专利名称：一种提高β葡聚糖酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种在酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)细胞壁外表面展露表达β葡聚糖酶以提高该酶活性的方法。
背景技术：
谷物及其加工副产物是常用的饲料原料，但这些饲料含有高含量β葡聚糖，会提高单胃动物消化道粘度，妨碍动物消化酶对饲料的消化利用。添加外源β葡聚糖酶具有提高单胃动物消化率、报酬率和生产性能的效果。外源β葡聚糖酶在饲料中已广泛应用，目前应用的β葡聚糖酶主要存在以下问题酶的重组表达方式一般是细胞内表达和分泌表达。细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触，从而极大地影响酶的催化效率，而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制，也影响表达效率。分泌表达的主要缺点是表达效率不高，而且也不能实现完全分泌表达，总有相当一部分表达产物滞留于细胞内，从而也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。这两种表达方式都导致酶的催化效率不高。
发明内容
针对现有的β葡聚糖酶催化效率低的问题，本发明提供一种将β葡聚糖酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高β 葡聚糖酶活性。本发明的一种提高β葡聚糖酶活性的方法，包括以下步骤将β葡聚糖酶基因连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子下游MFa 1信号肽序列的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子+MF α 1信号肽序列+β葡聚糖酶基因+α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。将包含上述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有6%半乳糖和4. 5-6%乳糖(重量百分比)的YPD培养基中。本发明的优点将β葡聚糖酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高β葡聚糖酶活性。
具体实施例方式以下通过实施例进一步对本发明进行描述本发明开发一种将β葡聚糖酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高β葡聚糖酶活性。三种酶分子表达方式如下
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酶分子细胞内表达分泌表达展露表达实施例1 β葡聚糖酶展露表达将β葡聚糖酶基因(来自Bacillus subtilis，Genbank号U60830)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素(来自酿酒酵母&iccharomyces cerevisiae，Genbank号 M28164)序列的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子(来自酿酒酵母表达载体 pYES^3，Genbank 号AY^8072)下游 MFa 1 信号肽(来自酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，Genbank号M17301)序列的C端，构建成表达框(从N端到C端)GAL1启动子+MFal信号肽序列+β葡聚糖酶基因+α凝集素。将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae，购自安琪酵母股份有限公司)，则MF α 1信号肽将引导β葡聚糖酶向酿酒酵母细胞外分泌，而β葡聚糖酶下游的α凝集素则锚定在酿酒酵母细胞壁中，从而使β葡聚糖酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面。实施例2 β葡聚糖酶展露表达的诱导在培养酿酒酵母的YPD培养基中，添加6%半乳糖(购自上海生工生物工程有 P艮公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & ServicesCo.， Ltd.)和4. 5-6%乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai SangonBiological Engineering Technology & Services Co.，Ltd.)，则表达框 “GAL1 启动子+MFa 1 信号肽序列+β葡聚糖酶基因+α凝集素”中的GALl启动子就会活化，诱导β葡聚糖酶在酿酒酵母细胞壁外表面展露表达。实施例3半乳糖和乳糖对β葡聚糖酶展露表达的作用在培养酿酒酵母的YPD培养基中，如果不含半乳糖和乳糖，则未检测到β葡聚糖酶活性，这是因为表达框“GAL1启动子+MFa 1信号肽序列+ β葡聚糖酶基因+FLO序列”中的GALl启动子无法保持活化状态。实施例4 β葡聚糖酶展露表达后活性的提高按照实施例1和实施例2所示步骤进行展露表达的β葡聚糖酶活性为1277U/ mL (6%半乳糖和4. 5%乳糖)和1284U/mL(6%半乳糖和6%乳糖)，而如果在实施例1和实施例2所示的展露表达表达框“GAL1启动子+MFa 1信号肽序列+ β葡聚糖酶基因+ α凝集素”中去除α凝集素序列，则β葡聚糖酶进行分泌表达，活性为386U/mL(6%半乳糖和 4.5<%乳糖)和405^1^(6(%半乳糖和6(%乳糖)。因此，在表达系统与基本表达元件一样的情况下，增加α凝集素这一展露表达元件可使β葡聚糖酶活性提高数倍。对β -葡聚糖酶活性测定采用还原糖测定法，活性单位定义为在ρΗ 5. 0,40°C 条件下，每分钟从β-葡聚糖(购自上海生工生物工程有限公司，Sianghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co. , Ltd.) / ^ ^ Φ I #1 μ mol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位，简称为U。 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种提高β葡聚糖酶活性的方法，其特征在于包括以下步骤将β葡聚糖酶基因 (Genbank号U60830)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号IC8164) 的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子(Genbank号AY428072)下游MF α 1信号肽序列(Genbank号Μ17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子 +MFa 1信号肽序列+ β葡聚糖酶基因+ α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将包含“权利要求1”所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有6% (重量百分比)半乳糖和4. 5-6%乳糖(重量百分比)的YPD培养基中。
全文摘要
本发明的一种提高β葡聚糖酶活性的方法，包括以下步骤将β葡聚糖酶基因连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子下游MFα1信号肽序列的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子+MFα1信号肽序列+β葡聚糖酶基因+α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。本发明的优点将β葡聚糖酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高β葡聚糖酶活性。
文档编号C12R1/865GK102242096SQ201010172808
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者何国庆, 周陈伟, 廖文艳, 徐娟, 王睿之, 阮晖, 陈美龄, 陈赟, 马风兰 申请人:浙江大学