专利名称：一种水稻矮缩病毒的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及植物病毒学技术领域，特别是一种水稻矮缩病毒的快速检测方法。
背景技术：
由水稻矮缩病毒引起的水稻矮缩病，广泛分布于日本、朝鲜、尼泊尔、韩国、菲律 宾，以及我国浙江、福建、云南、广西、江苏、安徽、江西、湖南、湖北、广东、重庆、四川和贵州 等稻区。暴发流行时，可导致30% -50%的产量损失，甚至颗粒无收。水稻矮缩病的病原为水稻矮缩病毒，英文名称为Rice dwarf virus，缩写为RDV， 属于呼肠孤病毒科植物呼肠孤病毒属。RDV基因组编码有6-7种结构蛋白，包括Pl、P2、P3、 P5、P7、P8和P9 ；以及至少六种非结构蛋白，包括Pns4、Pns6、PnslO、Pnsll和Pnsl2。其中 P8是RDV的主要外壳蛋白。RDV病毒粒子是一个呈正二十面体对称的球形结构，无脂蛋白外 膜，无突起，含有双层外壳蛋白。完整粒子直径为70nm，核心为53nm，外壳和内壳的厚度分 别为17nm和7nm。外壳层三角形剖分数为T = 13。在感染的水稻病株中，病毒含量很高， 经超薄切片观察，病叶细胞中含有大量的病毒粒体和病毒基质。检测植物病毒的方法通常有指示植物法、电子显微镜观察、酶联免疫吸附分析技 术和RT-PCR/PCR检测技术等。指示植物法是周期较长，从指示植物的种植到病毒接种，再 到症状观察需要较长的时间，不适于快速诊断。电子显微镜观察技术，设备昂贵，技术复杂， 需要专业的技术人员，不适合大批量检测。而基于病毒外壳蛋白抗原抗体反应的酶联免疫吸附法和基于病毒核酸的PCR检 测是目前应用最为广泛的检测病毒的方法。免疫捕获RT-PCR结合了上述两种方法的优点。 免疫捕获RT-PCR或IC-RT-PCR主要由三个个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的 酶联免疫吸附试验ELISA的测定过程，第二部分为第一链cDNA的合成，第三部分即通常的 PCR检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻矮缩病毒的快速检测方法，为快速的检测大量样 品，本方法使用了 one step RT-PCR试剂盒，这样可把后面两部分合成一步。整个检测方法省略了繁琐的RNA提取过程及第一链cDNA的合成，利用抗体的高效 价及特异性，可特异快速的获得目的片段，为研究病毒的分子变异而进行的基因组序列扩 增提供了快捷特异的方法，从而完善了免疫捕获RT-PCR的技术。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种水稻矮缩病毒的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤1)水稻矮缩病毒抗体特异捕获水稻矮缩病毒；
2)高温变性获得病毒RNA作为模板； 3)利用水稻矮缩病毒特异性引物进行一步法反转录聚合酶链式反应one stepRT-PCR ；
4)琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。上述进行一步法反转录聚合酶链式反应one step RT-PCR的引物为水稻矮缩病毒 的特异性引物。采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)获得的反应产物，目标电泳条带出现在1370碱基对(bp)处。
具体实施例方式本发明的实施例技术方案如下1.引物设计上游弓丨物:5-GCAAAAATCGCCACCTGCCACTAT-3,下游弓丨物 5-CGGGCATTTCCTCCACGGCTAC-3，用于扩增 S8 片段 1370bp。2.病毒粒子的免疫捕获在PCR管中加入稀释为1 5000的RDV兔多抗血清，4°C下包被过夜，PBST洗涤3 次。水稻病样用PBST研磨，IOOOg离心lmin，取100 μ 1上清加入PCR管中，温育3h ；PBST 洗涤3次，H2O洗涤1次，短暂离心，吸去残液。3.高温变性力卩25 μ IDEPC处理的超纯水，97 °C变性5min，即刻插入冰内X预冷3_5min。4. one step RT-PCR应用大连宝生物公司one step RT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应。RT-PCR反应体 系lOXOne-step RT-PCR Buffer5μ L25mmol/L MgCl210 μ LlOmmol/LdNTPs5μ L5U/μ L AMV Reverse Transcriptase XL 1 μ L40U/μ L RNase Inhibitor1 μ L5U/yL AMV-Optimized Taq1 μ L0. 1 μ g/ μ L 上下游引物各lpLRT-PCR 反应条件50°C温育 30min ；94°C变性 5min ；94°C变性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸 2min， 反应30循环；72°C延伸lOmin，降至常温。5.电泳检测PCR反应结束后取5μ L反应产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳，在0. 5 X TBE缓冲液 环境中，80V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果。6.结果分析吸附在PCR管壁上的RDV抗血清能特异性结合水稻病样中的RDV粒子，扩增到大 小约为1370bp的片段，与报道的RDV S8大小相符。未经RDV抗血清吸附的PCR管中没有扩 增到目的片段。表明IC-PCR方法利用免疫结合原理可以捕捉到病株汁液中微量的病毒，进 行PCR，可以检测到样品中的RDV。再用此抗血清对RDV云南玉溪及陆良分离物做IC-PCR， 同样扩增到大小约为1370bp的目的片段。
依据上述方法，经检测昆明、玉溪和曲靖地区的水稻样品上的水稻矮缩病毒，电泳检测结果中如含有1370bp的片段，说明样品中含有RDV。
权利要求
一种水稻矮缩病毒的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤1)水稻矮缩病毒抗体特异捕获水稻矮缩病毒；2)高温变性获得病毒RNA作为模板；3)利用水稻矮缩病毒特异性引物进行一步法反转录聚合酶链式反应one stepRT-PCR；4)琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是进行一步法反转录聚合酶链式反应one step RT-PCR的引物为水稻矮缩病毒的特异性引物。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)获得的 反应产物，目标电泳条带出现在1370碱基对处。
全文摘要
本发明提供了一种水稻矮缩病毒的快速检测方法，其步骤包括通过水稻矮缩病毒抗体特异捕获水稻矮缩病毒、高温变性获得病毒RNA作为模板、利用水稻矮缩病毒特异性引物进行一步法反转录聚合酶链式反应one step RT-PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法利用抗体的高效价及特异性，可特异快速的获得目的片段，为研究病毒的分子变异而进行的基因组序列扩增提供了快捷特异的方法，从而完善了免疫捕获RT-PCR的技术。
文档编号C12Q1/68GK101824490SQ201010172289
公开日2010年9月8日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者丁铭, 尹跃艳, 张丽珍, 张仲凯, 彭潞波, 方琦, 李婷婷, 苏晓霞, 董家红 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所