专利名称：一种固定化酶及其制作方法和在搅拌型酸奶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品加工技术领域，特别是涉及一种固定化酶的制备及应用这种固 定化酶生产搅拌型酸奶的工艺方法。背景材料谷氨酰胺转氨酶是一种广泛存在于人体、高级动植物及微生物中的一种聚合 酶，能够催化蛋白质分子间或分子内的交联，改善蛋白质的多种功能特性，可应用于肉 制品、乳制品、豆制品和面制品等领域。但由于目前市售谷氨酰胺转氨酶的价格较高， 限制了其在食品中的广泛应用。固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，与游离酶相比，除具有高 效、专一、温和及酶的活性可调节控制等催化反应特性以外，还具有容易分离回收、可 重复多次使用、操作连续可控、工艺操作简便等优点。目前，谷氨酰胺转氨酶主要以游 离酶的形式使用，有资料报道可采用海藻酸钠对谷氨酰胺转氨酶进行固定化处理，但该 固定化酶质地较柔软，因容易破碎造成分离困难。酸奶是以牛乳或复原乳为主要原料，经巴氏杀菌后，接入乳酸菌菌种经发酵制 成的一种老少皆宜的营养食品。它不仅具有牛奶的营养价值，其中的有益微生物还会抑 制人体肠道中的腐败菌，促进营养物质的消化吸收，更加适合于人类的营养和保健。搅拌型酸奶是在牛奶中接入乳酸菌种后，在大型发酵罐中进行发酵，经机械搅 拌后成为液态，然后分装到包装容器内。同凝固型酸奶相比，搅拌型酸奶更适合大规模 生产，更便于添加果料等辅料，具有口味多样化、营养更为丰富的特点。但由于机械搅 拌过程破坏了酸奶的凝胶结构，为了保持酸奶的口感和质地，需要在酸奶生产过程中添 加稳定剂。目前使用的稳定剂通常由食品胶(如果胶、明胶、瓜尔豆胶)或增稠剂(如 变性淀粉)等组成，它们或成本高或口感差，或保水性与稳定性不佳，在使用效果上均 存在一定的缺陷，产品的质量有待改进。添加的稳定剂对人体健康没有帮助，而且还增 加了产品的生产成本。在酸奶生产过程中添加固定化谷氨酰胺转氨酶，可改善酸奶的口 感，增加其粘度和持水力，替代目前生产中普遍使用的稳定剂，有效地防止乳清析出。 同时具有生产成本低、产品保水性好、食用安全等特点。
发明内容
本发明的目的是克服现有生产搅拌型酸奶工艺中不足，提供一种既不用添加稳 定剂，还可以保持普通凝固型酸奶的口感和质地，并且能提高搅拌型酸奶的营养价值的 绿色、安全、简单、产品质量稳定且营养丰富的生产工艺方法。为实现上述目的，本发明生产一种谷氨酰胺转氨酶固定化酶，这种固定化酶作 为一种食品添加剂，可起到增加蛋白质的粘度和凝胶性的作用，可在酸奶等食品制作中 应用。本发明采用的技术方案如下本发明所采用的固定化谷氨酰胺转氨酶是用从泰兴市一鸣生物制品有限公司购得的酶活力为100U/g的谷氨酰胺转氨酶通过固定化制成的，其固定化方法如下1)将壳聚糖按料液比1 20 1 40的比例溶于醋酸溶液中，用搅拌机在 50 200rpm的条件搅拌10 40分钟，配成壳聚糖胶体溶液；2)将浓度4 10%的NaOH溶液和浓度30 90%乙醇溶液按50 1 5 6 的比例配成凝结液；3)用5 7号注射器将壳聚糖溶液滴入到凝结液中制成壳聚糖微球，20 30°C 下放置1 3小时，用蒸馏水反复洗涤至中性，4°C下冷藏备用；4)将壳聚糖微球按料液比1 3 1 10的比例溶于1 3%的戊二醛溶液中， 在15 30°C下恒温振荡1 3小时，用蒸馏水反复洗涤至微球不含游离戊二醛为止；5)将壳聚糖微球按料液比1 3 1 10的比例加入5 20%谷氨酰胺转氨酶 液，在20 30°C的温度下恒温振荡1 3小时，用pH 7.0的磷酸缓冲液反复洗涤微球至 未交联的游离酶被洗尽，即得固定化酶，4°C下冷藏备用。经上述方法得到的固定化酶，可以用来进行生产搅拌型酸奶。一种利用固定化酶生产搅拌型酸奶的工艺方法1)向牛奶中按20 100g/L的比例添加白砂糖和3 15g/L的比例添加大豆分 离蛋白并搅拌均勻，然后在20 25Mpa下高压均质；2)将均质后的原料在85 95°C下加热3 lOmin，冷却至43°C ；3)向冷却好的原料中按10 50g/L的比例添加按上述方法制作的固定化谷氨酰 胺转氨酶和体积百分比2 4%的比例添加保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌，两种乳酸菌的 比例为1 1 1 10，固定化谷氨酰胺转氨酶添加的具体方法是将固定化酶分成3 10份，用灭菌后的单层纱布包裹，用灭菌后的线绳系口，将纱布包浸入牛奶，并留一段 线绳在发酵容器外；4)将3)中准备好的原料在40 43°C下发酵2 4小时，制成酸奶；5)取出用纱布包裹着的固定化酶，将发酵好的酸奶冷却至18°C，用搅拌机在 20 40rpm的条件下搅拌5 20分钟；6)将5)中搅拌好的酸奶分装到销售容器中，再在0 6°C下后熟12 24h，即 得搅拌型酸奶。7)将固定化酶取出后，用无菌水清洗干净，放在4°C冰箱中冷藏，可反复使用 10次以上。根据需要，可以在步骤5)的搅拌过程中可按20 60g/L的比例添加果酱或果 粒，制成各种口味的果味酸奶或果粒酸奶。大豆分离蛋白具有较高的营养价值和良好的功能特性，尤其是具有良好的溶解 性和凝胶性。因此，在酸奶中添加一定量的大豆分离蛋白，不但能够显著提高搅拌型酸 奶的黏度、凝胶性和产品稳定性，还能够改善酸奶的营养价值，对人体非常有好处。谷氨酰胺转氨酶(简称TG)是一种广泛存在于人体、高级动植物及微生物中的 一种聚合酶，能够催化蛋白质分子间或分子内的交联。因此，它可以催化牛奶中的酪蛋 白、乳清蛋白和大豆球蛋白分子内或分子之间的交联反应，改善酸奶的口感，增加其粘 度和持水力，用它来替代目前酸奶生产中普遍使用的稳定剂，可以有效地防止酸奶中乳 清的析出，同时还具有结合力强、保水性好、使用安全等特点。
固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，一般采用物理或化学方法使 酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。 与游离酶相比，固定化酶除具有高效、专一、温和及酶的活性可调节控制等催化反应特 性以外，还具有容易分离回收、可重复多次使用、操作连续可控、工艺操作简便等优 点。目前，固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的得 到广泛的应用，在食品领域中的应用前景尤为可观。
具体实施例方式实施例11.壳聚糖微球的制备1)取20g壳聚糖，溶于醋酸溶液600mL中，用搅拌机在IOOrpm搅拌20分
钟，配成壳聚糖胶体溶液；2)将8 % NaOH 250mL和30 %乙醇溶液300mL混合，配成凝结液；3)用6号注射器将壳聚糖溶液滴入到凝结液中制成微球，25°C下放置2小时，用 蒸馏水反复洗涤微球至中性，4°C下冷藏；2.谷氨酰胺转氨酶的固定化(1)取20g壳聚糖微球，溶于2%戊二醛溶液IOOmL中，25°C下恒温振荡2小 时，用蒸馏水反复洗涤至微球不含游离戊二醛为止；(2)向微球中添加10%谷氨酰胺转氨酶酶液lOOmL，25°C恒温振荡2小时。用 pH 7.0的磷酸缓冲液反复洗涤微球，直至未交联的游离酶被洗尽，即得固定化酶，于4°C 冰箱中保存备用。3.搅拌型酸奶的制备1)向500mL牛奶中添加25g白砂糖和2.5g大豆分离蛋白，搅拌均勻，在25Mpa
下高压均质；2)90°C下加热5分钟，冷却至43°C。3)添加15g固定化谷氨酰胺转氨酶和15mL的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌(两 种乳酸菌的比例为1 5)，固定化酶添加的具体方法是将该酶分成5份，用灭菌后的单层 纱布包裹，用灭菌后的线绳系口，并留一段线绳在发酵容器外；4)42°C下发酵3小时，制成酸奶；5)取出用纱布包裹着的固定化酶，将酸奶冷却至18°C，添加20g果酱或果粒， 用搅拌机在30rpm的条件下搅拌10分钟；6)将酸奶分装到销售容器中，在O 6°C下后熟12 24小时，即得搅拌型酸 奶。4.所得产品检测参数感官指标微黄色，状态近似炼乳状，无乳清析出，质地均勻一致，无砂质、 片状或糊状感，口感细腻，甜酸适中，具有纯正的乳酸发酵香味和水果风味。酸度(°T) 88.6 ；持水力(%) 58.8 ；乳清析出率(% ) 36.0 ；
表观粘度(KPa· S) 4.045 ；贮存粘度(KPa· S) 3.932。实施例21.壳聚糖微球的制备1)取30g壳聚糖，溶于1 %醋酸溶液600mL中，用搅拌机在200rpm搅拌10分
钟，配成壳聚糖胶体溶液；2)将4% NaOH 500mL和90 %乙醇溶液IOOmL混合，配成凝结液；3)用5号注射器将壳聚糖溶液滴入到凝结液中制成微球，20°C下放置3小时，用 蒸馏水反复洗涤微球至中性，4°C下冷藏；2.谷氨酰胺转氨酶的固定化(1)取30g壳聚糖微球，溶于3%戊二醛溶液90mL中，30°C下恒温振荡1小时， 用蒸馏水反复洗涤至微球不含游离戊二醛为止；(2)向微球中添加20%谷氨酰胺转氨酶酶液300mL，30°C恒温振荡1小时。用 pH 7.0的磷酸缓冲液反复洗涤微球，直至未交联的游离酶被洗尽，即得固定化酶，于4°C 冰箱中保存备用。3.搅拌型酸奶的制备1)向500mL牛奶中添加IOg白砂糖和1.5g大豆分离蛋白，搅拌均勻，在30Mpa
下高压均质；2)85°C下加热10分钟，冷却至43°C。3)添加25g固定化谷氨酰胺转氨酶和20mL的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌(两 种乳酸菌的比例为1 10)，固定化酶添加的具体方法是将该酶分成3份，用灭菌后的单 层纱布包裹，用灭菌后的线绳系口，并留一段线绳在发酵容器外；4)43°C下发酵2小时，制成酸奶；5)取出用纱布包裹着的固定化酶，将酸奶冷却至18°C，添加30g果酱或果粒， 用搅拌机在40rpm的条件下搅拌5分钟；6)将酸奶分装到销售容器中，在0°C下后熟24小时，即得搅拌型酸奶。4.所得产品检测参数感官指标微黄色，状态近似炼乳状，无乳清析出，质地均勻一致，无砂质、 片状或糊状感，口感细腻，甜酸适中，具有浓郁的水果风味。酸度(°T) ； 87.6 ；持水力(％) 56.9 ；乳清析出率(％ ) 37.5 ；表观粘度(KPa· S) 3.9942 ；贮存粘度(KPa· S) 3.903。实施例31)取IOg壳聚糖，溶于1 %醋酸溶液400mL中，用搅拌机在50rpm搅拌40分
钟，配成壳聚糖胶体溶液；2)将10 % NaOH 400mL和60 %乙醇溶液300mL混合，配成凝结液；3)用7号注射器将壳聚糖溶液滴入到凝结液中制成微球，30°C下放置1小时，用蒸馏水反复洗涤微球至中性，4°C下冷藏；2.谷氨酰胺转氨酶的固定化(1)取IOg壳聚糖微球，溶于戊二醛溶液IOOmL中，15°C下恒温振荡3小 时，用蒸馏水反复洗涤至微球不含游离戊二醛为止；(2)向微球中添加5%谷氨酰胺转氨酶酶液30mL，20°C恒温振荡3小时。用pH 7.0的磷酸缓冲液反复洗涤微球，直至未交联的游离酶被洗尽，即得固定化酶，于4°C冰 箱中保存备用。3.搅拌型酸奶的制备1)向500mL牛奶中添加50g白砂糖和7.5g大豆分离蛋白，搅拌均勻，在20Mpa
下高压均质；2)95°C下加热3分钟，冷却至43°C。3)添加5g固定化谷氨酰胺转氨酶和IOmL的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌(两 种乳酸菌的比例为1 1)，固定化酶添加的具体方法是将该酶分成10份，用灭菌后的单 层纱布包裹，用灭菌后的线绳系口，并留一段线绳在发酵容器外；4)40°C下发酵4小时，制成酸奶；5)取出用纱布包裹着的固定化酶，将酸奶冷却至18°C，添加IOg果酱或果粒， 用搅拌机在20rpm的条件下搅拌20分钟；6)将酸奶分装到销售容器中，在6°C下后熟12小时，即得搅拌型酸奶。4.所得产品检测参数感官指标微黄色，状态近似炼乳状，无乳清析出，质地均勻一致，无砂质、 片状或糊状感，口感细腻，甜酸适中，具有浓郁的乳酸发酵香味。酸度T)； 89.4 ；持水力(%) ； 58.1 ；乳清析出率(％ ) 36.6 ；表观粘度(KPa· S) 4.058 ；贮存粘度(KPa· S) 3.949。添加固定化酶搅拌型酸奶与对照和市售酸奶品质的比较，见表1。表1不同处理搅拌型果肉酸奶品质的比较
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权利要求
1.一种固定化谷氨酰胺转氨酶，其特征在于通过下述制备方法制成1)将壳聚糖按料液比1 20 1 40的比例溶于醋酸溶液中，用搅拌机在50 200rpm的条件搅拌10 40分钟，配成壳聚糖胶体溶液；2)将浓度4 10%的NaOH溶液和浓度30 90%乙醇溶液按50 1 5 6的比 例配成凝结液；3)用5 7号注射器将壳聚糖溶液滴入到凝结液中制成壳聚糖微球，20 30°C下放 置1 3小时，用蒸馏水反复洗涤至中性，4°C下冷藏备用；4)将壳聚糖微球按料液比1 3 1 10的比例溶于1 3%的戊二醛溶液中，在 15 30°C下恒温振荡1 3小时，用蒸馏水反复洗涤至微球不含游离戊二醛为止；5)将壳聚糖微球按料液比1 3 1 10的比例加入5 20%谷氨酰胺转氨酶液， 在20 30°C的温度下恒温振荡1 3小时，用pH 7.0的磷酸缓冲液反复洗涤微球至未交 联的游离酶被洗尽，即得固定化酶，4°C下冷藏备用。
2.如权利要求1所述的固定化谷氨酰胺转氨酶的制备方法，其特征在于1)将壳聚糖按料液比1 20 1 40的比例溶于醋酸溶液中，用搅拌机在50 200rpm的条件搅拌10 40分钟，配成壳聚糖胶体溶液；2)将浓度4 10%的NaOH溶液和浓度30 90 %乙醇溶液按50 1 5 6的比 例配成凝结液；3)用5 7号注射器将壳聚糖溶液滴入到凝结液中制成壳聚糖微球，20 30°C下放 置1 3小时，用蒸馏水反复洗涤至中性，4°C下冷藏备用；4)将壳聚糖微球按料液比1 3 1 10的比例溶于1 3%的戊二醛溶液中，在 15 30°C下恒温振荡1 3小时，用蒸馏水反复洗涤至微球不含游离戊二醛为止；5)将壳聚糖微球按料液比1 3 1 10的比例加入5 20%谷氨酰胺转氨酶液， 在20 30°C的温度下恒温振荡1 3小时，用pH 7.0的磷酸缓冲液反复洗涤微球至未交 联的游离酶被洗尽，即得固定化酶，4°C下冷藏备用。
3.如权利要求1所述的固定化谷氨酰胺转氨酶可应用于搅拌型酸奶的制作，其特征在 于，在酸奶中按10 50g/L的比例添加固定化谷氨酰胺转氨酶和按3 15g/L的比例添 加大豆分离蛋白。
4.如权利要求3所述的搅拌型酸奶，其特征在于按下述方法制备一种利用固定化酶生产搅拌型酸奶的工艺方法1)向牛奶中按20 100g/L的比例添加白砂糖和3 15g/L的比例添加大豆分离蛋 白并搅拌均勻；2)将步骤1中配制好的原料在20 30Mpa下高压均质，然后85 95°C下加热3 IOmin,冷却至 43 0C ；3)向冷却好的原料中按10 50g/L的比例添加按上述方法制作的固定化谷氨酰胺转 氨酶和体积百分比2 4%的比例添加保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌，两种乳酸菌的比例 为1 1 1 10，固定化谷氨酰胺转氨酶添加的具体方法是将固定化酶分成3 10份， 用灭菌后的单层纱布包裹，用灭菌后的线绳系口，将纱布包浸入牛奶，并留一段线绳在 发酵容器外；4)将3)中准备好的原料在40 43°C下发酵2 4小时，制成酸奶；5)取出用纱布包裹着的固定化酶，将发酵好的酸奶冷却至18°C，用搅拌机在20 40rpm的条件下搅拌5 20分钟；6)将5)中搅拌好的酸奶分装到销售容器中，再在0 6°C下后熟12 24h，即得搅 拌型酸奶。7)将固定化酶取出后，用无菌水清洗干净，放在4°C冰箱中冷藏，可反复使用10次 以上。
全文摘要
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种固定化酶的生产及应用，本发明对谷氨酰胺转氨酶进行固定化处理得到固定化谷氨酰胺转氨酶，并将该固定化酶应用在酸奶的生产中。以牛奶为原料，利用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为菌株进行发酵，在生产过程中添加固定化谷氨酰胺转氨酶和大豆分离蛋白，提供一种不需要添加化学稳定剂和增稠剂的搅拌型绿色酸奶产品，由于固定化酶可多次反复使用，本发明具有生产成本低，工艺简单，产品稳定性好的特点。
文档编号C12N11/04GK102010859SQ201010294259
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者刘长江, 孙婧, 岳喜庆, 常南, 张春红 申请人:沈阳农业大学