专利名称：转基因大豆子叶rna和dna的同步抽提方法
技术领域：
本发明涉及转基因大豆子叶的RNA和DNA的同步分离纯化，具体说是使用不同蛋 白变性剂和氯化锂(LiCl)同步抽提转基因大豆子叶RNA和DNA的方法。
背景技术：
大豆是极重要的一种经济作物，富含优质蛋白、不饱和脂肪酸、钙质和保健因子。 除了直接食用外，大豆还可以制成豆腐、豆油、酱油、豆瓣酱、大豆蛋白和磷脂等加工品。随 着食用油和植物蛋白需求量的不断增加和大豆应用领域的不断扩大，大豆栽培和加工已逐 步成为重要的支柱产业。随着大豆产业的发展，在分子生物学领域开展大豆品质、产量及功能性食品的研 发等相关研究显得尤为重要。核酸抽提是上述研究的必要且重要的一步，因为核酸质量对 后续的反转录、PCR、限制性内切酶酶切、Northern杂交、文库构建等诸多实验都有显著影 响。在核酸抽提上已有一些相关的技术报道，例如在DNA抽提技术上有CTAB (十六烷 基三甲基溴化铵)法、SDS (十二烷基磺酸钠)-蛋白酶K法、LiCl法等，在RNA抽提技术上 有CTAB法、异硫氰酸胍法以及改进的TRIZOL法等。不同生物或不同组织的细胞组分和次 级代谢产物不尽相同，因此不同材料需要不同的核酸抽提方法。目前尚无转基因大豆子叶 RNA和DNA同步抽提方法的报道。通常转基因大豆的分子检测是以叶片为材料，分别独立抽提转基因大豆叶片的 RNA和DNA，需要较多样品、试剂和工序，而同步抽提RNA和DNA既能节约材料又能节约时 间。以子叶代替叶片做核酸分析还能提早对转基因大豆是否获得外源基因以及外源基因是 否表达进行检测。所以有必要研发适合转基因大豆子叶RNA和DNA同步抽提的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于转基因大豆子叶RNA和DNA同时抽提的方 法，实验简便、省时、省料，实验结果理想。获得的高纯度的核酸可以用于PCR、RT - PCR, Northern杂交、限制性内切酶酶切、文库构建等后续实验。经过多次实验探索，得出符合此目的的实验方法，各种方法及其具体步骤如下 (1)使用含蛋白变性剂(如SDS、异硫氰酸胍或CTAB中的一种或多种试剂)的偏碱性(pH
范围7. (Γ8. 5)裂解液裂解样品；
⑵加入等体积的Tris饱和苯酚/氯仿(体积比=1:1)，混勻，离心后取上清；
⑶加入等体积氯仿，混勻，离心后取上清；
⑷加入LiCl (终浓度为广3mol/L)，离心后RNA沉淀在管底；
⑶转移第⑷步的上清至新管，加入乙醇(终浓度为659Γ70%(体积比))，离心后得到DNA 沉淀；
(6) DNA沉淀经漂洗后，溶于含RNase A水中；[7]RNA溶液中加入DNase I处理，然后常规苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀经漂洗后， 于适量RNase-free水中溶解，此步为可选做步骤。
具体实施例方式方案一 SDS裂解与LiCl选择沉淀
(1)100 mg新鲜样品液氮研磨，加入1 mL SDS裂解液(0.1 mol/L Tris-Cl (pH8. 0)， 0. 5mol/L NaCl，0. 05 mol/L EDTA, 1. 5% (w/v) SDS)，室温放置 10 min ；
⑵加入等体积的iTris饱和酚(PH8. 0)与氯仿混合液(体积比=1:1)混勻，12000 rpm离 心5min后取上清；
⑶加入等体积的氯仿并混勻，12000 rpm离心5min后取上清；
(4)加入 1/4 体积 10 mol/L LiCl，静置 30 min, 12000 rpm 离心 10 min 后 RNA 沉淀在管
底；
⑶转移第⑷步的上清至新管，加入2倍体积的无水乙醇，12000 rpm离心5 min后得到 DNA沉淀；
(6)RNA和DNA沉淀分别用75%乙醇漂洗，室温干燥；
(7)RNA沉淀溶于适量RNase-free水，-70 °C保存，备用；
(8)DNA沉淀溶于含RNaseA水中，37 °C温浴30min，-20 °C保存，备用；
⑶经1.0%非变性琼脂糖电泳检测RNA和DNA，电泳条带清晰完整，无明显拖带， 点样孔无明显残留；通过Bio-red核酸蛋白定量仪测得DNA的^0/230=2. (Γ2. 4， 260/280=1. 8 2. 0，RNA 的 260/230=2. 0 2. 5,260/280=1. 9 2. 0。方案二 异硫氰酸胍裂解与LiCl选择沉淀
⑴100 mg新鲜样品液氮研磨，加入1 mL异硫氰酸胍裂解液(0. 1 mol/L Tris-Cl (pH8. 0),0. 5mol/L NaCl,0. 05 mol/L EDTA，1 mol/L 异硫氰酸胍)，室温放置 10 min ；
⑵加入等体积的iTris饱和酚(PH8. 0)与氯仿混合液(体积比=1:1)混勻，12000 rpm离 心5min后取上清；
⑶加入等体积的氯仿并混勻，12000 rpm离心5min后取上清；
(4)加入 1/4 体积 10 mol/L LiCl，静置 30 min, 12000 rpm 离心 10 min 后 RNA 沉淀在管
底；
⑶转移第⑷步的上清至新管，加入2倍体积的无水乙醇，12000 rpm离心5 min后得到 DNA沉淀；
(6)RNA和DNA沉淀分别用75%乙醇漂洗，室温干燥；
(7)RNA沉淀溶于适量RNase-free水，-70 °C保存，备用；
(8)DNA沉淀溶于含RNaseA水中，37 °C温浴30min，-20 °C保存，备用；
⑶经1.0%非变性琼脂糖电泳检测RNA和DNA，电泳条带清晰完整，无明显拖带， 点样孔无明显残留；通过Bio-red核酸蛋白定量仪测得DNA的^0/230=2. (Γ2. 4， 260/280=1. 8 2. 0，RNA 的 260/230=2. 0 2. 5,260/280=1. 9 2. 0。方案三CTAB裂解与LiCl选择沉淀
(1)100 mg 新鲜样品液氮研磨，加入 1 mL CTAB 裂解液(0.1 mol/L Tris-Cl (pH8. 0)， 1.4 mol/L NaCl,0. 05 mol/L EDTA, 2% (w/v) CTAB)，室温放置 10 min ；⑵加入等体积的iTris饱和酚(PH8. 0)与氯仿混合液(体积比=1:1)混勻，12000 rpm离 心5min后取上清；
⑶加入等体积的氯仿并混勻，12000 rpm离心5min后取上清；
(4)加入 1/4 体积 10 mol/L LiCl，静置 30 min，12000 rpm 离心 10 min 后 RNA 沉淀在管
底；
⑶转移第⑷步的上清至新管，加入2倍体积的无水乙醇，12000 rpm离心5 min后得到 DNA沉淀；
(6)RNA和DNA沉淀分别用75%乙醇漂洗，室温干燥；
(7)RNA沉淀溶于适量RNase-free水，加入DNase I处理；
⑶常规苯酚/氯仿抽提，取上清；加入0. 1倍体积2 mol/L NaCl和2倍体积的无水乙 醇，12000 rpm离心10 min后获得RNA沉淀；RNA沉淀用75%乙醇漂洗，室温干燥，适量RNase-free水溶解沉淀，-70 °C保存，备
用；DNA直接溶于含RNaseA水中，37 °C温浴30min，-20 °C保存，备用；经1.0%非变性琼脂糖电泳检测RNA和DNA，电泳条带清晰完整，无明显拖 带，点样孔无明显残留；通过Bio-red核酸蛋白定量仪测得DNA的^0/230=2. (Γ2. 4， 260/280=1. 8 2. 0，RNA 的 260/230=2. 0 2. 5,260/280=1. 85 2. 0。
权利要求
1.大豆子叶总RNA和DNA同步抽提试剂中主要包括蛋白变性剂、环境PH缓冲剂、DNase 活性抑制剂。
2.根据权利要求1所述的核酸抽提试剂，其特征在于蛋白变性剂分别为SDS(十二烷 基磺酸钠)、异硫氰酸胍或CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)，各成分在各方案中的用量依次为 1 2% (w/v)、0. 5 1. 5 mol/L、1 2% (w/v)。
3.根据权利要求1所述的核酸抽提试剂，其特征在于环境PH缓冲剂为Tris-Cl，防止 核酸被破坏，其PH值为7. 0 8· 5，浓度为0. 05 0. 2 mol/L。
4.根据权利要求1所述的核酸抽提试剂，其特征在于DNase活性抑制剂为EDTA，可螯 合Mg2+或Mn2+离子，其浓度为0. 0Γ0. 1 mol/L。
5.使用权利1所述的抽提试剂来同步抽提大豆子叶总RNA和DNA的方法，其抽提步骤 为使用含蛋白变性剂(如SDS、异硫氰酸胍或CTAB中的一种或多种试剂)的偏碱性(pH范 围7. (Γ8. 5)裂解液裂解样品；加入等体积的Tris饱和苯酚/氯仿(体积比=1:1)，混勻，离 心后取上清；加入等体积的氯仿，混勻，离心后取上清；加入LiCl (终浓度为广3mol/L)，离 心后RNA沉淀在管底；继续加入乙醇(终浓度为659Γ70%(体积比))，离心后得到DNA沉淀； DNA沉淀经漂洗后，溶于含RNase A水中；向RNA溶液中加入DNase I处理，然后常规苯酚/ 氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀经漂洗后，于适量RNase-free水中溶解，此步为可选做步骤。
全文摘要
在核酸抽提上已有一些相关的技术报道，但目前尚无转基因大豆子叶RNA和DNA同步抽提方法的报道。本发明使用偏碱性SDS、异硫氰酸胍或CTAB裂解液裂解子叶，常规苯酚/氯仿抽提，用LiCl选择性沉淀RNA，用乙醇继续沉淀DNA，沉淀的DNA用RNaseA处理，最后得到高质量的核酸。同步抽提既能节约样品、试剂、又能节约时间。对子叶做核酸分析能够在大豆刚出苗时对经过转化的大豆进行分子检测，提早确定是否将外源基因导入大豆以及外源基因是否表达。
文档编号C12N15/10GK102146376SQ201110132090
公开日2011年8月10日 申请日期2011年5月21日 优先权日2011年5月21日
发明者周向红, 易乐飞, 王萍 申请人:周向红, 易乐飞, 王萍