专利名称：用于预测乙肝病毒引起的肝癌的引物、探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物试剂，具体涉及一种用于预测乙肝病毒相关的肝癌的检测方法， 特别是涉及乙型肝炎病毒突变(C1653T, T1674C, T1753V, A1762T, G1764A, A1846T, A1858T, G1896A, G1899A, C1485T, C1499H, G1613A, C3116T 和 T53C)的检测。
背景技术：
乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)感染已成为严重危险到人类健康的全球性问题。全世界约有30亿人曾经感染过乙肝病毒，约占世界总人口的一半。近3.5亿人是 HBV 的携带者(Ganem D, Prince AM. Hepatitis B virus infection-natural history and clinical consequences. N Eng J Med 2004;350:1118-1129)。HBV 感染是引起肝细胞癌(h印atocelluar carcinoma, HCC)和肝硬化(liver cirrhosis, LC)最主要危险因素之一。流行病学调查显示，全球有80%的HCC患者是由HBV病毒感染引起，肝细胞癌是全球性癌症死亡的主要原因之一，已成为威胁人类生命健康的全球性问题( MC, Yuan JM, Govindarajan S, Ross RK. Epidemiology of hepatocellular carcinoma. Can J Gastroenterol. 2000 ； 14 (8) :703-709)。HBV属嗜肝病毒科Ofepadnaviridae)，其DNA由不完全闭合的环状双链组成，基因组全长为3. 21Λ。HBV基因组中包括4个开放阅读框(open reading freams，ORFs)，分别是 S 区，C 区，P 区和 X 区，其中 S 区分为 preSl (nucleotides 2848-3204), preS2 (nucleotides 3205-154)和S三个编码区，分别编码preSl，preS2和HBsAg蛋白。C区可分为前C区 (precore)禾口基本核心区(basal core promoter, BCP, nucleotidesl751_1769), X 区 (nucleotides 1374-1835)编码乙型肝炎 X 抗原(HBxAg)。(Kay A, Zoulim F. Hepatitis B virus genetic variability and evolution. Virus Res. 2007 ；127 (2) :164_176)。目前HBV根据核苷酸序列异质性> 8%可分为A-H共8种基因型(khaefer S.Hepatitis B virus !Significance of genotypes. J Viral Hepat. 2005 ； 12 (2) 111-124.)，根据其S基因的差别> 4%又可将HBV基因型分为若干个亚型。HBV的基因型和亚型有严格的地理分布特点，不同的地区流行的基因型不同，亚洲地区的HBV流行株为B和 C型，中东和地中海地区为D型，E型和F型分布在中非和南美地区(Chan HLY, Tsui SKff, Tse CH et al.Epidemiological and virological characteristics of subgroups of hepatitis B virus genotype C.J Infect Dis 2005;191:2022-2032)。中国是全球 HBV 流行的最主要高分发区之一，每年愈30万人因患肝癌死亡，据各癌症死亡率前列。研究HCC 早期预测的方法对于HCC的早期诊断，预防和控制具有重要意义。多项研究表明，从乙型肝炎向肝癌的发展过程中，乙型肝炎病毒突变率明显增加， 特别在乙型肝炎病毒的基本核心区和S区某些特定位点的突变与肝细胞癌的发生具有重要的联系。Laskus 等)κ (Laskus Τ, Radkowski Μ, Nowicki Μ, et al. Association between hepatitis B virus core promoter rearrangements and hepatocellular carcinoma.Biochem Biophys Res Commun. 1998 ；244 (3) :812-814.)在其研究中首次报道了在 HCC 病人中的发现了 HBV突变，发现的突变位点有A1762T，G1764A，61896和G1899A。实验通过对 53个HCC的患者和33个对照的实验，应用直接测序方法检测发现，突变点G1896和G1899A 的突变率分别是52%和33%，其对照组突变率分别为36%和6%。Baptista 等人(Baptista M, Kramvis A, Kew MC. High prevalence of 1762(T)1764(A)mutations in the basic core promoter of hepatitis B virus isolated from black Africans with hepatocellular carcinoma compared with asymptomatic carriers. Hepatology. 1999 ；29 (3) :946-953)的研究发现在肝细胞癌患者中突变点G1809T, A1762T，T1764V和C1812T有错意突变现象的发生。研究表明A1762T， T1764V在HCC病人中突变率在66%，在其对照组中为11%，突变点C1812T和G1809T也显示出较高的突变率。Ito 等人(Ito K, Tanaka Y, Orito E, et al. T1653 mutation in the box alpha increases the risk of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B virus genotype C infection. Clin Infect Dis. 2006 ；42 (1) :1-7.)石if究了来自不同的地区的HCC患者中的突变位点。研究选择了来自日本，中国香港和美国共211 个HCC患者作为研究对象，实验结果显示T1653，A1762T和T1764V的突变与肝癌的发生有较大的相关性。Yuan等人(Yuan J, Zhou B, Tanaka Y, et al. Hepatitis B virus (HBV) genotypes/ subgenotypes in China :mutations in core promoter and precore/core and their clinical implications. J Clin Virol. 2007 ；39 (2) :87-93.)的研究表明在 HCC 患者中发现了更多的突变位点，共12个突变位点被发现。其结果显示，在HBV的B/C基因型中， C1165T，A1762T，G1764A，T2712C/A/G，A/T2525C突变与HCC的发生有重要相关；而突变点 T31C, T53C,和 A1499G 的突变发生在 HBV 亚基因型 Ce 中，G1613A, G1899A, T2170C/G,和 T2441C的突变发生于HBV亚基因型Cs。Liu 等人(Liu S, Zhang HW, Gu CY, et al. Associations Between Hepatitis B Virus Mutations And the Risk of Hepatocellular Carcinoma :A Meta-Analysis. J Natl Cancer Inst 2009 ；101 ； 1066-1082)的研究进一步证明了某些突变点与HCC的发生有重要的相关。其研究结果发现G1896A，C1858T突变与HCC的发生有相关性，而C1653T，T1753V, A1762T和G1764A的突变与HCC发生有很大的相关性。尽管很多研究人员对HCC患者中的HBV相关突变做了研究，但这些研究一般都样本量较小，报道的突变位点比较单一，哪些突变位点才可以作为HCC早期预测和诊断的突变点仍没有形成统一标准。因而，需要一种可以准确快速的预测HCC方法来实现HCC的早期预防。
发明内容
本发明的目的之一，是在背景技术的研究基础之上，提供与HCC发生相关的主要 HBV突变位点。本发明的再一目的，在于提供一种用于预测肝细胞癌的引物、探针，通过对以上突变位点的检测，实现HCC的早期诊断和预防。
本发明的另一目的，在于提供一种用于预测肝细胞癌的预测试剂盒。本发明采用文献统计与实验相结合的方法进行突变位点的筛选和确认(1)统计结果表明检测突变点 C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1858T, G1896A, G1899A, C1485T, C1499H, G1613A和T53C对HCC早期预测是有重要意义的。(2)对其中4个突变点(C1653T，T1753V，A1762T，G1764A)进行了相关的实验检验，结果表明检测上述4个突变点对于HCC的预测和早期诊断是必不可少的。(3)统计数据和实验结果表明同时检测突变点C1653T，T1674C，T1753V，A1762T， G1764A, A1858T, A1846T, G1896A, G1899A, C1485T, C1499H, G1613A, C3116T 和 T53C 可用于 HCC早期预测。在以上筛选和确认基础上，本发明提供了实施HCC预测和早期诊断的一种实时荧光PCR检测HBV突变的检测方法，该方法包括以下步骤(I)PCR引物和探针的合成本发明所用的引物和探针(见表1)均交由引物合成公司合成。(2)收集乙肝病人血清样本，提取乙肝病毒DNA(3)取DNA提取物为模板，进行实时荧光PCR进行扩增；(4)根据Ct值对突变进行定性定量分析。表1引物和探针序列表
权利要求
1.用于预测乙肝病毒引起的肝癌的引物和探针的设计方法，其特征在于该引物和探针针对乙肝病毒的突变位点设计，所述的突变位点包括以下14个C1653T，T1674C， T1753V, A1762T, G1764A, A1846T, A1858T, G1896A, G1899A, C1485T, C1499H, G1613A, C3116T 和 T53C。
2.用于治疗和HCC相关的乙型肝炎病毒突变的药物的设计方法，其特征在于该药物针对乙肝病毒的突变位点设计，所述的突变位点包括以下14个C1653T，T1674C，T1753V, A1762T，G1764A，A1846T，A1858T，G1896A，G1899A，C1485T，C1499H，G1613A，C3116T 和 T53C。
3.用于检测乙型肝炎病毒突变的引物和探针，包括(1)C1653T-FAGGAACCTGCCCAAGGTCTTGT C1653T-R CACCAACTCCTCCCACTCAGTAC1653T-P FAM-TCTTGGACTTTCAGCAATGTCAAC-BHQ1 ；(2)A1762T-FCGGAGGAGGTTAGGTTAAT A1762T-R GGACATGAACATGAGATGATTAGGC A1762T-P FAM-GTGAAAAAGTTGCATGGTGCTGGT-BHQ1 ；(3)G1764A-FCGGAGGAGGTTAGGTTAAAGA G1764A-R GGACATGAACATGAGATGATTAGGC G1764A-P FAM-GTGAAAAAGTTGCATGGTGCTGGT-BHQ1 ；(4)T1753C-FACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAG T1753C-R CCTCCTAGTACAAAGACCTTTAACCTAG T1753C-P FAM-GCAATGTCAACGACCGACCTTGAG-BHQ1 ； ⑶A1846T-F CCTCTGCCTAATCATCTCTA1846T-R CACAGAAGCTCCAAATA1846T-P FAM-ACTGTTCAAGCCTCCAAGCTG-BHQ1 ；(6)T1674C-FAAGAGGACTCTTGGACTTC T1674C-R TCCACCAACTCCTCCCACTCT1674C-P FAM-CAGCAATGTCAACGACCGACCT-BHQ1 ；(7)C3116T-FTACTCACAACTGTGCCAGT C3116T-R AGGTGGAGATAAGGGAGTAC3116T-P FAM-GCCTCCACCAATCGGCAGTCA-BHQ1 ；以及(8)Primersfor sequencing Seq-F CTGCCGTTCCGGCCGACCAC Seq-R TGAGGGTTTAAATGTATACC
4.一种用于预测肝细胞癌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求3所述的引物和探针。
全文摘要
本发明公开了用于预测乙肝病毒引起的肝癌的引物、探针及试剂盒，本发明引物和探针针对乙肝病毒的突变位点设计，所述的突变位点包括以下14个C1653T，T1674C，T1753V，A1762T，G1764A，A1846T，A1858T，G1896A，G1899A，C1485T，C1499H，G1613A，C3116T和T53C。本发明通过检测HBV的14个突变位点来实现肝细胞癌的早期预测，同时提供了一种可以用于检测HBV突变点的方法。
文档编号C12Q1/70GK102277448SQ20111014684
公开日2011年12月14日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者张海龙, 曾骥孟, 王蓟斌, 郑立谋, 阮力 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司