专利名称：大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及转基因大豆及其深加工产品，具体而言是一种大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
转基因作物自面世及大规模推广种植以来，就以其自身的优势为人类社会创造了巨大的经济效益。但转基因作物及其加工产品的生物安全性隐患也是一个不可忽视的事实。面对着这把双刃剑，世界上许多国家纷纷出台了相应地法律法规来对转基因作物及其加工产品进行标识管理及安全性评价。1983年人类成功培育了世界上第一种转基因植物——含抗生素药类抗体的烟草。 但直到1994年，具有延熟保鲜功能的转基因番茄才成为首例批准进行商业化生产的转基因植物。此后，转基因作物正式走进了大众的视线，在全球得到了大面积推广。1996年全球仅有6个国家种植转基因作物，而到2008年数量激增至25个国家；与此同时，1996年全球转基因作物种植面积仅有170万公顷，而到2008年则累计达到8亿公顷(Clive James, 2008)。到目前为止，已经有超过100种以上的转基因植物被商业化种植，其中最广泛的是大豆、玉米、棉花和油菜。2008年全球大豆种植面积约为95，000，000公顷，其中转基因大豆占 70% 份额(Clive James, 2008)ο美国孟山都公司生产的抗草甘膦除草剂转基因大豆(Roimdyup Ready Soybean), 简称RR大豆，是世界上最早获准进行商业化种植的转基因大豆品种，(1994年5月首次获准在美国进行商业化种植)。它是应用转基因技术将外源EPEPS基因导入大豆并正确表达，进而育成的具有抗草甘膦除草剂特性的转基因大豆品种(AGBI0S，2002 ；Monsanto, 2002)。大豆类食品制品及相关产品一直以来为都是为人民群众所热爱的，可以预见，随着我国经济的进一步发展，人民群众生活水平的提高，大豆类食品制品及相关产品的需求量必然上升；而国内的大豆产值与市场需求间一直有着一定的差距。自1996年开始，中国成为大豆、豆粕、粮油的全面净进口国，现已是世界上最大的大豆进口国。2008年中国大豆总产量为1656万吨，而进口量已达到惊人的3743万吨。(罗维燕，2009)。有证据表明，2008 年，美国、阿根廷、巴西转基因大豆的种植率分别高达91. 9%,90. 4%和70. 3%,而来自美国、 巴西、阿根廷的大豆约占我国总进口大豆份额的90%。(梁克红等，2009)。而转基因作物自面世以来，就其安全性各界一直存在着较大的争议。故此，我国出台了相应地法律法规要求进行相应地转基因标识。本发明为转基因大豆及其深加工产品中转基因成份地检出提供了可行性高且可靠的方法。同时也为自由市场上售卖地大豆类食品制品、超市中添加大豆成份的深加工产品中转基因成份地检测检出提供了有力地技术支撑
发明内容
发明目的
本发明提供一种大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检测试剂盒及其检测方
法
技术方案
一按下列试剂制备转基因成份检测试剂盒 (1) :A 液
PCR 反应缓冲液内含 10XPCR Buffer (Mg2+)、dNTPs (10 mM each)、ddH20。(2):B 液
Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)
(3):C 液
溶液 I (20 pmol/μ L) -.Lectin 5' - GCCCTCTACTCCACCCCCATCC -3' 5 ‘ - GCCCATCTGCAAGCCTTTTTTGTG-3‘
(4):D 液
溶液Π (20 pmol/μ L) :CaMV35S 启动子5' - GCTCCTACAAATGCCATCA -3' 5' - GATAGTGGGATTGTGCGTCA -3'
(5):E 液
溶液]II (20 pmol/μ L) :N0S 终止子5' - GAATCCTGTTGCCGGTCTTG -3' 5' - TTATCCTAGTTGCGCGCA -3'
(6):F 液
溶液W (20 pmol/μ L) ..CP4-EPSPS 5' - TTCGCTCCTCCACGCGAAG -3' 5 ‘ - GGCGGTCGCTTTCCTTGA-3‘ 二 提取总DNA
1、取大豆油样品10ml，加入40 ml的无水乙醇(酱油中用30 ml)，放置在-20 °C沉淀 1 h(酱油中沉淀40分钟)，弃去上清，沉淀用15 ml的pH=8. 0的0. 1 mol/L的Tris-Hcl溶液溶解，用力摇勻，全部转移至100 ml烧杯中，于磁力搅拌器上搅拌1.5 h，室温，12 000 r/ min离心10 min，弃上清，沉淀用于DNA提取；
2、将步骤1获得的全部沉淀，加入15ml经65 °C预热的溴代十六烷基三甲胺(CTAB) 提取缓冲液，混勻，65 °C水浴中保温1.5 h，期间每隔10 min轻轻颠倒混勻一次；
3、取出静置冷却至20 25°C, 12 000 r/min离心12 min，弃上清(没有明显分层，弃掉少许上清液，酱油中是取上清)；
4、加入与步骤3所得到的上清液等体积的三氯甲烷，缓慢颠倒摇勻5min, 10 000 r/ min离心10 min，取上清，再加入等体积的三氯甲烷抽提一次(10 000 r/min离心10 min), 取上清；
5、加入上清液2倍体积的溴代十六烷基三甲胺(CTAB)沉淀液，摇勻，20 25°C静置1.5 h，12 000 r/min离心10 min，弃上清，留沉淀；
6、沉淀加入1.2mol/L的Nacl溶液1 mL，溶解沉淀，20 25 °C静置5 min，加入1 mL 的三氯甲烷，颠倒摇勻1 min, 12 000 r/min离心10 min，取上清；
7、加入所取上清液1/10体积的3mol/L乙酸钠和等体积的4 °C预冷异丙醇，缓慢混勻，4 °C静置过夜，14 000 r/min离心15 min，弃上清，留沉淀；
8、用4°C预冷的400 PL的70 %乙醇洗涤沉淀(10 000 r/min离心5 min)，洗涤2 次，除去残留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀；
9、加入25μ L灭菌的0. 1 mol/L的TE溶液，溶解从食用油中提取的DNA沉淀；
10、放置于4°C冰箱中待用。
三PCR扩增反应
25 μ 1 PCR反应体系如下
权利要求
1.一种适用于大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检出的试剂盒，其特征在于其中包括试剂(1)-(6)(1)A 液PCR 反应缓冲液内含 10XPCR Buffer Mg2+、dNTPs 10 mM each、ddH20(2)B 液Taq DNA 聚合酶 5 U/μ L,(3)C 液溶液 I 20pmol/yL，(4)D 液溶液 II 20 pmol/μ L,(5)E 液溶液III 20 pmol/μ L,(6)F液溶液 W 20 pmol/μ L0
2.根据权利要求1所述的一种适用于大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检出的试剂盒，其特征是上述的溶液I 5' - GCCCTCTACTCCACCCCCATCC -3'5' - GCCCATCTGCAAGCCTTTTTTGTG-3‘。
3.根据权利要求1所述的一种适用于大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检出的试剂盒，其特征是上述的溶液II 5' - GCTCCTACAAATGCCATCA -3'5' - GATAGTGGGATTGTGCGTCA -3'。
4.根据权利要求1所述的一种适用于大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检出的试剂盒，其特征是上述的溶液III 5' - GAATCCTGTTGCCGGTCTTG -3'5' - TTATCCTAGTTGCGCGCA -3'。
5.根据权利要求1所述的一种适用于大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检出的试剂盒，其特征是上述的溶液ι 5' - TTCGCTCCTCCACGCGAAC -3'5' - GGCGGTCGCTTTCCTTGA-3‘。
6.一种适用于大豆食用油及其深加工产品中转基因成份检出的试剂盒的检测方法，其特征是A、提取总DNA；B、PCR扩增反应，分别采用溶液I、溶液II、溶液III、溶液i做上下游引物进行PCR扩增反应；具体操作如下25μ 1 PCR反应体系如下
全文摘要
本发明是一种适用于检测大豆食用油及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒。具体方法(1)大豆食用油及其深加工产品中DNA的提取。(2)特异性PCR扩增反应。(3)琼脂糖凝胶电泳检测。具体试剂盒A液、B液、C液、D液。实验结果表明本发明对大豆食用油及其深加工产品中以及自由市场上的未进行转基因标识的大豆类食品制品中的转基因成份有着很高的检测检出率。同时，本发明也能为添加大豆成份的如火腿肠、好多鱼、长鼻王等深加工产品中转基因成份的检出提供有力的技术支撑。
文档编号C12Q1/68GK102277426SQ201110207919
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者华春, 周光宏, 周红霞, 张洪琳, 张秀芳, 祝长青, 黄明 申请人:南京农业大学