专利名称：一种从黄单胞菌中提取α-葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法
技术领域：
一种胞内酶的分离纯化方法，本发明涉及一种以离子交换色谱和凝胶色谱相结合的方法，从黄单胞菌中提取a-葡萄糖基化丁香酚合成酶的的方法属于生物制品分离纯化领域。
背景技术：
丁香酚是丁香及丁香罗勒油的 主要成分，广泛存在于丁香油、肉豆蘧油、樟脑油等芳香油中。因其具有其抗氧化、镇痛、抑菌、抗肿瘤、促进透皮吸收及芳香气味等作用及优点，在医药、食品及日化领域已有应用。但其易升华、有刺激性气味、难溶于水等性质，限制了它的进ー步应用。已有研究表明经经葡萄糖基化修饰的丁香酚溶解度有大幅増加，且可用作生发剂中的添加剤。目前,合成a_ 葡萄糖基化丁香酹(eugenyl a-D-glucopyranonside, a-EG)的主要途径仍是采用微生物发酵法。由于丁香酚具有杀菌作用，利微生物发酵法合成a-EG时受到底物浓度的限制；同时，这种方法操作复杂，后期纯化困难，不利于大規模生产。因此，对a -EG合成酶进行分离纯化，不仅利于a -EG的大規模生产，同时为研究a _EG合成酶的性质及后期进行蛋白质测序、构建基因工程菌打下基础。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种a -EG合成酶的分离纯化方法，该方法采用离子交換色谱和凝胶色谱相结合的手段对胞内a -EG合成酶进行分离纯化，使之达到电泳纯，该方法操作简单，所用仪器少，可快速实现a -EG合成酶的分离纯化。本发明是提取黄单胞菌内的a-EG合成酶，エ艺步骤为(I)粗酶液的获得将培养一定时间的黄单胞菌发酵液离心，弃上清，沉淀即为菌体细胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶，在冰浴中超声破碎，而后8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。(2)硫酸铵沉淀在粗酶液中缓慢加入固体硫酸铵粉末至30% (w/v)饱和度，期间不断搅拌，4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃沉淀；上清液加硫酸铵至45% (w/v)饱和度,4°C下静置4-24h，12000r/min离心15min，弃上清液，沉淀即为所需酶液。⑶透析除盐将酶沉淀用适量的缓冲液溶解，并在相同缓冲液中透析，期间不断更换缓冲液，直到检测不出SO广为止。8000r/min离心5min,弃沉淀。(4) DEAE-纤维素离子交换层析待酶液全部进入离子交换纤维素后，用3倍柱体积的缓冲液(pH7. 0)洗脱至A-不变。然后分别用含有0-1. Omol/LNaCl的缓冲液(pH7. 0)进行梯度洗脱，流速为I. 5mL/min,收集具有酶活的部分。(5) Sephadex G-75 凝胶层析将收集到的有活性的酶液用超滤离心管(截留分子量IOKDa)浓缩至2mL，加入经缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶S印hadex G-75层析柱进行层祈。待样品完全进入凝胶后，以流速为0. 5mL/min进行洗脱，收集具有酶活性的部分，即得电泳纯a -EG合成酶。本发明中，所用缓冲液0. 05mol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液(pH7. 0)。本发明中，步骤(4)所用的离子交换纤维可为DEAE-32型或DEAE-52型机子交換纤维，但DEAE-52型离子交换纤维属预溶胀纤维素，在分离和再生过程中表现出良好的性能，优选DEAE-52作为离子交換吸附。
具体实施方案实施例I(I)粗酶液的获得将培养48h的黄单胞菌发酵液IL于5000r/min离心，弃上清，沉淀即为菌体细胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶，在冰浴中破碎30min (5s/5s, 300w)，而后8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。(2)硫酸铵沉淀在粗酶液中加入固体硫酸铵粉末至30% (w/v)饱和度，期间不断搅拌，4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃沉淀；上清液加硫酸铵至45 % (w/v)饱和度,4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃上清液,沉淀即为所需酶液。(3)透析除盐将酶沉淀用适量的缓冲液溶解，并在相同缓冲液中透析，期间不断更换缓冲液，直到检测不出S042_为止。8000r/min离心5min,弃沉淀。(4) DEAE-纤维素离子交换层析将一定量的DEAE-52离子交换树纤维加入到经透析的酶液中，1200r/min振荡30min，待酶液全部进入离子交换纤维素后，将将酶液过滤，收集离子交换纤维，双蒸水清洗数次，使用标准操作装柱。然后分别用含有0-l.Omol/L NaCl的缓冲液(pH7. 0)进行梯度洗脱，流速为I. 5mL/min，收集具有酶活的部分，所得酶液酶活为79U/mg，蛋白浓度为
I.29mg/mL。(5) Sephadex G-75 凝胶层析将收集到的有活性的酶液用超滤离心管(截留分子量IOKDa)浓缩至2mL，加入经缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶S印hadex G-75层析柱中进行层祈，以流速为0. 5mL/min进行洗脱，收集具有酶活性的部分，即得电泳纯a-EG合成酶，所得酶液酶活为125.4U/mg，蛋白浓度为 0. 455mg/mL。冻干后得干酶0. 1367g，蛋白收率为10. 7 %，比活较未纯化之前提高了115. 9U/mg，酶活提高了 20倍。实施例2(I)粗酶液的获得将培养48h的黄单胞菌发酵液IL于5000r/min离心，弃上清，沉淀即为菌体细胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶，在冰浴中破碎30min (5s/5s, 300w)，而后8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。(2)硫酸铵沉淀在粗酶液中加入固体硫酸铵粉末至30% (w/v)饱和度，期间不断搅拌，4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃沉淀；上清液加硫酸铵至45 % (w/v)饱和度,4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃上清液,沉淀即为所需酶液。(3)透析除盐将酶沉淀用适量的缓冲液溶解，并在相同缓冲液中透析，期间不断更换缓冲液，直到检测不出S042_为止。8000r/min离心5min,弃沉淀。(4) DEAE-纤维素离子交换层析 将透析过的酶液用聚こニ醇6000包埋浓缩至2mL, 8000r/min离心弃沉淀,加入经平衡后的DEAE-52离子交換柱。待酶液全部进入离子交换纤维素后，用3倍柱体积的缓冲液(PH7. 0)洗脱至A■不变。然后分别用含有0-1. Omol/L NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，流速为I. 5mL/min，收集具有酶活的部分。所得酶液酶活为83U/mg，蛋白浓度为I. 30mg/mL。(5) Sephadex G-75 凝胶层析 将收集到的有活性的酶液用超滤离心管(截留分子量IOKDa)浓缩至2mL，加入经缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶S印hadex G-75层析柱中进行层祈。待样品完全进入凝胶后，以流速为0. 5mL/min进行洗脱，收集具有酶活性的部分，即得电泳纯a-EG合成酶。所得酶液酶活为127. lU/mg,蛋白浓度为0. 450mg/mL。冻干后得干酶0. 1371g，蛋白收率为11. 1%，比活较未纯化之前提高了117. 6U/mg，酶活提高了 21倍。实例3(I)粗酶液的获得将培养48h的黄单胞菌发酵液IL于5000r/min离心，弃上清，沉淀即为菌体细胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶，在冰浴中破碎20min (2s/2s, 200w)，而后8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。(2)硫酸铵沉淀在粗酶液中加入固体硫酸铵粉末至30% (w/v)饱和度，期间不断搅拌，4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃沉淀；上清液加硫酸铵至45 % (w/v)饱和度,4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃上清液,沉淀即为所需酶液。(3)透析除盐将酶沉淀用适量的缓冲液溶解，并在相同缓冲液中透析，期间不断更换缓冲液，直到检测不出S042_为止。8000r/min离心5min,弃沉淀。(4) DEAE-纤维素离子交换层析将透析过的酶液用聚こニ醇6000包埋浓缩至2mL, 8000r/min离心弃沉淀,加入经平衡后的DEAE-52离子交換柱。待酶液全部进入离子交换纤维素后，用3倍柱体积的缓冲液(PH7.0)洗脱至A28tl不变。然后分别用含有0-1. Omol/LNaCl的缓冲液进行梯度洗脱，流速为I. 5mL/min，收集具有酶活的部分。所得酶液酶活为73U/mg，蛋白浓度为I. 34mg/mL。(5) Sephadex G-75 凝胶层析
将收集到的有活性的酶液用超滤离心管(截留分子量IOKDa)浓缩至2mL，加入经缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶S印hadex G-75层析柱中进行层祈。待样品完全进入凝胶后，以流速为0. 5mL/min进行洗脱，收集具有酶活性的部分，即得电泳纯a-EG合成酶。所得酶液酶活为121. 4U/mg,蛋白浓度为0 . 458mg/mL。冻干后得干酶0. 1385g，蛋白收率为11.6%，比活较未纯化之前提高了115. lU/mg，酶活提高了 19倍。
权利要求
1. 一种从黄单胞菌中提取a-葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法，其特征包括以下步骤 (1)粗酶液的获得 将培养一定时间的黄单胞菌发酵液离心，弃上清，沉淀即为菌体细胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶，在冰浴中破碎30min (5s/5s，300w)，而后8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。
(2)硫酸铵沉淀 在粗酶液中缓慢加入固体硫酸铵粉末至30% (w/v)饱和度，期间不断搅拌，4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃沉淀；上清液加硫酸铵至45 % (w/v)饱和度,4°C下静置4-24h, 12000r/min离心15min,弃上清液,沉淀即为所需酶液。
(3)透析除盐 将酶沉淀用适量的缓冲液溶解，并在相同缓冲液中透析，期间不断更换缓冲液，直到检测不出S042_为止。8000r/min离心5min,弃沉淀。
(4)DEAE-纤维素离子交换层析 待酶液全部进入离子交换纤维素后，用3倍柱体积的缓冲液(pH7. 0)洗脱至A28tl不变。然后分别用含有0-1. Omol/LNaCl的缓冲液(pH7. 0)进行梯度洗脱，流速为I. 5mL/min,收集具有酶活部分。(5)Sephadex G-75 凝胶层析 将收集到的有活性的酶液用超滤离心管(截留分子量IOKDa)浓缩至2mL左右，加入经缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶S印hadex G-75层析柱进行层祈。待样品完全进入凝胶后，以流速为0. 5mL/min进行洗脱，收集具有酶活性的部分，即得电泳纯a -EG合成酶。
所述步骤(2)中硫酸铵第一次添加浓度为30% (w/v)饱和度，第二次添加浓度为45%(w/v)饱和度。
步骤(4)中所述 NaCl 浓度梯度洗脱采用 0. Imol/L、0. 2mol/L、0. 3mol/L、0. 4mol/L、·0. 5mol/L和I. OmoI/L浓度的NaCl缓冲液。
全文摘要
一种从黄单胞菌中提取α-葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法，属于生物制品分离纯化领域。工艺流程为细胞培养→超声破碎→硫酸铵沉淀→透析→DEAE-离子交换层析→Sephadex G75凝胶层析→冷冻干燥，使用该方法提取的纯酶酶活最高可达127.1U/mg，收率为11.1％。本发明操作简单，所用仪器少，可快速实现α-EG合成酶的分离纯化。
文档编号C12N9/00GK102787103SQ20111012872
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者张淑荣, 张鹏, 苑丽辉, 许伟坚, 陈畅 申请人:北京化工大学