专利名称：一种酚类物质抗性的重组克雷伯氏肺炎杆菌及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种酚类物质抗性的重组克雷伯氏肺炎杆菌及其制备方法和应用。
背景技术：
克雷伯氏肺炎杆菌Of. pneumoniae)是一种革兰氏阴性细菌，是克雷伯氏菌属的模式种，属于肠杆菌科。克雷伯氏肺炎杆菌是自然界中分布广泛性仅次于大肠杆菌的一种细菌。克雷伯氏肺炎杆菌目前主要作为2，3-丁二醇和1，3-丙二醇等化学品的生产用菌， 同时克雷伯氏肺炎杆菌可以代谢合成3-羟基丙醛、乙醇、乙偶姻、琥珀酸、乙酸、乳酸、氢气等化学品，克雷伯氏肺炎杆菌还可以作为宿主细胞构建3-羟基丙酸等化合物生产菌。其中，2，3-丁二醇是重要的化工或医药中间体原料。例如，DL构型的2，3_ 丁二醇具有很低的熔点(一 60°C )，可以作为良好的防冻剂；2，3- 丁二醇的脱水产物1，3- 丁二烯是合成橡胶的重要原料；2，3-丁二醇具有较高的燃烧热(2718 J/g)并且具有较高的辛烷值，使其成为一种环境友好的燃料添加剂；另外2，3-丁二醇还应用于药物合成等领域。克雷伯氏肺炎杆菌可以利用葡萄糖等多种碳源发酵生产2，3- 丁二醇，使用葡萄糖可以生产高达150g/L的2，3-丁二醇，生产强度达到4.218/1.11 (Ma, C., et al., Enhanced 2, 3~butanediol production by Klebsiella pneumoniae SDM. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009. 82(1) : p. 49-57)。特别是，克雷伯氏肺炎杆菌可以利用纤维素和半纤维素水解产物的几乎所有营养成分来合成2，3-丁二醇，包括葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖和木二糖等寡糖以及糖醛酸和乙酸等(Yu，Ε. and J. Saddler, Biomass conversion to butanediol by simultaneous sac char i fi cat i on and fermentation· Trends in Biotechnology, 1985. 3(4): p. 100-104.)。由于克雷伯氏肺炎杆菌不具有纤维素酶水解酶，因此，含有纤维素和半纤维素的生物质原料(例如木质纤维素原料)都需要进行预处理并水解成简单糖类才能被兄 pneumoniae利用。例如，木材水解液、秸秆水解液都能用于2，3- 丁二醇的生产。克雷伯氏肺炎杆菌利用一种木材水解液为原料发酵生产2，3-丁二醇的水平为 13. 3g/L, 0. 28 g/L h (Groverj B.，S. Gargj and J. Vermaj Production of 2， 3~butanediol from wood hydrolysate by Klebsiella pneumoniae. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1990. 6(3) : p. 328-332.)。克雷伯氏肺炎杆菌利用一种松水解液为原料发酵生产2，3-丁二醇的水平为7. 8 g/L，0. 11 g/L.h (Trm，A. md R. Chambers, Lignin and extractives derived inhibitors in the 2，3-butanediol fermentation of manηose~rich prehydroIysates. Applied Microbiology and Biotechnology, 1986. 23(3) : p. 191-197.)。可以看出，克雷伯氏肺炎杆菌利用木质纤维素原料生产2，3- 丁二醇的发酵水平很低。经过研究发现，导致克雷伯氏肺炎杆菌对木质纤维素原料水解产物的利用能力很低的一个重要原因是木质纤维素原料水解产物中所含酚类物质对克雷伯氏肺炎杆菌有很强的抑制作用(Tran, A. and R. Chambers, Lignin and extractives derived inhibitors in the 2， 3—butanediol fermentation of mannose~rich prehydrolysates. Applied Microbiology and Biotechnology, 1986. 23(3): p. 191-197.)。目前，本领域亟需抗酚类物质的克雷伯氏肺炎杆菌基因工程菌。
发明内容
本发明提供了一种重组克雷伯氏肺炎杆菌，所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌中含有可以功能性表达的漆酶基因，所述的漆酶基因为细菌来源的漆酶基因。所述的漆酶，是一类含铜的氧化还原酶，属于铜蓝氧化酶家族。其能够对酚类物质进行氧化，使得酚类物质聚合或分解。本发明的重组克雷伯氏肺炎杆菌，其中重组了细菌来源的漆酶基因，能够表达漆酶蛋白，因此，在其利用木质纤维素原料进行水解生产时，其产生的漆酶蛋白能够氧化所述木质纤维素原料水解液中的酚类物质，即该重组菌具有一定的抗酚类物质的抗性，降低了酚类物质对其的抑制作用，提高了其对木质纤维素原料水解液的利用能力，提高了其利用木质纤维素原料水解液来生产相应化学物质(诸如2，3- 丁二醇、1，3-丙二醇等)的能力。所述的漆酶基因为细菌来源的漆酶基因，其为相应的漆酶蛋白的编码序列。所述的漆酶蛋白为与所来源的细菌漆酶基因编码的漆酶蛋白具有相同的氨基酸序列的蛋白质，或者所来源的细菌漆酶基因编码的漆酶蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的且具有漆酶功能的衍生蛋白质。在本发明的一个具体实施方案中，所述的漆酶基因来源于肠杆菌、固氮螺菌、芽孢杆菌、克雷伯氏菌等属细菌。
本发明还提供了上述的重组克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，该制备方法包括两个基本步骤(1)获得细菌来源的漆酶基因；(2)将获得的漆酶基因连接到合适的表达载体上，再将所述的带有漆酶基因的表达载体转入克雷伯氏肺炎杆菌胞内，获得重组克雷伯氏肺炎杆菌，所述的合适的表达载体为在克雷伯氏肺炎杆菌中可以稳定存在的，具有高拷贝数的表达载体。在本发明的一个具体实施方式
中，步骤(1)中获得漆酶基因的方式为人工合成。在本发明的另一个具体实施方式
中，步骤(1)中获得漆酶基因的方式为从细菌基因组中进行克隆。这两种方式都是本领域技术人员获取目标基因的常规手段。所述的合适的表达载体是指，能够转化到克雷伯氏肺炎杆菌内并能稳定的存在，具有较高的拷贝数，并使得所携带的漆酶基因能够在克雷伯氏肺炎杆菌内进行功能性表达的载体。所述的高拷贝数质粒是指，在细胞分裂前一个质粒能复制成10个以上拷贝数的质粒，也称为松弛型质粒。优选的，在本发明的一个具体实施方案中，所述的表达载体为表达质粒。所述的表达质粒优选pDK6表达质粒、pDK7表达质粒，或者其他本领域技术人员所熟知的适宜转化到克雷伯氏肺炎杆菌且能够表达目的基因的其他质粒。至于将表达质粒转入克雷伯氏肺炎杆菌中的方式，可以采用电转化、热击转化或者接合方法转入克雷伯氏肺炎杆菌。
本发明还提供了上述重组克雷伯氏肺炎杆菌在利用木质纤维原料的水解产物生产化学品方面的应用。例如，利用木质纤维原料水解液生产2，3- 丁二醇等化学品。
在本发明的一个具体实施方式
中，获得了一重组克雷伯氏肺炎杆菌，其分类命名为 Klebsiella pneumoniae GMCC1. 6366— pDK6 — EL。所述的 pDK6 表示 pDK6 表达质粒，所述的EL表示大肠杆菌漆酶(五co7ilaccase)ο在本发明的另一个具体实施方式
中，获得了一重组克雷伯氏肺炎杆菌，其分类命 Klebsiella pneumoniae GMCC1. 6366—pDK6—KL。所述的KL表示克雷伯氏肺炎杆菌
漆酶 Of. pneumoniae Iaccase)。
本发明的有益效果在克雷伯氏肺炎杆菌利用木质纤维素原料的时候，原料中的酚类物质对菌体有很强的抑制作用，本发明在克雷伯氏肺炎杆菌中引入细菌漆酶，该类漆酶可以在细胞中表达出活性，漆酶可以降解酚类物质。使得获得的克雷伯氏肺炎杆菌工程菌株具有降解酚类物质的能力，增强了菌株对酚类物质的抗性，提高了菌株利用木质纤维素原料生产2，3- 丁二醇等化学品的性能。
具体实施例方式下述实施例的基本操作过程为
1.克隆或人工合成细菌漆酶基因；
2.将获得的漆酶基因连接到一个表达载体上，连接有漆酶的表达载体转入克雷伯氏肺炎杆菌。
实施例1
(1)利用PCR方法克隆大肠杆菌W3110漆酶基因。PCR模板大肠杆菌W3110基因组DNA ；
PCR 引物5，-GAATTC (EcoRI) ATGCAACGTCGTGATTTCTTAAAAT-3， 5’ - AAGCTT (Hind III) ATACCGTAAACCCTAACATCATCCC-3’ 注括号内表示相应的酶切位点。PCR 条件94 V 50 秒，52 °C 30 秒，72 °C 90 秒，30 个循环。
(2)将PCR扩增产物进行电泳，回收1.5kb条带，连接到pGM18-T载体，形成pGM18_T_EL 质粒，转化到大肠杆菌DH5 α中。对回收的1. 5kb 条带进行测序，通过 NCBI 网站(http//www. ncbi. nlm. nih. gov) 进行序列比对，表明获得的PCR产物序列正确。获得条带的基因序列为
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(3)从转化成功的大肠杆菌DH5α中提取pGM18-T-EL质粒；
(4)利用EcoRI和HindIII双酶切pGM18_T_EL质粒，回收1. 5kb片段；
(5)同样，利用EcoRI 和 Hind III 双酶切 pKD6 表达质粒(Kleiner D.，Paul W., Merrick Μ. J. 1988， Construction of multicopy expression vectors for regulated over-production of proteins in Klebsiella pneumoniae and other enteric bacteria. J. Gen. Microbiol. 134:77，1779-1784)，直接回收酶切产物；(6)将步骤(4)回收的1.5kb片段(即细菌漆酶基因片段)与步骤(5)回收的pKD6表达质粒的酶切产物混合，加入T4 DNA连接酶，16°C连接过夜；
(7)将步骤(6)的连接产物转化进大肠杆菌DH5ex，挑选转化子，提取质粒，酶切验证；
(8)将步骤(7)提取的质粒通过电转化转入克雷伯氏肺炎杆菌GMCC1.6366 (中国普通微生物保藏中心保藏)，获得工程菌株GMCC1. 6366— pDK6 — EL ；
基因组DNA提取、PCR、DNA片段电泳回收、质粒提取操作选用商品试剂盒，操作过程按照试剂盒说明书进行。Ec0RI、Hind III DNA连接酶和T4 DNA连接酶选用商业产品，操作过程按照说明书进行。其他操作方法釆用标准分子操作方法，参见J.莎姆布鲁克著，黄培堂译《分子克隆实验指南》科学出版社2005。
实施例2
(1)人工合成来源于雷伯氏肺炎杆菌NTUH-K2044的漆酶基因序列，参见NCBI公幵的NTUH-K2044基因组序列，序列号AP006725. 1，在合成基因上游添加EcoRI酶切位点 (GAATTC)、下游添加XbaI酶切位点(CGGCCG)。
基因序列为
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基因合成委托专业公司合成，获得合成基因放置于PUC18质粒中，质粒由大肠杆菌 DH5a携带。(2)培养携带合成基因的大肠杆菌DH5 a，提取含有合成基因的pUC18质粒。(3)提取质粒用EcoRI和XbaI双酶切，回收1. 5b段
(3)同样利用EcoRI和XbaI双酶切pKD6表达质粒，直接回收酶切产物。(4)将回收的含有克雷伯氏肺炎杆菌漆酶的片段与回收的pKD6片段混合，用T4 DNA连接酶，转化进大肠杆菌DH5 α，挑选转化子，提取质粒。(5)将提取的质粒转入克雷伯氏肺炎杆菌GMCC1. 6366，获得工程菌株 GMCC1. 6366—pDK6—KL0XbaI用商业产品，操作过程按照说明书进行。其他试剂盒和内切酶和具体操作过程同实施例1。效果验证1
对照组未转化的空白菌株(克雷伯氏肺炎杆菌GMCC1. 6366)； 试验组1 实施例1获得的工程菌株GMCC1. 6366—pDK6—EL ； 分别取对照组和试验组两株菌，利用250ml三角瓶(内装50ml LB液体培养基)37 200转每分钟摇瓶柜培养，培养6小时后，分别向两组中加入50mg/mL的IPTG (诱导漆酶表达)，培养20小时后，收获细胞，超声波破碎细胞，离心取细胞破碎清液。利用2，6-二甲氧基酚为底物测定漆酶活力，利用考马斯亮蓝显色测定总蛋白含量。具体测定方法参见(Gregor Grass and Christopher Rensing, 2001，CueO Is a Multi-copper Oxidase That Confers Copper Tolerance in Escherichia coli, Biochemical and Biophysical Research Communications 286, 902 - 908)。检测结果见下表1。 表权利要求
1.一种重组克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌中含有可以功能性表达的漆酶基因，所述的漆酶基因为细菌来源的漆酶基因。
2.根据权利要求1所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于，所述的漆酶基因来源于肠杆菌、固氮螺菌、芽孢杆菌、克雷伯氏菌。
3.权利要求1或2所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，其特征在于，该制备方法包括两个基本步骤(1)获得细菌来源的漆酶基因；(2)将获得的漆酶基因连接到合适的表达载体上，再将所述的带有漆酶基因的表达载体转入克雷伯氏肺炎杆菌胞内，获得重组克雷伯氏肺炎杆菌，所述合适的表达载体为在克雷伯氏肺炎杆菌中可以稳定存在的，具有高拷贝数的表达载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中获得漆酶基因的方式包括人工合成或从细菌基因组中进行克隆。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的表达载体为表达质粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，可以采用电转化、热击转化或接合方法将带有漆酶基因的表达质粒转入克雷伯氏肺炎杆菌。
7.权利要求1或2所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌在利用木质纤维原料的水解产物进行生产的应用。
8.一种重组克雷伯氏肺炎杆菌，其分类命名为Z/e/wieWa pneumoniae GMCC1. 6366— pDK6 — EL。
9.一种重组克雷伯氏肺炎杆菌，其分类命名为Z/e/wieWa pneumoniae GMCC1. 6366— pDK6 — KL。
全文摘要
本发明涉及一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其制备方法和应用，该重组克雷伯氏肺炎杆菌中含有可以功能性表达的漆酶基因,所述的漆酶基因为细菌来源的漆酶基因。该重组克雷伯氏肺炎杆菌在其利用木质纤维素原料水解液进行2,3-丁二醇等化学品的生产时，其表达的漆酶蛋白能够氧化所述水解液中的酚类物质，即该重组菌具有一定的抗酚类物质的抗性，降低了酚类物质对其生产的抑制作用，提高了其利用木质纤维素原料进行生产化学物质的能力。
文档编号C12N1/21GK102260643SQ20111015152
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者史吉平, 郝健 申请人:上海中科高等研究院