专利名称：微生物发酵合成阿卡波糖的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及一种微生物发酵合成阿卡波糖的方法，特别涉及一种在发酵过程中通过添加腺苷蛋氨酸来提高阿卡波糖合成产量的方法。
背景技术：
阿卡波糖(Acarbose)是一种有效的α -糖苷酶抑制剂，它通过竞争性地抑制小肠壁上参与碳水化合物降解的α -葡萄糖苷酶的活性，延迟碳水化合物的分解消化，延缓和减少葡萄糖的吸收，从而达到控制人体内餐后的血糖水平，是临床上用于治疗II型糖尿病的口服药物。阿卡波糖分子式为C25H43NO18,分子量645. 6，pKal值为5. 1。上世纪70年代初 Frommer等人于从放线菌Actinoplanes utahensis的培养液中首先分离得到阿卡波糖，后经德国拜耳(Bayer)制药公司研制开发，1990年阿卡波糖首先在德国上市，1996年获得FDA 批准在美国上市。根据文献和专利报道，目前国内外阿卡波糖的生产都是利用微生物发酵法制备而得到，其中游动放线菌应用的最为广泛。为获得高时空得率的产物，降低生产成本，以往大多数的研究多集中在高产菌株的诱变选育(包括采用物理、化学等常规方法进行诱变，也包括利用分子生物学技术改造菌种)、发酵培养基(包括碳源、氮源、金属离子等)的优化、 发酵条件(包括温度、PH、溶氧、渗透压、搅拌等条件)的优化以及对阿卡波糖生物合成途径中相关基因簇的研究等方面。对于发酵培养基的优化策略，目前主要是通过选择合适的碳氮源，并控制发酵液中葡萄糖和麦芽糖的适当比例以及设计合理的补料策略来提高阿卡波糖的发酵单位。Lee 等研究发现，添加麦芽糖比添加葡萄糖更有利于阿卡波糖的生产，示踪研究结果表明，阿卡波糖的麦芽糖基团是直接从麦芽糖、麦芽三糖或较高分子的麦芽寡糖中得到；高敬红等用Actinoplanes sp AC-17发酵生产阿卡波糖时研究发现，当葡萄糖和麦芽糖的质量比为 2 1时最有利于被菌体摄取用于阿卡波糖的生物合成。而对于发酵条件的优化策略，研究者发现，除了常规发酵参数，如温度、PH、溶氧等条件会对发酵产量造成一定的影响，同时在微生物发酵中通常不考虑的一个参数-渗透压，对阿卡波糖发酵的最终收率也具有明显的影响作用，因而渗透压参数在发酵过程中也常被控制在一个合理的范围内。Beunink等研究发现，Actinoplanes sp. SE50/110生产阿卡波糖时，培养液的渗透压值在300 500m0sm/ kg之间有助于阿卡波糖的生产，其最适宜的渗透压值为400m0sm/kg ；Choi和Siin的研究表明，Actinoplanes sp. ATCC31044突变株CKD485-16最适宜的渗透压值为500m0sm/kg，发酵水平达到3200mg/L，提高了 39%。阿卡波糖结构类似物是阿卡波糖发酵液中的常见杂质，阿卡波糖的结构(如式I 所示)及其同系物的结构如表1所示。欧洲药典对杂质组分的含量有严格的限制，特别是杂质组分C，其与阿卡波糖分子的结构差异仅在于末端糖苷键的不同，致使产品提取分离难度大，成本高。欧洲最新药典要求杂质组分C的含量小于1.5%。因此，在生产过程中如何有效控制并降低杂质C的含量是工业化生产阿卡波糖的一个重要环节。在现有的阿卡波糖生产工艺中，使用凝胶、大孔树脂等可以去除杂质C或使其含量下降。但是，使用以上工艺在实际工业化生产中存在着上样量小，收率低、成本高、质量低等诸多缺陷。
权利要求
1. 一种微生物发酵合成阿卡波糖的方法，所述的方法为将阿卡波糖产生菌CCTCC NO =M 209022，接种至适用于所述菌株的含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基中，在温度 20 32°C进行发酵培养96 192小时，发酵结束后，得发酵液提取分离，得到所述阿卡波糖，其特征在于，发酵培养进行0 60h之间，加入如式II所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1 300 μ mol/L ；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述腺苷蛋氨酸的水溶液的浓度为0.25 50mmol/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于在发酵培养进行0 3 之间，加入如式II 所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，所述腺苷蛋氨酸的水溶液的加入方式为下列之一 (1) 一次性加入；( 分批间歇加入；(；3)流动连续加入。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养进行0 60h之间，加入如式II所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为10 100 μ mol/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中，所述的碳源为下列之一或几种任意组合葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、糖蜜、秸秆水解液或菊芋水解液；所述的氮源为下列之一或几种任意组合肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、 玉米浆、蛋白胨、尿素或氨盐；所述的无机盐为下列之一或几种任意组合Na盐、K盐、Ca盐、 Mg盐、Fe盐、Mn盐、Zn盐、Co盐或Ni盐。
6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基初始pH值为pH6. 0 8. 0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成如下麦芽糖80.Og/ L，葡萄糖 20. Og/L,黄豆饼粉 10. 0，g/L，玉米浆 5. Og/L, FeCl3O. lg/L，CaCl22. Og/L, CaC036 . 0g/L，溶剂为水，初始 pH 7.0。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法为将置于低温保存的阿卡波糖产生菌CCTCC NO =M 209022转移到新鲜、无菌固体平板上，活化2 3天，挑取菌落接种至种子培养基，在温度^°C，通风搅拌或震荡下培养M 96小时，得到种子液；将种子液与发酵培养基以体积比1 10%的接种量接种至发酵培养基，在温度^°C，通风搅拌或震荡下进行发酵培养96 192小时，在培养至0 60小时期间，加入0. 25 50mmol/L腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1 300 μ mol/L ；发酵结束后，得发酵液提取分离，得所述阿卡波糖。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行(1)将置于低温保存的阿卡波糖产生菌CCTCC NO =M 209022转移到新鲜、无菌固体平板上，28°C活化2 3天，挑取菌落接种至种子培养基，在温度^°C，通风搅拌或震荡下培养M 96小时，得到种子液，所述种子培养基组成如下玉米淀粉15. Og/L，黄豆饼粉40. Og/L，甘油20. Og/L, K2HPO4O. lg/L，CaC032. Og/L，溶剂为水，初始 ρΗ7· 0 ；(2)将种子液与发酵培养基以体积比1 10%的接种量接种至发酵培养基，在温度观！，通风搅拌或震荡下进行发酵培养96 192小时，在培养至0 60小时期间， 加入0. 25 50mmol/L腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1 300 μ mol/L ；所述发酵培养基组成如下麦芽糖80. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L,黄豆饼粉10. 0， g/L，玉米浆 5. 0g/L, FeCl3O. lg/L, CaCl22. 0g/L, CaC036. 0g/L，溶剂为水，初始 pH 7. 0 ；(3)发酵结束后，得发酵液提取分离，得所述阿卡波糖。
10.如权利要求1或9所述的方法，其特征在于所述发酵液提取分离的方法为发酵液调节PH值至3，然后进行离心或过滤，得到澄清的阿卡波糖滤液；采用强酸型阳离子交换树脂吸附、洗脱；收集液经脱盐、高分辨率阳离子交换树脂精制，中和，冷冻干燥，制得阿卡波糖。
全文摘要
本发明公开了一种微生物发酵合成阿卡波糖的方法，所述的方法为将阿卡波糖产生菌CCTCC NOM 209022，接种至适用于所述菌株的含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基中，在温度20～32℃进行发酵培养96～192小时，发酵结束后，得发酵液提取分离，得到所述阿卡波糖，其特征在于，发酵培养进行0～60h之间，加入腺苷蛋氨酸的水溶液，使发酵培养基中腺苷蛋氨酸的浓度为1～300μmol/L。本发明通过在阿卡波糖发酵过程中补加腺苷蛋氨酸，提高了阿卡波糖的发酵水平。
文档编号C12R1/045GK102399837SQ201110293699
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者孙丽慧, 李明刚, 沈寅初, 王远山, 郑裕国 申请人:浙江工业大学