专利名称：一种重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种联合诱导低成本制备重组右旋糖酐蔗糖酶的方法以及由此酶催化生产生物多糖和单糖的方法，特别涉及重组右旋糖酐蔗糖酶采用间隙振荡的酶催化方法，一步法催化合成右旋糖酐与果糖的方法。
背景技术：
右旋糖酐蔗糖酶(DextransucrashEC 2. 4. 1. 5)是一种由肠膜状明串珠菌 (Xeuconstoc mesenteriodes)产生的葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferases),由 1250 到1600个不同的氨基酸构成，分子量约为170KDa，其在多糖类药物合成、药用果糖、色谱分离介质和保健食品的制备等多个领域均具有重要应用。该酶的催化是以蔗糖为底物，将蔗糖分子中D-葡萄糖基催化转移形成D -glucosyl-Enzyme，并释放出果糖，其结果生成两类重要产品①催化合成不同分子量右旋糖酐；②制备高纯的药用果糖。右旋糖酐(dextran)是由若干葡萄糖脱水形成的聚合物，主要由α (1_6)苷键连接。因其具有安全、无毒、生物相容性好等多种优点，已被广泛应用于医药、食品等多个方面。临床应用有三种规格右旋糖酐70、右旋糖酐40和右旋糖酐20，是一种优良的血容量补充药，同时也是生产补血药右旋糖酐铁的重要原料。分子量7万左右的右旋糖酐是目前公认的优良血浆代用品之一，有增加血容量作用，临床主要用于治疗失血性休克；分子量4 万和2万左右的右旋糖酐具有改善微循环作用，主要通过解除红细胞聚集，减少血液粘度等作用而改善微循环，同时也具有一定的补充血容量作用。果糖是一种左旋性的六碳糖，在人体内代谢比葡萄糖快，容易被机体吸收，且不依赖胰岛素，对血糖影响很小，适用于葡萄糖代谢及肝功能不全的患者补充能量，同时它还具有促进有益细菌繁殖，改善肠功能和代谢，不致龋齿等特性，因此果糖是糖尿病人、肥胖病人、儿童食品的理想甜味剂。运动前摄入果糖不会引起低血糖症，而通常如果在超长时间锻炼后摄入快速吸收的碳水化合物将引起此类低血糖症。欧、美、日和我国均已将果糖列入药典，作为口服或注射用，特别是葡萄糖代谢障碍者(糖尿病人)适用。目前国内生产右旋糖酐工艺主要采用厌氧发酵、乙醇捏洗、盐酸水解、乙醇划分等。该工艺乙醇消耗量大，生产环境恶劣，发酵过程中菌体与葡聚糖互相缠绕而使菌体不能除去，生产中又引入了杂氮、氯离子、硫酸盐灰分等杂质，致使其产品质量指标达不到日本、 欧美的药典标准，无法进入国际市场，缺少竞争力；而且杂质含量高的药用右旋糖酐导致临床过敏性副反应多。国内对右旋糖酐生产工艺研究仅限于在传统发酵工艺中对发酵液过滤，水解、分级划分等单元操作的改进，不能从工艺本质上提高产品质量。本发明人于2005年从肠膜状明串珠菌中克隆获得了此酶的完整基因 / ^^ (GenBank No. DQ345760)。然后以此基因为基础构建了能高效表达的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌，该基因工程菌已经获得了专利(ZL 200710134765. 4)。本发明从拥有自主知识产权的基因工程菌BL21 (DE3)/pET28-dexYG入手，获得成本较低的IPTG与乳糖联合诱导制备重组右旋糖酐蔗糖酶的方法，并利用重组右旋糖酐蔗糖酶采用间隙振荡的酶催化方法，一步法生产右旋糖酐和果糖，大幅提高了转化效率。实现一酶多用、回收果糖，降低了成本， 提高产品质量，并解决了右旋糖酐原生产工艺中付产物果糖对环境的污染问题。
发明内容
本发明的目的在于运用成本较低的IPTG与乳糖联合诱导法制备游离重组右旋糖酐蔗糖酶，然后以此重组酶基础，由底物蔗糖开始采用间隙振荡的酶催化方法一步制备右旋糖酐和果糖，此生产方法取代由肠模状明串珠菌生产右旋糖酐的工艺，避免随着细菌的生产过程中出现的菌体，消除杂蛋白，提高产品质量；实现一酶多用、回收果糖，降低了成本，并解决了右旋糖酐原生产工艺中付产物果糖对环境的污染问题。本发明的重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法，包括下述步骤
(1)游离重组右旋糖酐蔗糖酶的制备将基因工程菌株BL21(DE;3)/pEI^8-deXYG转接到含40-60 μ g/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中，并于35_40°C下培养15_1他，再将其接种到产酶培养基B中于35-40°C下发酵培养，当0D_=2. 5-4. 0时，采用IPTG与乳糖联合诱导至IPTG终浓度为0. 07-0. 12 mmol/L、乳糖终浓度为2. 0 -3. Og/L，诱导温度为20_30°C，诱导时间为4- ；培养后的液体于0-5°C离心得菌体后加入pH5. 4醋酸缓冲液，超声破碎，离心取上清液即得重组右旋糖酐蔗糖酶液；
(2)以重组右旋糖酐蔗糖酶催化合成右旋糖酐和果糖采用下述步骤
(a)用50mL的5mmol/L的pH5.4乙酸-乙酸钠缓冲液溶解10_15g蔗糖配制酶底物反应液；再向其中加入酶活70-170u/ml的重组右旋糖酐蔗糖酶液10-15 mL后，用5mmol/L的 PH5. 4乙酸-乙酸钠缓冲液定容到IOOmL ；
(b)在25-30°C下反应开始时采用振荡器对反应液进行120n/min振荡5h，然后静置反应5h，依此交替进行反应，22-25h后结束催化反应；
(c)将催化后的反应液进行醇沉洗涤，真空干燥称重，得到高分子右旋糖酐，将醇沉液经过离心过滤去除大分子杂质，再经过超滤去除小分子低聚糖、滤液经过真空浓缩、喷雾干燥得到果糖。本发明中所述步骤(1)中培养基B用于大肠杆菌的发酵和酶的诱导，其中含有甘油、蛋白胨及培养基常用的无机盐组分，其可采用如下配方
培养基B的成分甘油5g/L ；蛋白胨(trypyone) 10 g/L ；硝酸钾10 g/L ；MgSO4 0. 1 mmol/L ；NH4Cl 1 g/L ；Na2HPO4 · 7H20 12. 8 g/L 或者 Na2HPO4 · 12H20 17. 1 g/L ；KH2P043g/L。本发明中所述步骤(1)中发酵培养时，采用IPTG与乳糖联合诱导法制备右旋糖酐蔗糖酶，优选当0D_=3. 0时，采用IPTG与乳糖联合诱导至最佳终浓度分别为0. 09mmol/L和 2. 5g/L，诱导培养25°C。本发明中所述步骤(2)中优选加入的重组右旋糖酐蔗糖酶液的酶活为145-170U/ ml ο本发明中的基因工程菌BL21 (DE3)/pEI^8-dexYG菌种接种、培养与富集可采用下述方式
从斜面中用接种环挑取菌体，转接到20mL新鲜LB培养基(含卡那50 yg /mL)中， 37°C、300r/min过夜培养，培养时间为16_1他。再按照1%的接种量接种过夜培养的菌液到
培养基B中发酵培养。
发酵液于37°C、300r/min培养，前池每小时取发酵液lmL，用无菌水稀释10倍，以培养基作对照，测量0 ,之后每1. 5h取发酵液lmL，用无菌水稀释10倍，以培养基作对照，测量0D_。当0D_=3. 0-4.0，发酵培养结束，转入下一步诱导产酶。LB培养基配方如下
LB平板固体培养基用于菌体的筛选，斜面固体培养基用于菌体短期(约1个月)保藏， LB液体培养基用于菌体的过夜培养。LB培养基的成分胰蛋白胨(bacto-trypyone) 10 g/L ；酵母浸膏(yeast extract) 5 g/L ；NaCl 10 g/L ；蒸馏水 1000 mL,用 1 mol/L 的 NaOH 或者 HCl 调 pH 值为 7.0,0. IMPa灭菌20min，用前加入卡那霉素至50ug/mL。固体培养基还需加入1. 5-2%的琼脂，0. IMPa灭菌20min，待冷却到50-60°C时，加入卡那霉素至50ug/mL，冷却成斜面或者平板。培养基B用于大肠杆菌的发酵和酶的诱导，配方如下
培养基B的成分甘油5g/L;蛋白胨(trypyone) 10 g/L ；硝酸钾10 g/L ；MgSO4 0. 1 mmol/L ；NH4Cl 1 g/L ；Na2HPO4 · 7H20 12. 8 g/L 或者 Na2HPO4 · 12H20 17. 1 g/L ；KH2P043g/L。在制备右旋糖酐之前，先检测所制备的右旋糖酐蔗糖酶的活力，右旋糖酐蔗糖酶活力的测定采用3，5_ 二硝基水杨酸试剂法测还原糖的量(DNS法)。步骤为取5mL发酵液，8000r/min 离心 lOmin，取上清液 2ml (酶液)与 2ml 底物(0· 2M NaAc 860mL, 0. 2M HAc 140ml,蔗糖100g, ρΗ5· 4)混合，取出0. 5ml加入0. 375ml DNS试剂，在沸水浴中加热5min， 待其冷却到室温后，加入5. 375ml蒸馏水，摇勻放入冰箱作为空白。余下的混合溶液25°C下培养60min，取出0. 5mL加入0. 375ml DNS试剂，在沸水浴中加热5min，待其冷却到室温后， 加入5. 375ml蒸馏水，摇勻。在520nm波长下，测其OD值。同时配制标准曲线，从标准曲线上查出酶液的果糖含量，计算在各种培养条件下右旋糖酐蔗糖酶的酶活力。酶活力定义 在35°C下，每小时催化底物蔗糖产生0. Img果糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。本发明提供了一种利用基因工程菌株BL21 (DE3)/pEI^8-dexYG并采用IPTG与乳糖联合诱导法制备游离的重组右旋糖酐蔗糖酶，此法大幅降低由IPTG单独诱导时的制酶成本、活性高，有利于规模化生产。同时，利用本发明的成本低、活力高的游离重组右旋糖酐蔗糖酶，采用间隙振荡的酶催化方法，一步催化合成右旋糖酐和果糖，转化率高。实现一酶多用、回收果糖，降低了成本，并解决了右旋糖酐原生产工艺中付产物果糖对环境的污染问题。
具体实施例方式实施例1
(1)联合诱导制备重组右旋糖酐蔗糖酶发酵
基因工程菌株BL21 (DE3) /pET28-dexYG,从斜面中转接到20mL新鲜LB培养基(含卡那50 yg /mL)中，37°C、300r/min过夜培养，培养时间为16h，再按照1%的接种量接种到培养基B中发酵培养。发酵液于37°C、300r/min培养，每小时取发酵液lmL，用无菌水稀释 10倍，测量0D_。采用IPTG与乳糖联合诱导法制备右旋糖酐蔗糖酶，当0D_=3. 0时，加入IPTG至终浓度为0. 09 mmol/L,乳糖终浓度2. 5g/L，于25°C、300r/min诱导培养，诱导时间为4h。发酵后的液体在4°C、12000r/min离心15min得菌体后加入pH5. 4醋酸缓冲液，超声破碎 IOmin,离心取上清液得粗酶液，酶活达到145 160U/mL，降低了由IPTG单独诱导时的制酶成本。(2)应用上述联合诱导的重组右旋糖酐蔗糖酶采用间隙振荡的酶催化方法，一步法催化合成右旋糖酐及果糖，步骤为
1)酶底物反应液配制用50mL的5mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.4)溶解14g蔗糖，不同体积可按此比例配制；
2)按底物反应液在上述50mL酶底物反应液加入酶活为145 160U/mL的酶液15 mL后，用相同缓冲液定容到IOOmL ；
3)上述混合液在25°C、采用间隙振荡的酶催化方法，可以大幅提高转化效率。即反应开始时采用振荡器对反应液进行120n/min振荡证，然后静置反应5h，依此交替进行反应， 2 后结束催化反应；
4)将催化后的反应液进行醇沉洗涤，真空干燥称重，得到高分子右旋糖酐，将醇沉液经过离心过滤去除大分子杂质，再经过超滤去除小分子低聚糖、滤液经过真空浓缩、喷雾干燥得到果糖，摩尔转化率达到90%。
实施例2
(1)联合诱导制备重组右旋糖酐蔗糖酶发酵2
基因工程菌株BL21 (DE3) /pET28-dexYG,从斜面中转接到20mL新鲜LB培养基(含卡那50ug/mL)中，37°C、300r/min过夜培养，培养时间为16h，再按照1%的接种量接种到培养基B中发酵培养。发酵液于37°C、300r/min培养，每小时取发酵液lmL，用无菌水稀释10 倍，测量0D_。当0D_=3. 5时，采用IPTG与乳糖联合诱导法制备右旋糖酐蔗糖酶至IPTG终浓度为0. 12 mmol/L、乳糖终浓度为3. Og/L，于、300r/min诱导培养，诱导时间为釙。发酵后的液体在4°C、12000r/min离心15min得菌体后加入pH5. 4醋酸缓冲液，超声破碎lOmin， 离心取上清液得粗酶液，酶活达到160 170U/mL。(2)应用上述联合诱导的重组右旋糖酐蔗糖酶采用间隙振荡的酶催化方法，一步法催化合成右旋糖酐及果糖，步骤为
1)酶底物反应液配制用50mL的5mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.4)溶解14g蔗糖，不同体积可按此比例配制；
2)按底物反应液在上述50mL酶底物反应液加入酶活为160 170U/mL的酶液10mL 后，用相同缓冲液定容到IOOmL ；
3)上述混合液在30°C采用间隙振荡的酶催化方法，即反应开始时采用振荡器对反应液进行120n/min振荡5h，然后静置反应5h，依此交替进行反应，2 后结束催化反应，大幅提高了转化效率。(4)将催化后的反应液进行醇沉洗涤，真空干燥称重，得到高分子右旋糖酐，将醇沉液经过离心过滤去除大分子杂质，再经过超滤去除小分子低聚糖、滤液经过真空浓缩、 喷雾干燥得到果糖。摩尔转化率达到95%。
权利要求
1.一种重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于包括下述步骤(1)游离重组右旋糖酐蔗糖酶的制备将基因工程菌株BL21(DE;3)/pEI^8-deXYG转接到含40-60 μ g/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中，并于35_40°C下培养15_1他，再将其接种到产酶培养基B中于35-40°C下发酵培养，当0D_=2. 5-4. 0时，采用IPTG与乳糖联合诱导至IPTG终浓度为0. 07-0. 12 mmol/L、乳糖终浓度为2. 0 -3. Og/L，诱导温度为20_30°C，诱导时间为4- ；培养后的液体于0-5°C离心得菌体后加入pH5. 4醋酸缓冲液，超声破碎，离心取上清液即得重组右旋糖酐蔗糖酶液；(2)以重组右旋糖酐蔗糖酶催化合成右旋糖酐和果糖采用下述步骤(a)用50mL的5mmol/L的pH5.4乙酸-乙酸钠缓冲液溶解10_15g蔗糖配制酶底物反应液；再向其中加入酶活70-170u/ml的重组右旋糖酐蔗糖酶液10-15 mL后，用5mmol/L的 PH5. 4乙酸-乙酸钠缓冲液定容到IOOmL ；(b)在25-30°C下反应开始时采用振荡器对反应液进行120n/min振荡5h，然后静置反应5h，依此交替进行反应，22-25h后结束催化反应；(c)将催化后的反应液进行醇沉洗涤，真空干燥称重，得到高分子右旋糖酐，将醇沉液经过离心过滤去除大分子杂质，再经过超滤去除小分子低聚糖、滤液经过真空浓缩、喷雾干燥得到果糖。
2.如权利要求1所述的重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于所述步骤 (1)中培养基B用于大肠杆菌的发酵和酶的诱导，其中含有甘油、蛋白胨及培养基常用的无机盐组分。
3.如权利要求1所述的重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于所述步骤(1)中发酵培养时，当0D_=3.0时，采用IPTG与乳糖联合诱导法制备右旋糖酐蔗糖酶，加入 IPTG和乳糖的终浓度分别为0. 09mmol/和2. 5g/L，然后于25°C诱导培养。
4.如权利要求1所述的重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于所述步骤(2)中加入的重组右旋糖酐蔗糖酶液酶活为145-170u/ml。
全文摘要
本发明公开了一种重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法，其包括步骤(1)采用基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG培养制备游离重组右旋糖酐蔗糖酶；(2)以重组右旋糖酐蔗糖酶催化合成右旋糖酐和果糖。本发明提供了一种利用基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG并采用IPTG与乳糖联合诱导法制备游离的重组右旋糖酐蔗糖酶，此法大幅降低由IPTG单独诱导时的制酶成本，有利于规模化生产。同时，采用间隙振荡的酶催化方法，一步催化合成右旋糖酐和果糖，转化率高，实现了一酶多用、回收果糖，降低了成本，也解决了右旋糖酐原生产工艺中副产物果糖对环境的污染问题。
文档编号C12P19/02GK102229970SQ20111013230
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者崔维华, 张洪斌, 杨运根, 胡雪芹, 衣学福 申请人:六安华源制药有限公司, 合肥工业大学