专利名称：一种肥厚型心肌病基因分型方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因分型领域，具体属于一种肥厚型心肌病基因分型方法及其检测试剂盒。
背景技术：
肥厚型心肌病(HCM)是最常见的心肌病之一，以左心室和右心室及室间隔非对称性肥厚为特征，排除其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病。其临床表现多样，从无症状到轻度胸闷、心悸再到恶性心律失常、心力衰竭，甚至青少年时期猝死等。据估计，在普通人群中HCM发病率约为1/500。随着分子生物学的迅猛发展和人类基因组计划的完成，心肌病的致病基因研究取得了很大进展。已证实肥厚型心肌病为常染色体显性遗传疾病，单一等位基因突变即可致病。该病约有55%发病呈家族聚集性，称为家族性肥厚型心肌病(FHCM)。迄今为止，已确定了 11个编码肌节蛋白基因的200余种突变， 可引起单纯性HCM，不伴有其他心脏表现和心脏外表现。其中包括5个编码粗肌丝的基因 β-肌球蛋白重链基因(ΜΥΗ7)，肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)。α-肌球蛋白重链基因(ΜΥΗ6)，必需轻链基因(MYL3)，调控轻链基因(MYL3) ；5个编码细肌丝的基因心肌肌钙蛋白T基因(ΤΝΝΙ3)，肌动蛋白基因(ACTC)，肌钙蛋白T基因(ΤΝΝΙ2)，心肌肌钙蛋白C基因 (TNNCl)和α-原肌球蛋白基因(TPMl) ；1个编码粗丝联接蛋自基因ΤΤΝ。其中，最常见的三种突变类型是β-肌球蛋白重链基因(ΜΥΗ7)、肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)和心脏肌钙蛋白T基因(ΤΝΝΤ2)，占家族性肥厚型心肌病的70-90%。肥厚型心肌病由于临床表现十分多样，目前确诊主要是靠实验室检查。超声心电图目前仍是肥厚型心肌病诊断最常用、最可靠、最经济的诊断方法。另外还有心脏核磁、心电图改变等检查方法。但是临床诊断方法不足之处是被确诊的患者都是已经发展到了发病的中晚期，这对治疗和手术来说都是不利因素。HCM的致病基因及突变位点在不同国家、不同种族之间的分布差异很大。而HCM心肌病已成为影响我国居民身心健康及人口生存质量的重大公共卫生问题，鉴于越来越多的心肌病与遗传因素有关，对于心肌病的基因分型已经越来越有必要，而国内外在这方面目前还是空白。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是通过对HCM的致病基因MYH7、MYBPC3和TNNT2进行基因突变的检测，从基因序列和分子结构水平来辅助鉴定是否携带HCM心肌病致病基因突变。本发明提供的技术方案为提供一种肥厚型心肌病基因分型方法，所述方法包括a、对样本DNA中基因MYH7、MYBPC 3和TNNT2进行基因突变的检测，所述基因突变的检测包括MYH7、MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR扩增及DNA测序，C、将步骤b中扩增测序后得到的序列与数据库中的标准序列进行比对，从而确定基因分型结果。优选的，所述PCR扩增及DNA测序包括PCR序列扩增、PCR产物纯化和双脱氧链终
止法DNA测序。优选的，所述PCR序列扩增的反应体系为IyL的10XPCR Buffer、1 μ L的2 μ M 引物、1 μ L 的 2mM dNTP mix、1 μ L15mM 的 MgCl2UU 的 Taq 酶、1 μ L 20ng/ μ L 的 DNA 模板， 然后加双蒸水至10 μ L，反应条件为94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸2分钟，共35个循环；72°C延伸5分钟。优选的，所述双脱氧链终止法DNA测序的反应体系为0. 25uL的2. 5XBigDye、 0. 875uL5 XBigDye Seq Buffer、luL5pmoL/μ L 的引物、1. 875uL 灭菌去离子水、IuL 纯化的 PCR产物；反应条件94°C预变性2分钟；94°C变性10秒，55°C退火10秒，60°C延伸3分钟， 25个循环。优选的，所述PCR产物纯化采用EDTA-乙醇法。优选的，所述双脱氧链终止法DNA测序所用的通用测序引物序列如SEQ ID NO 1-2所示。优选的，所述MYH7基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :3_28所示；所述MYBPC3基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :29_50所示；所述TNNT2基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :51_58所示。本发明提供的另一个技术方案为提供一种肥厚型心肌病基因PCR检测试剂盒，包括MYH7、MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR扩增引物，所述MYH7基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :3_28所示；所述MYBPC3基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :29_50所示；所述TNNT2基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :51_58所示。优选的，所述肥厚型心肌病基因PCR检测试剂盒还包括所述MYH7、MYBPC3和TNNT2 各基因外显子PCR扩增产物的DNA测序的通用测序引物，所述通用测序引物序列如SEQ ID NO 1-2 所示。本发明的有益效果为(1)辅助早期诊断找出家族成员中无症状的遗传受累者及无遗传受累者；(2)辅助指导选择性生育，杜绝此病在这一家族中“蔓延”。
具体实施例方式本发明的肥厚型心肌病MYH7、MYBPC3、TNNT2基因突变是指MYH7、MYBPC3、TNNT2 基因各外显子所发生的单碱基替换、插入突变、缺失突变及复合突变等。本发明还提供了一种本发明DNA测序的通用测序引物，大大简化了操作步骤。所述的通用测序引物序列是UF :5’ -ggaggactgctcacgaact-3’ ；UR 5’ -gggacacgcagtcgacatc-3', UF代表未甲基化特异性上游引物，UR代表未甲基化特异性下游引物。本发明的肥厚型心肌病MYH7、MYBPC3、TNNT2基因突变检测方法，包括下列步骤
(1)应用对象或材料a.社会人群的血液；机体组织细胞；蜡块和福尔马林固定组织；各类冻存、固定保持细胞。b.患有心肌病或类似心肌病综合征的患者及其家族血缘人员的血液及其上述材料。c.肥厚型心肌病相关患者的血液标本。(2)样本DNA提取a.新鲜组织商业化DNA提取试剂盒或是自配试剂。b.固定和石蜡组织商业化DNA提取试剂盒。c.血液标本和液体细胞商业化DNA提取试剂盒或是自配试剂。(3) PCR 扩增MYH7、MYBPC3、TNNT2基因外显子的PCR扩增。所述的PCR扩增是指反应液为1 μ L 的 10XPCR Buffer、ly L 的 2μΜ弓I物、IyL 的 2mM dNTP mix、lyL 的 15mM MgCl2UU Taq 酶、20ng/ μ L DNA模板加1 μ L，然后加ddH20至10 μ L。反应条件为94°C预变性5分钟； 94°C变性30秒，65 °C退火30秒，72 °C延伸2分钟，共35个循环；72°C延伸5分钟。(4) DNA测序及结果分析。所述的测序反应中的PCR反应体系包括测序引物、PCR纯化产物和双脱氧链终止法DNA测序。所述双脱氧链终止法DNA测序的反应体系为0. 25uL的2. 5XBigDye、 0. 875uL5 XBigDye Seq Buffer、luL5pmoL/μ L 的引物、1. 875uL 灭菌去离子水、IuL 纯化的 PCR产物；反应条件94°C预变性2分钟；94°C变性10秒，55°C退火10秒，60°C延伸3分钟， 25个循环。实施例1本发明提供的一种肥厚型心肌病基因PCR检测试剂盒，包括MYH7、MYBPC3和TNNT2 的基因外显子的PCR扩增测序的引物碱基序列，还包括PCR扩增反应液lyL的10XPCR BufferUyL 的 2μ M 弓I 物、IyL 的 2mM dNTP mixU μ L 15mM 的 MgCl2、IU Taq 酶、IyL 20ng/ μ L的DNA模板，加ddH20补足体积至10 μ L。所述的ΜΥΗ7基因外显子的PCR引物序列见表1，参考基因组序列为GenBank数据库登录号为ΝΜ_000364. 1的序列(本专利的参考序列对此有所修正)。所述的MYBPC3基因外显子的PCR引物序列见表2，参考基因组序列为GenBank数据库登录号为U91629. 1的序列。所述的ΤΝΝΤ2基因外显子的PCR引物序列见表3，参考基因组序列为GenBank数据库登录号为ΝΜ_000364. 1的序列(本专利的参考序列对此有所修正)。表1 ΜΥΗ7基因外显子PCR引物序列
权利要求
1.一种肥厚型心肌病基因分型方法，其特征在于，所述方法包括a、对样本DNA中基因MYH7、MYBPC3和TNNT2进行基因突变的检测，所述基因突变的检测包括MYH7、MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR扩增及DNA测序，b、将步骤b中扩增测序后得到的序列与数据库中的标准序列进行比对，从而确定基因分型结果。
2.按权利要求1所述的肥厚型心肌病基因分型方法，其特征在于，所述PCR扩增及DNA 测序包括PCR序列扩增、PCR产物纯化和双脱氧链终止法DNA测序。
3.按权利要求2所述的肥厚型心肌病基因分型方法，其特征在于，所述PCR序列扩增的反应体系为 1 μ L 的 10XPCR Buffer、ly L 的 2μ M 弓丨物、IyL 的 2mM dNTP mixU μ L15mM 的MgCl2UU的Taq酶、1 μ L 20ng/ μ L的DNA模板，然后加双蒸水至10 μ L，反应条件为94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸2分钟，共 35个循环；72 °C延伸5分钟。
4.按权利要求2所述的肥厚型心肌病基因分型方法，其特征在于，所述双脱氧链终止法 DNA 测序的反应体系为 0. 25uL 的 2. 5XBigDye、0. 875uL5XBigDye Seq Buffer、 luL5pmoL/ μ L的引物、1. 875uL灭菌去离子水、IuL纯化的PCR产物；反应条件94°C预变性2分钟；94°C变性10秒，55°C退火10秒，60°C延伸3分钟，25个循环。
5.按权利要求2所述的肥厚型心肌病基因分型方法，其特征在于，所述PCR产物纯化采用EDTA-乙醇法。
6.按权利要求1-5任一项所述的肥厚型心肌病基因分型方法，其特征在于，所述双脱氧链终止法DNA测序所用的通用测序引物序列如SEQ ID NO 1~2所示。
7.按权利要求1所述的肥厚型心肌病基因分型方法，其特征在于，所述MYH7基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如=SEQ ID NO :3_28所示；所述MYBPC 3基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO 29-50所示；所述TNNT2基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :51_58所示。
8.一种肥厚型心肌病基因PCR检测试剂盒，其特征在于，包括MYH7、MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR扩增引物，所述MYH7基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :3_28所示；所述MYBPC3基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO 29-50所示；所述TNNT2基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如SEQ ID NO :51_58所示。
9.按权利要求8所述的肥厚型心肌病基因PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括所述 MYH7、MYBPC3和TNNT2各基因外显子PCR扩增产物的DNA测序的通用测序引物，所述通用测序引物序列如SEQ ID NO 1-2所示。
全文摘要
本发明提供的技术方案为提供一种肥厚型心肌病基因分型方法及PCR检测试剂盒，所述方法包括a、对样本DNA中基因MYH7、MYBPC3和TNNT2进行基因突变的检测，所述基因突变的检测包括MYH7、MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR扩增测序，b、将步骤a中扩增得到的序列与数据库中的标准序列进行比对，从而确定基因分型结果。本发明的有益效果为(1)辅助早期诊断找出家族成员中无症状的遗传受累者及无遗传受累者；(2)辅助指导选择性生育，杜绝此病在这一家族中“蔓延”。
文档编号C12Q1/68GK102242212SQ20111019274
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者周晓强, 姚铭锋, 林希瑾, 申颜玮, 秦伟, 胡守旺, 谢佐福 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司