞大小正常。目前有许多关于人、鼠OB基因以及少量关于猪OB基因的研究报道，但 家禽OB基因的研究报道还鲜见。OBR(obese receptor)基因在L印ein的信号转导起极重 要作用，它与机体脂肪沉积有关，故OBR基因可作为脂肪沉积候选基因。鸡OB基因的cDNA 于1998年Taouis等克隆和测序，编码长度492bp，编码163个氨基酸，含18个氨基酸信号 肽，成鸡L印tin由146氨基酸组成。Ashwell等用Northern检测发现，鸡的L印tin在脂 肪组织和肝脏中都有表达。鸡OBR的cDNA于2000年Guy Horev等和Takeshi等被克隆， 与其他哺乳动物OBR核苷酸序列的同源性平均为60% ,Durm等将鸡的OBR基因定位于8号 染色体上。顾志良等报道了对鸡的OBR基因的外显子9的部分序列进行克隆和测序，发现 一个碱基有突变，产生了多态性，但氨基酸序列没有改变(沉默突变)。顾志良等进一步用 PCR-SSCP方法研究不同品种鸡的OBR基因表明北京油鸡AA基因型频率与其它鸡种存在 差异，高脂系A基因频率比低脂系高，并推测基因A可能与沉积较多腹脂有关。李志辉等研 究结果表明，鸡OBR基因外显子9的SNPs基因型对肉鸡腹脂重和腹脂率有显著影响，可以 用于鸡脂肪性状的标记辅助选择。目前，有关鹅的DNA遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究相对鸡来说还 很少，且没有关于鹅OBR基因的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种OBR基因及 其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途；同时筛选与鹅脂肪沉积相关的SNP，以期应用于标记 辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在鹅标记辅助选择中的应用。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种OBR基因，是与表示鹅 脂肪性状的腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度相关的基因，其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。 上述OBR基因序列的第55bp处有一个A — G的突变，导致多态性的存在。克隆OBR基因和检测55A-55G碱基处突变所用引物的序列如下
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正向引物5，-GTGCTGTACTTCCCTACTAAG-3，，反向引物5，-TGGCATTCCCTATTTTGA-3，。上述OBR基因在鹅遗传标记辅助选择中的应用。一种鉴定鹅脂肪性状的遗传标记的方法，该鹅具有与表示鹅脂肪性状的腹脂重、 腹脂率和血浆VLDL浓度相关的基因，该方法包括测定从鹅获得的核酸样品中OBR基因中多 态性的存在，该多态性是与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度相关的 多态性，该多态性在OBR基因序列的55bp处有一个A — G的突变。上述方法包含克隆得到一个如权利要求1所述OBR基因的DNA序列，该基因的该 基因外显子9编码序列，扩增目的片断长度217bp，第55碱基处有一个碱基突变A55-G55。克隆OBR基因和检测55A-55G碱基处突变所用引物的序列为正向引物5，-GTGCTGTACTTCCCTACTAAG-3，，反向引物5，-TGGCATTCCCTATTTTGA-3，。上述方法在鹅育种中的应用。现代家禽遗传育种理论和应用的发展，使肉用家禽特别是肉鸡、肉鸭的生长速度 和饲料效率大幅度提高，生产效率与工厂化生产逐相适应。但同时也容易带来胴体腹部脂 肪和皮下脂肪的大量沉积，导致饲料能量的浪费和胴体品质的不佳。针对这个问题，本发明 人选择鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选鹅脂肪性状相关基因，其步骤如下(1)选择相同日龄的健康雏苗溆浦鹅65只，四川白鹅130只进行饲养试验。所有 供试鹅于84日龄进行屠宰测定，测定和计算按照《畜禽遗传资源调查技术手册》中的“家禽 生产性能名词术语和度量统计方法”进行。用电子秤测定屠体重、全净膛重、肝脏重、腹脂重 和用卡尺测量皮脂厚等。计算胴体脂肪性状比率指标。(2)根据OBR基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；(3)筛选与腹脂率高低相关的SNP。本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出OBR基因为鹅脂肪沉积的相关 基因，继而从鹅OBR基因上筛选到与脂肪性状相关的SNP，并且通过生产实践验证确定OBR 基因为脂肪沉积相关基因，筛选的SNP为与之相关的SNP。本发明筛选的鹅OBR基因的SNP 可作为鹅辅助选择的遗传标记，从而培育出腹脂更少的鹅，具有极其重大的应用价值和经 济效益。
图1是本发明的鹅OBR基因部分DNA序列，55bp处A/G多态位点以圆括号()标出表不。图2是本发明的鹅OBR基因部分序列的PCR-SSCP电泳图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。实施例1鹅相关基因SNP筛选选择相同日龄的健康雏苗溆浦鹅65只，四川白鹅130只进行饲养试验。所有供试鹅于84日龄进行屠宰测定，测定和计算按照《畜禽遗传资源调查技术手册》中的“家禽生产 性能名词术语和度量统计方法”进行。用电子秤测定屠体重、全净膛重、肝脏重、腹脂重和用 卡尺测量皮脂厚等。计算胴体脂肪性状比率指标。对即将进行屠宰测定的溆浦鹅60只和四川白鹅120只空腹12小时后，用一次性 医用注射器(2. 5ml)翅下静脉采血Iml/只于5ml离心管中，用75%乙醇抗凝，冰箱4°C冷
藏备用。已经鉴定的高腹脂型和低腹脂型样本中分别随机选择6个共12个样品，并分别提 取其基因组DNA。根据GenBank中红原鸡的OBR基因序列，用Primer 5. 0程序来设计，覆盖该 基因外显子9编码序列，引物序列为5，GTGCTGTACTTCCCTACTAAG 3，(SEQ IDNO 2)， 5，TGGCATTCCCTATTTTGA 3，(SEQ ID NO :3)，扩增目的片断长度217bp，由上海英韦创津公 司合成，用上述引物分别对提取的鹅基因组DNA进行扩增。PCR反应总体积为10 μ 1，成分如下IOXbuffer1 μ 1dNTPs (2. 5mM) 0. 6 μ 1DNA 模板IOOng前引物(20μ Μ) 0. 1 μ 1后引物(20μ Μ) 0. 1μ 1Taq DNA 酶2U力口 ddH20 至10 μ 1反应条件94°C 5分钟预变性后30个PCR循环参数为95°C 30秒，50°C 30秒， 72 0C 30秒，最后72 °C 7分钟。取扩增产物5 μ 1，加入变性剂(95%甲硝铵)10μ 1，95°C变性10分钟，再冰浴5 分钟后，点样于15%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳(丙烯酰胺/N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺为 29 1)，电压保持在80 100V，常温下电泳约16 18小时，直至兰色溴酚蓝染料至凝胶 最底端为止。凝胶用硝酸银染色，根据显影结果判定基因型。如图2所示，SSCP分析结果 表现为鹅OBR基因部分DNA片段有三种不同条带类型，说明该DNA片段存在SNP。三种不 同条带类型分别定义为AA型和BB型，杂合型定义为AB型。取PCR扩增产物50 μ 1，经纯化，克隆后经测序，确证了 PCR产物是OBR基 因，PCR产物的长度为217bp，序列如序列表中的SEQ ID N0:1所示。该序列已登录 GenBank (DQ346681).并从PCR产物测序结果，显示了鹅OBR基因的变异位点。结果表明， 在该基因片段序列的55bp处有一个A — G的突变，该序列已登录GenBank (DQ346681)。将上述产物进行氨基酸序列分析，结果如下，见SEQ ID NO 4 VLYFPTKILTSVGSNVSFHCIYKNKNKNVLSRKIVWWLNLAEEIPESQYTLVNDRVSKVTLFNLKATKP RGN上述氨基酸序列分析表明，鹅OBR基因外显子9序列的一个碱基突变将导致该基 因在表达时所转录的蛋白质中氨基酸序列也发生一个变异，即精氨酸变为半胱氨酸。上述实验结果表明，从鹅腹部脂肪提取的鹅脂肪性状相关基因为OBR基因，并且 在该基因序列中筛选到与腹脂沉积有关的SNP，并且该碱基突变导致了蛋白质氨基酸也发生一个变异，很可能这就是影响腹脂沉积的原因。实施例2与腹脂率有关的SNP在生产实践中的验证选择相同日龄的健康雏苗溆浦鹅65只，四川白鹅130只进行饲养试验。两品种鹅在相同饲养管理条件下，进行屠宰测定，宰前测定体重并采集血样2ml/ 只。屠宰采用颈部放血，机器和人工相结合拔除毛绒及细毛，浙干后冷却屠体再进行称重和 胴体脂肪性状测定。胴体脂肪性状测定和计算按照《畜禽遗传资源调查技术手册》中的“家禽生产性 能名词术语和度量统计方法”进行。其中腹脂重指腹部脂肪和肌胃周围脂肪之和；腹脂率 (%)=腹脂重/(全净膛重+腹脂重)X100%。用翅静脉采集血样(4.0%EDTA 二钠盐抗 凝)离心后的血浆，采用肝素-镁比色方法测定VLDL(极低密度脂蛋白)。在波长540. Onm 和带宽2. Onm下用分光光度计测定。采集高腹脂型和低腹脂型的鹅各30头血样，提取基因组DNA，利用实施例1中的引 物扩增，并按照实施例1的方法检测其SNP。UPCR PCR反应体系，如表1所示表IPCR反应体系中各组成成分 PCR循环参数如下34 个循环:94°C,4min ；94°C，30s ；59°C，40s。72°C,7min。2、OBR基因型与鹅脂肪性状的相关分析2. 1不同基因型对溆浦鹅脂肪性状的影响分析不同SNP基因型对溆浦鹅脂肪性状的影响，结果见表2。从表2中可见不同 SNP基因型对溆浦鹅的腹脂重、腹脂率、血浆VLDL浓度有显著影响；其中BB型腹脂重极显
6著低于AA型和BB型(ρ < 0. 01)，AA型和BB型的腹脂重差异不显著(P > 0. 05) ；BB型腹 脂率和血浆VLDL浓度显著低于AA型和BB型(P < 0. 05)，AA型和BB型之间差异不显著(P > 0. 05)；不同基因型之间的皮脂厚和肝脏率差异不显著(P > 0. 05)。表2SNP基因型对溆浦鹅脂肪性状的影响 注同一列肩注字母相同为差异不显著(ρ > 0. 05)；不同小写字母为差异显著(P < 0. 05)；不同大写字母为差异极显著(ρ < 0. 01)。2. 2不同基因型对四川白鹅脂肪性状的影响分析不同基因型对四川白鹅脂肪性状的影响，结果见表3。从表3中可见不同基 因型对四川白鹅的腹脂重、腹脂率、血浆VLDL浓度同样有显著影响；其中BB型腹脂重和腹 脂率显著低于AA型和BB型(ρ < 0. 05)，AA型和BB型的之间差异不显著(P > 0. 05)；三 个不同基因型之间的血浆VLDL浓度都表现差异显著(ρ <0.05)；不同基因型之间的皮脂 厚和肝脏率差异不显著(P > 0. 05)。表3SNP基因型对四川白鹅脂肪性状的影响 注同一列肩注字母相同为差异不显著(ρ > 0. 05)；不同小写字母为差异显著(P < 0. 05)。2. 3不同基因型溆浦鹅与四川白鹅脂肪性状的比较对溆浦鹅与四川白鹅脂肪性状进行比较的结果见表4，表中数据分别为溆浦鹅试 验样本的总均数、各基因型值与四川白鹅各对应脂肪性状值的算术差。两品种脂肪性状显 著性经t检验，可知溆浦鹅腹脂率显著低于四川白鹅(p<0. 05)，而肝脏率显著高于四川 白鹅(P <0.05) ；AA基因型中，溆浦鹅血浆VLDL浓度显著高于四川白鹅(ρ <0.05) ；BB基 因型中，溆浦鹅腹脂重、腹脂率都分别极显著和显著低于四川白鹅(P < 0.01，ρ < 0. 05)， 而肝脏率极显著高于四川白鹅(p<0.01) ；AB基因型中，溆浦鹅腹脂重、血浆VLDL浓度都 分别显著低于四川白鹅(P <0.05)，而肝脏率显著高于四川白鹅(ρ <0.05)；不论样本总 均数，还是不同SNP基因型，溆浦鹅与四川白鹅的皮脂厚无明显差异(P > 0.05)。
表4SNP基因型对溆浦鹅和四川白鹅脂肪性状影响 注**P< 0. 01，*P < 0. 05。2. 4基因型对性状贡献率2. 4. ISNP基因型对溆浦鹅脂肪性状的贡献率溆浦鹅不同SNP基因型对脂肪性状贡献率的计算结果见表5。由表可见，如选择 AA基因型将对溆浦鹅腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度都产生极显著(ρ < 0.01)或显著 (P < 0. 05)大的正向遗传贡献率；而如果选择BB基因型将对溆浦鹅腹脂重、腹脂率和血浆 VLDL浓度都产生极显著大(ρ <0.01)的负向遗传贡献率。选择AB基因型对溆浦鹅脂肪性 状无明显遗传贡献率(P > 0. 05)。表5SNP基因型对溆浦鹅脂肪性状的贡献率 注**P < 0. 01，*P < 0. 05，CP =基因型效应的贡献率(％ )2. 4. 2SNP基因型对四川白鹅脂肪性状的贡献率 四川白鹅不同SNP基因型对脂肪性状贡献率的计算结果见表6。由表6可知，如选 择AA基因型对四川白鹅脂肪性状无明显遗传贡献率(P >0.05)；而如果选择BB基因型将 对四川白鹅腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度都产生极显著大(ρ <0.01)的负向遗传贡献率，而对皮脂厚产生显著大(P <0.05)的负向遗传贡献率。选择AB基因型对四川白鹅脂 肪性状中的血浆VLDL浓度有明显正向遗传贡献率(P > 0. 05)。表6SNP基因型对四川白鹅脂肪性状的贡献率 2. 50BR基因主效应指数计算各性状OBR基因的主效应指数(MEI)，结果如表7所示。OBR基因对脂肪多个 性状的MEI值较大，不同品种间同一性状的MEI值也存在较大差异。其中OBR基因对溆浦鹅 腹脂重的MEI达到44. 466，对血浆VLDL浓度为21. 284，对腹脂率为16. 797，表明溆浦鹅这 些性状的表型变异中有16%以上是来自OBR基因SNP的联合方差；OBR基因对四川白鹅腹 脂重的MEI达到9. 638，对血浆VLDL浓度为21. 112，对腹脂率为8. 442，对皮脂厚为10. 685， 表明四川白鹅这些性状的表型变异中有8%以上是来自OBR基因SNP的联合方差。两品种 中溆浦鹅腹脂重和腹脂率的MEI是四川白鹅的2倍多，而血液VLDL浓度的MEI两品种表现 一致。各个性状SNP联合方差与其表型方差之间的关联系数为0. 9732，表明SNP联合方 差能很好地反映表型方差的变化。表70BR基因对脂肪性状的主效应指数 综上所述，OBR基因的SNP基因型对本研究的鹅腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度 都有极显著或显著的影响，BB型是降低鹅腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度的优势基因型， 其贡献率对溆浦鹅超过29 %，对四川白鹅超过20 %。AA型是提高溆浦鹅腹脂重、腹脂率和 血液VLDL浓度的优势基因型，其贡献率超过8%。OBR基因对溆浦鹅腹脂重的主效应指数
9(MEI)达到44. 466，对血浆VLDL浓度为21. 284，对腹脂率为16. 797 ；OBR基因对四川白鹅腹 脂重的MEI达到9. 638，对血浆VLDL浓度为21. 112，对腹脂率为8. 442，对皮脂厚为10. 685。 因此，本发明的OBR基因可作为鹅脂肪性状的主效应基因。本发明筛选到的SNP可以作为 鹅腹脂率和VLDL的分子遗传标记进行标记辅助选择和育种。
权利要求
一种OBR基因，是与表示鹅脂肪性状的腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度相关的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的OBR基因，其特征在于所述OBR基因序列的第55bp处有一个 A-G的突变，导致多态性的存在。
3.如权利要求1所述的OBR基因，其特征在于克隆OBR基因和检测55A-55G碱基处 突变所用引物的序列如下正向引物5’ -GTGCTGTACTTCCCTACTAAG-3，，反向引物5，-TGGCATTCCCTATTTTGA-3’。
4.如权利要求1至3中任一项所述的OBR基因在鹅遗传标记辅助选择中的应用。
5.一种鉴定鹅脂肪性状的遗传标记的方法，该鹅具有与表示鹅脂肪性状的腹脂重、 腹脂率和血浆VLDL浓度相关的基因，其特征在于该方法包括测定从鹅获得的核酸样品 中OBR基因中多态性的存在，该多态性是与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率和血浆 VLDL浓度相关的多态性，该多态性在OBR基因序列的55bp处有一个A — G的突变。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于该方法包含克隆得到一个如权利要求1所 述OBR基因的DNA序列，该基因的该基因外显子9编码序列，扩增目的片断长度217bp，第 55碱基处有一个碱基突变A55-G55。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于克隆OBR基因和检测55A-55G碱基处突变 所用引物的序列为正向引物5’ -GTGCTGTACTTCCCTACTAAG-3，，反向引物5，-TGGCATTCCCTATTTTGA-3’。
8.权利要求5至7中任一项所述的方法在鹅育种中的应用。
全文摘要
一种OBR基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途，测定出OBR基因中与腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度相关的遗传标记，并测定从该动物获得的核酸样品中OBR(obese receptor)基因中多态性的存在，该多态性是与腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度相关的多态性，并可根据该基因的单核苷酸多态性可对基因组DNA中含有OBR基因的动物进行脂肪性状选育，筛选出降低鹅腹脂重、腹脂率和血浆VLDL浓度的优势基因型，具有极其重大的应用价值和经济效益。
文档编号C12Q1/68GK101921771SQ20101015578
公开日2010年12月22日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者何俊, 曲湘勇, 蒋隽 申请人:曲湘勇;湖南农业大学