专利名称：农杆菌介导的大麦成熟胚愈伤组织转化方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体的说，本发明涉及利用农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)侵染大麦成熟胚诱导而来的胚性愈伤组织并获得转基因植株的遗传转化方法和相应的组织培养体系。
背景技术：
自上世纪90年代初Wan和Lemaux利用DNA微粒片段轰击率先转化大麦品种黄金希望(Golden Promise)后，国际上出现了众多利用基因枪法或农杆菌介导法转化大麦并将一些目的性状成功整合到大麦的报导(Wan and Lemaux，1994，Plant Physiol. 104 :37-48 ； Tingay et al.,1997, Plant J. 11 1369-1376 ；Lemaux,1999, Great Britain :Kluwer Academic Publishers :255-316)。当前，绝大部分大麦转化体系以黄金希望为模式品种，但其产量和品质性状表现一般，例如产量仅为当前欧洲主栽品种的1/3左右。鉴于转化供体的遗传背景和农艺特性会大大影响转基因后代的应用潜力，因此，筛选出组培潜力高、基因型依赖性低、农艺特性优良的商用大麦品种并建立其转化体系迫切而必要。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的大麦遗传转化与基因枪法相比，优势明显转化效率高，是基因枪法的2倍；转化株中目的基因的拷贝数在1-3个之间， 而基因枪法得到的转化株有60%拷贝数大于8个；基因枪法导致的多拷贝容易造成目的基因在转基因后代中沉默以及遗传易丢失CTravella，2005，Plant Cell R印.23 :780-789)。 同时，转基因作物的商业释放一般要求目的基因单拷贝插入且在后代中稳定遗传表达。因此，农杆菌介导的大麦遗传转化研究，无论在大麦的基因功能鉴定还是分子育种都具有重要的意义。目前国际上大麦遗传转化的受体局限于幼胚或者幼胚来源的愈伤组织(Horvath et al. , 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:1914-1919 ；Murray et al.，2004，Plant Cell Rep. 22 :397-402)。然而，取用大麦幼胚需要供体植株周年连续培养，费工耗时成本高，同时，幼胚转化对外植体的发育时期有特定要求，而大麦开花时期往往难以控制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种农杆菌转化大麦成熟胚愈伤组织的方法，用于获得转基因大麦植株，这种方法操作方便，稳定性好，转化效率高。为了解决上述技术问题，本发明提供一种农杆菌介导的大麦成熟胚愈伤组织转化方法，包括以下步骤A)、大麦成熟胚愈伤组织的诱导选取当年收获的、健康饱满的大麦成熟种子，切去胚乳后去壳，先用体积浓度为 70 80 %的乙醇振荡处理，倒去乙醇后，再加入体积浓度为10 20 %次氯酸钠静置灭菌处理，接着用无菌水清洗上述灭菌离体胚；最后将离体胚在无菌滤纸上吸干水分，用解剖刀沿颖果腹沟切成两半，将外植体切面朝下平铺于诱导培养基上，于22 25°C下暗培养14 20d ；诱导培养基为基础培养液附加L-谷氨酰胺0. 25g/L，水解酪蛋白0. 3g/L，脯氨酸 0. 5g/L，肌醇0. lg/L，麦芽糖60g/L,琼脂粉(Agar)0. 55%, 2,4- 二氯苯氧乙酸4mg/L ；调节 pH值至5.8。所述基础培养液由以下含量的组分以及蒸馏水组成MnSO4 4H20 22. 3mg/L ，KNO32800mg/L,ZnSO4 7H20 8.6mg/L ，(NH4)2SO4 460mg/L,H3BO36. 2mg/L ，KH2PO4400mg/L,Na2MoO4 ‘ 2H20 0. 25mg/L, MgSO4 7H20 185mg/L,CuSO4 5H20 0.025mg/L, CaCl2 2H20 165mg/L,CoCl2 6H20 0. 025mg/L,维生素 B1 lOmg/L,KI0.83mg/L ，维生素 1. Omg/L,Na2-EDTA ‘ 2H20 37. 3mg/L ，甘氨酸2mg/L ，FeSO4 7H2027.8mg/L,烟酸0. 5mg/L ;B)、初代愈伤组织的分离和继代上述14 20d的培养结束后，将所得的初代愈伤组织转移到继代培养基上，于 22 25 °C下暗培养14 20d ；所述继代培养基为基础培养液附加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇 0. lg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉0. 60%,6-苄氨基嘌呤lmg/L，2，4-二氯苯氧乙酸0. lmg/L, 调节PH值至5. 8 ；C)、农杆菌培养和活化选用带有所需基因的农杆菌LBA4404，利用活化培养基将菌液浓度调节到0D600 值0. 8 1. 2 ；于22 25°C静置活化2 3h ；活化培养基配方为基础培养液附加水解酪蛋白1. Og/L，脯氨酸0. 7g/L，肌醇 0. 15g/L，麦芽糖90g/L,乙酰丁香酮200umol/L ；调节pH值至5. 8 ；D)、成熟胚愈伤组织侵染和共培养将步骤2、所得的愈伤组织风干后加入至步骤幻所得的活化好的农杆菌液中浸泡 30 40min，得侵染后愈伤组织；先将侵染后愈伤组织转到无菌的滤纸上吸干侵染后愈伤组织表面的多余菌液，然 后将侵染后愈伤组织置于铺有一层滤纸的共培养基上，22 25°C下暗培养48 72h ；共培养基为基础培养液附加水解酪蛋白1. Og/L，脯氨酸0. 7g/L，肌醇0. 15g/L，麦 芽糖90g/L，琼脂粉0. 6%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L ；调节pH值至 5. 8 ；E)、愈伤组织的抑菌和恢复培养将上述步骤D)所得的共培养后愈伤组织转入铺有一层无菌滤纸的抑菌培养基， 以去除农杆菌，于22 25°C下暗培养2 3d ；抑菌培养基配方为基础培养液附加头孢霉素500mg/L，水解酪蛋白1. Og/L，脯氨 酸0. 7g/L，肌醇0. 15g/L，麦芽糖90g/L，琼脂粉0. 6%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧 乙酸0. lmg/L,调节pH值至5. 8 ；
将抑菌结束后所得的愈伤组织在无菌滤纸上吸干水分，或以无菌水冲洗两遍后再吸干水分，然后置于恢复培养基上22 25°C下暗培养3 4d ；恢复培养基为基础培养液附加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇0. lg/L， 麦芽糖30g/L，琼脂粉0. 68%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L,头孢霉素 150mg/L ；调节 pH 值至 5.8。作为本发明的农杆菌介导的大麦成熟胚愈伤组织转化方法的改进，还包括以下步骤F)、植株再生将恢复培养后所得的愈伤组织转入分化培养基，培养条件为60 80 μ E HT2iT1的高光照强度，23 27°C，16小时光照/8小时黑暗；每13 15d继代；共继代培养2 4个月；所述分化培养基为基础培养液附加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇 0. lg/L,麦芽糖30g/L，琼脂粉0. 68%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，激动素0. 5mg/L ；调节pH值至 5. 85 ；G)、生根与移栽将继代培养所得的发育良好的芽/小苗转入生根培养基，生根培养在60 80 μ E HT2iT1的高光照强度下，23 27°C，16小时光照/8小时黑暗；培养时间为3 4周；生根培养基为基础培养液附加蔗糖30g/L，α -萘乙酸2. Omg/L，琼脂粉0. 4%，调节pH值至5. 95 ；将生根培养所得的植株移栽后于常规温室条件下培养。在本发明中，控制农杆菌浓度在0D600值0. 8 1. 2，在保证转化效率的同时，可防止细菌过度繁殖。控制农杆菌侵染和共培养的温度应控制在22 25°C，这不仅能促进细菌质粒的高保真复制和抑制其快速生长，而且能提高目的基因的侵染力，使愈伤组织被高效转化。在本发明中，共培养时保持愈伤组织的干燥有利于遗传转化，也可避免愈伤组织进行无氧呼吸而褐化死亡，因此，去除愈伤组织表面的液体十分重要。在抑菌过程中，除使用无菌滤纸吸去愈伤组织水分外，也可以将培养皿打开，放置于超净台上吹干。在本发明中，大麦愈伤组织能否成功地分化再生，与愈伤组织的年龄和发育程度密切相关。若上述恢复培养时间过长，易造成大部分愈伤组织褐化死亡。大麦抗逆性强，将处于胚胎发育过程的胚性愈伤组织及时进行光照诱导，可显著提高绿株的再生率。本发明的改进和意义1.本发明首次以大麦成熟胚诱导而来的愈伤组织为外植体，成功实现了农杆菌介导的遗传转化，国际上尚未有过相关报道；2.成熟胚转化体系不仅适用于大麦模式品种Golden ftOmise，也可以推广到商用大麦品种，本发明为加快抗性和品质育种进程、基因功能研究和RNA干涉技术奠定了基础；3.本发明较基因枪等转化方法具有操作简单，效益高，目的基因拷贝数低等优点， 成熟胚与幼胚外植体相比，具有污染率低、成本小和简便易行等优势。与现有技术中采用的幼胚相比，大麦成熟胚系发育成熟的种子，易于操作和长期保存，外植体分离简易可行，污染率极低，且更为方便的是取材不受季节限制，数量容易保证。总之，以成熟胚为外植体构建转化的体系更简便、高效。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1为本发明实施例1中所采用的双元质粒载体。它改造自pCambia1301质粒， 为花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子驱动的绿色荧光蛋白基因(GFP)，愈伤组织筛选标记为潮霉素B，农杆菌筛选标记为卡那霉素。图2为本发明实施例1中转化后发出绿色荧光的愈伤组织。Golden Promise的愈伤组织转化后恢复培养数天，选取部分愈伤组织在荧光显微镜下观察，蓝光激发后可观察到愈伤组织上转化成功的部分发出强烈的绿色荧光，而未转化的区域则显示深色，可作为阴性对照。该结果说明了 Golden Promise的愈伤组织已经被成功的导入GFP基因。其中左图为Golden Promise恢复培养7d后观察到的GFP绿色荧光；右图为Golden Promise分化培养14d后观察到的GFP绿色荧光。图3为本发明实施例2中两个品种转基因植株的PCR检测电泳图。1-8为载体上游基因片段G93bp)的两端序列为引物的扩增结果；9-16为载体下游基因片段(597bp)的两端序列为引物的扩增结果。1和9为阳性对照(农杆菌质粒为模板)；2、10和3、11为阴性对照，分别为野生型的早熟3号和黄金希望(Golden promise) ；4-6和12-14为对应的3 个黄金希望转化株，8-9和15-16为对应的2个早熟3号转化株。与阴性对照相比，转基因植株都检测到明显的PCR阳性条带，表明基于成熟胚愈伤组织的转化是成功的。
具体实施例方式下面结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例1 1)、大麦成熟胚愈伤组织的诱导选取当年收获的、健康饱满的大麦品种Golden Promise成熟种子，用纱布包住后放入锥形瓶中流水冲洗lh，在吸水纸上用解剖刀切除种子的部分胚乳，仅保留离体胚(长度为4 5mm)，然后将离体胚用手剥去外壳后放入IOmL离心管(预先灭菌)中，一般每个 IOmL离心管中放入15 20个去壳离体胚。在超净台上，先向离心管内倒入75% (ν/ν)乙醇振荡处理30s ；倒去乙醇后，再用新鲜配制的15%次氯酸钠(ν/ν)静置灭菌处理15min， 得灭菌离体胚；用无菌水清洗上述灭菌离体胚2次，每次;3min。将离体胚在无菌滤纸上吸干水分，用解剖刀将其切成两半(沿颖果腹沟切成两半)，得外植体。将外植体切面朝下平铺于诱导培养基上，每皿设置20 25个外植体，于23°C下暗培养14d后，分离获得大麦成熟胚初代愈伤组织。大麦成熟胚初代愈伤组织是在外植体上形成的湿润、柔软、表明光滑的愈伤组织。诱导培养基为基础培养液加L-谷氨酰胺0.25g/L(即，每L基础培养液中加入 L-谷氨酰胺0. 25g ；以下类同)，水解酪蛋白0. 3g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇0. lg/L，麦芽糖 60g/L，琼脂粉(agaiOO.55% (即，每L基础培养液中加入5. 5g的琼脂粉)，2，4-二氯苯氧乙酸細g/L，用氢氧化钠调节pH值至5. 8。
基础培养液由以下含量的组分和蒸馏水组成
MnSO4 · 4H2022. 3mg/L ，KNO32800mg/L,
ZnSO4 · 7H208.6mg/L ,(NH4)2SO4460mg/L,
H3BO336. 2mg/L ,KH2PO4400mg/L,
Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L ，MgSO4 · 7H20185mg/L,
CuSO4 · 5H200.025mg/L ，CaCl2 · 2H20165mg/L,
CoCl2 · 6H200.025mg/L ，维生素B110mg/L，
KI0.83mg/L ，维生素 1. Omg/L,
Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L ,甘氨酸2mg/L ，
FeSO4 · 7H2027. 8mg/L,烟酸0. 5mg/L。2)、初代愈伤组织的分离和继代14d后从外植体上剥取色泽乳黄、结构致密、绵绸状的、新鲜的愈伤组织(为初代愈伤组织)进行胚性诱导。将初代愈伤组织转移到继代培养基上，每皿放置20个愈伤组织， 23°C下暗培养15d。继代培养基为基础培养液加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇0. lg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉0. 60%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L,用氢氧化钠调节PH值至5. 8。在分离初代愈伤组织时，需要注意的是，大麦白色水渍、松散透明、花瓣状的愈伤组织胚胎发生能力很弱，再生频率仅为5%左右。因此，应该鉴别、挑选色泽乳黄、结构致密、 绵绸状的愈伤组织进行胚性诱导。3)、农杆菌培养与活化转化采用农杆菌菌株LBA4404，携带改造后的pCambia1301质粒，为花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子驱动的绿色荧光蛋白基因(GFP)，载体结构见图1。该载体构建方法为常规技术。取出-80°C冻存的农杆菌液在冰上0 4°C融化，接种针蘸取后在加有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEB固体培养基上划线，28°C培养48h。挑取单菌落加入到含有 3mL YEB液体培养基的IOmL离心管中，28°C、250rpm振荡培养48h ；此时菌液有混浊现象，表明农杆菌已经被激活。吸取200uL已被激活的农杆菌液，加入到20mL含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEB液体培养基中J8°C、250rpm振荡培养16h，用于愈伤组织侵染。 YEB液体培养基含有牛肉浸膏5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，七水和硫酸镁0. 49g/L，其余为蒸馏水，PH自然。YEB固体培养基附加0.8%琼脂粉(即，在每升YEB液体培养基中加入 Sg的琼脂粉)。测定上述农杆菌液0D600值，以5000g离心力离心8min，倒净YEB液体培养基，加入适量的活化培养基，将菌液浓度调节到0D600为1. 2，振荡重悬后，每50mL离心管中分取 20mL菌液，在23°C静置活化农杆菌3h，中间每隔1小时颠倒离心管10次。活化培养基配方为基础培养液(如步骤1)中所述)附加水解酪蛋白1. Og/L，脯氨酸0. 7g/L，肌醇0. 15g/L， 麦芽糖90g/L，乙酰丁香酮200umol/L，用氢氧化钠调节pH值至5. 8。4)、成熟胚愈伤组织侵染和共培养挑选步骤2~)所得的干燥致密、色泽乳黄、表面具有瘤状突起的胚性大麦愈伤组织，置于无菌滤纸上，在超净台上风干30min。将风干后的愈伤组织倒入活化好的农杆菌液 (步骤幻所得)中，要求愈伤组织能被活化好的农杆菌液充分浸没即可；盖紧试管后在摇床上以23°C、150rpm摇动40min ；倒掉菌液，将侵染后的愈伤组织转到无菌的滤纸上吸干多余菌液，然后将愈伤组织置于铺有一层滤纸的共培养基上，23°C下暗培养Mh。共培养基为基础培养液附加水解酪蛋白1.0g/L，脯氨酸0. 7g/L，肌醇0. 15g/L，麦芽糖90g/L，琼脂粉
0.6%,6-苄氨基嘌呤lmg/L，2，4-二氯苯氧乙酸0. lmg/L,用氢氧化钠调节pH值至5. 8。5)、愈伤组织的抑菌和恢复培养(即去除农杆菌与愈伤组织的恢复培养)将上述共培养后的愈伤组织转入铺有一层无菌滤纸的抑菌培养基上，以去除农杆菌，23°C下暗培养55h;抑菌培养基配方为基础培养液附加头孢霉素500mg/L，水解酪蛋白
1.Og/L,脯氨酸0. 7g/L，肌醇0. 15g/L，麦芽糖90g/L,琼脂粉0.6%,6-苄氨基嘌呤lmg/L, 2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L，用氢氧化钠调节pH值至5. 8。抑菌结束后将愈伤组织以无菌水冲洗两遍后在无菌滤纸上充分吸干水分，然后置于恢复培养基上23°C下暗培养3d。恢复培养基为基础培养液附加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇0. lg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉0. 68%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L，头孢霉素150mg/L，用氢氧化钠调节pH值至5. 8。恢复培养后的愈伤组织观察绿色荧光蛋白的表达，结果见图2。约32%的愈伤组织均能观察到绿色荧光，说明已被成功的转化。实施例2 选取两个大麦品种Golden Promise和早熟3号的健康成熟种子分别进行愈伤组织的诱导、分离及继代，步骤与实施例1 一致，但是转化时农杆菌携带的载体不同。本实施例2中采用农杆菌菌株LBA4404，携带改造后的pCambia1300质粒，携带有玉米泛素蛋白启动子(WDiquitin)驱动的草甘膦抗性基因。采用per技术来验证转化苗中是否带有转入的目的基因，具体如下愈伤组织经转化、抑菌和恢复培养后进行植株再生；步骤如下植株分化再生恢复培养后的愈伤组织转入分化培养基，进行植株分化再生，培养条件为高光照强度(60 80 μ E !1^1,251:, 16/8小时(光照/黑暗)，每14d继代(即，更换分化培养基)，继代培养的时间为2 3个月(若4个月后若仍无绿色植株再生，可停止继代)。分化培养基为基础培养液附加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇0. lg/L，麦芽糖30g/ L,琼脂粉0. 68 %，6-苄氨基嘌呤lmg/L，激动素(6-糖基氨基嘌呤)0. 5mg/L,用氢氧化钠调节pH值至5. 85。生根与移栽继代培养2 3个月时，可观察到绿色植株的再生。为了诱导强壮的根系，将发育良好的芽/小苗(长3 km)转入生根培养基，生根培养在高光照强度下(60 80 μ E !1^^),251:, 16/8小时(光照/黑暗)，培养3 4周。生根培养基为基础培养液附加蔗糖 30g/L, α-萘乙酸2. Omg/L，琼脂粉0.4%，用氢氧化钠调节pH值至5. 95。再生瓶(高度 10cm，直径7cm)含有50mL的上述生根培养基，4周后打开盖子，加入少许水，室温低光照下炼苗2 3d。然后将生根良好的植株分解成单茎幼苗，洗净琼脂后转移到基质中(蛭石 草炭=2 1)，于常规温室条件下培养。冬性品种植株先进行春化，4 5个月后收获成熟的种子。再生植株成苗后，提取基因组DNA进行PCR验证分析。对42个转化后成功再生的绿色植株进行PCR鉴定后，共检测到阳性植株为13个，转化率高达31%，高于以幼胚为外植体的遗传转化(Bartlett 等，Plant Methods 2008,4 22 doi 10. 1186/1746-4811-4-22)。本发明构建的大麦成熟胚转化体系，可研究转基因大麦植株与对照植株在相同遗传背景下，环境因素对植株生理生化以及代谢途径等方面的影响。尤其是可在控制的逆境胁迫(盐害，高温，低温，湿害，重金属等)下，研究胁迫耐性基因在特定条件下的表达模式， 并利用转基因技术创造新的优质抗逆大麦基因型，推动大麦遗传育种发展。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.农杆菌介导的大麦成熟胚愈伤组织转化方法，其特征是包括以下步骤A)、大麦成熟胚愈伤组织的诱导选取当年收获的、健康饱满的大麦成熟种子，切去胚乳后去壳，先用体积浓度为70 80%的乙醇振荡处理，倒去乙醇后，再加入体积浓度为10 20%次氯酸钠静置灭菌处理， 接着用无菌水清洗上述灭菌离体胚；最后将离体胚在无菌滤纸上吸干水分，用解剖刀沿颖果腹沟切成两半，将外植体切面朝下平铺于诱导培养基上，于22 25°C下暗培养14 20d ；诱导培养基为基础培养液附加L-谷氨酰胺0. 25g/L，水解酪蛋白0. 3g/L，脯氨酸0. 5g/ L,肌醇0. lg/L，麦芽糖60g/L,琼脂粉(Agar)0. 55%, 2,4- 二氯苯氧乙酸4mg/L ；调节pH值至 5.8 ；所述基础培养液由以下含量的组分以及蒸馏水组成MnSO4 · 4H2022. 3mg/L ，KNO32800mg/L,ZnSO4 · 7H208.6mg/L ，(NH4)2SO4460mg/L,H3BO36. 2mg/L ，KH2PO4400mg/L,Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L,MgSO4 · 7H20185mg/L,CuSO4 · 5H200.025mg/L,CaCl2 · 2H20165mg/L,CoCl2 · 6H200.025mg/L,维生素 B1lOmg/L,KI0. 83mg/L ，维生素 1. Omg/L,Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L ，甘氨酸2mg/L ，FeSO4 · 7H2027.8mg/L,烟酸0. 5mg/L ； B)、初代愈伤组织的分离和继代上述14 20d的培养结束后，将所得的初代愈伤组织转移到继代培养基上，于22 25 °C下暗培养14 20d ；所述继代培养基为基础培养液附加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇0. lg/L, 麦芽糖30g/L，琼脂粉0. 60 %，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L,调节pH 值至5. 8 ；C)、农杆菌培养和活化选用带有所需基因的农杆菌LBA4404，利用活化培养基将菌液浓度调节到0D600值 0. 8 1. 2 ；于22 25°C静置活化2 3h ；所述活化培养基配方为基础培养液附加水解酪蛋白1. Og/L,脯氨酸0. 7g/L，肌醇 0. 15g/L，麦芽糖90g/L,乙酰丁香酮200umol/L ；调节pH值至5. 8 ；D)、成熟胚愈伤组织侵染和共培养将步骤2)所得的愈伤组织风干后加入至步骤幻所得的活化好的农杆菌液中浸泡 30 40min，得侵染后愈伤组织；先将侵染后愈伤组织转到无菌的滤纸上吸干侵染后愈伤组织表面的多余菌液，然后将侵染后愈伤组织置于铺有一层滤纸的共培养基上，22 25°C下暗培养48 72h ；所述共培养基为基础培养液附加水解酪蛋白1. Og/L，脯氨酸0. 7g/L，肌醇0. 15g/L，麦芽糖90g/L，琼脂粉0. 6%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L ；调节pH值至 5. 8 ；E)、愈伤组织的抑菌和恢复培养将上述步骤D)所得的共培养后愈伤组织转入铺有一层无菌滤纸的抑菌培养基，以去除农杆菌，于22 25°C下暗培养2 3d ；所述抑菌培养基配方为基础培养液附加头孢霉素500mg/L，水解酪蛋白1. Og/L，脯氨酸0. 7g/L，肌醇0. 15g/L，麦芽糖90g/L，琼脂粉0. 6%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L,调节pH值至5. 8 ；将抑菌结束后所得的愈伤组织在无菌滤纸上吸干水分，或以无菌水冲洗两遍后再吸干水分，然后置于恢复培养基上22 25°C下暗培养3 4d ；所述恢复培养基为基础培养液附加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇0. lg/L， 麦芽糖30g/L，琼脂粉0. 68%，6-苄氨基嘌呤lmg/L，2,4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L,头孢霉素 150mg/L ；调节 pH 值至 5.8。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大麦成熟胚愈伤组织转化方法，其特征是还包括以下步骤F)、植株再生将恢复培养后所得的愈伤组织转入分化培养基，培养条件为60 80 μ E m-2s-l的高光照强度，23 27°C，16小时光照/8小时黑暗；每13 15d继代；共继代培养2 4个月；所述分化培养基为基础培养液附加水解酪蛋白0. 5g/L，脯氨酸0. 5g/L，肌醇0. lg/L, 麦芽糖30g/L,琼脂粉0. 68%,6-苄氨基嘌呤lmg/L,激动素0. 5mg/L ；调节pH值至5. 85 ；G)、生根与移栽将继代培养所得的发育良好的芽/小苗转入生根培养基，生根培养在60 80 μ E Hi-2S-1 的高光照强度下，23 27°C，16小时光照/8小时黑暗；培养时间为3 4周；所述生根培养基为基础培养液附加蔗糖30g/L，α -萘乙酸2. Omg/L，琼脂粉0. 4%，调节PH值至5. 95 ；将生根培养所得的植株移栽后于常规温室条件下培养。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，公开了一种农杆菌介导的大麦成熟胚愈伤组织遗传转化方法和相应的组织培养体系。本发明以成熟胚愈伤组织为受体，以农杆菌菌株LBA4404介导，成功的将外源的绿色荧光蛋白基因和草甘膦抗性基因导入不同大麦品种中。本发明具体包括大麦成熟胚愈伤组织的诱导、初代愈伤组织的分离和继代、农杆菌培养和活化、成熟胚愈伤组织侵染和共培养、愈伤组织的抑菌和恢复培养。经报告基因(GFP)和聚合酶链式反应(PCR)的检测表明，转基因植株中实现了DNA的转化。本发明的方法为大麦基因克隆与功能分析、性状改良等开辟了新的途径。
文档编号C12N15/84GK102296086SQ201110278559
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者巫小建, 张国平, 王静, 金晓丽, 韩勇 申请人:浙江大学