专利名称：一种PsPR10P796启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子及其应用，特别涉及一种PsPR10P796启动子及其应用。
背景技术：
启动子是DNA上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域。外源基因在转基因作物体内的表达依靠启动子对其的调控作用，表达量不足往往得不到理想转基因植物。 因此，选择合适的植物启动子是增强外源基因表达首要问题。根据启动子所控制的基因表达范围和方式不同，启动子可以分成组成型启动子和特异性启动子。在组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。外源基因在植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长和发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，近年来人们对特异性启动子的研究越来越重视。随着植物根特异性表达启动子研究的不断改进，现已分离了一些植物根特异性表达基因和增强序列，这些序列能在根部特异性或优先激活从而启动基因的表达，启动子中存在负责根特异性表达的顺式作用元件，受外来因素诱导或特定蛋白调控，包括组织特异性启动子和诱导表达型启动子。例如来自烟草的富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)基因，尽管其表达水平很低但是根特异性的，在烟草侧根分化诱导过程中，在中柱鞘和内皮层中其启动子表现短时间活跃，特别是后期根发生组织细胞中活性强，属于组织特异性启动子。诱导表达是指植物细胞由于环境的变化而导致相关基因的表达。植物体内存在着一套防御机制来对付不良环境，在这个过程中，环境诱导基因启动子起着关键的作用。根对于植物从土壤中吸收水分和养分，维持正常生长具有重要作用。在环境胁迫下，最先受到影响的器官是根部组织，如果将根部诱导型特异性启动子应用于植物抗胁迫基因工程中，使抗性基因在根部细胞中特异表达，这样就能降低能量消耗，使转基因植物在获得抗性的同时，又不影响正常的生长发育，对抗逆、抗病虫的基因工程具有十分重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供一种能够调控目的基因高效特异表达于植物的根部组织的 PsPR10P796启动子，并应用于植物抗逆基因工程。本发明采用的技术方案是一种I^raiOP796启动子，所述启动子含有下列任意一组核苷酸序列a、SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列；b、与SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列互补的序列；本发明也不排除对上述a或b所述序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或修饰的核苷酸序列；或与上述a或b所述序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。进一步，所述的I^raiOP796启动子优选为含有SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列的
启动子。一种DNA构建体，所述DNA构建体包含所述的Ι^Ι^10Ρ796启动子以及与之进行可操作连接的基因序列。一种载体，所述载体含有所述的启动子或所述的DNA构建体。一种重组细胞，所述的重组细胞包含所述的启动子或所述的DNA构建体或所述的载体。进一步，所述的重组细胞优选为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。一种含有所述的启动子或所述的DNA构建体或所述的载体或所述重组细胞的植物愈伤组织或植物。进一步，所述的植物愈伤组织或植物优选为烟草。所述的PsPR10P796启动子在植物抗逆基因工程中的应用。进一步，所述的I^raiOP796启动子在植物抗逆基因工程中的应用为Ι^Ι^10Ρ796 启动子在在抗逆转基因烟草中的应用，将抗逆基因置于I^raiOP796启动子下游，构建植物表达载体，将载体导入烟草，得到抗逆转基因烟草。本发明提供的启动子核苷酸序列来自美洲东部白松(Pinus strobus) 0本发明利用同源克隆和RACE技术获得美洲东部白松I3sI3RIO基因上游796bp序列启动子，其核苷酸如SEQ. ID. NO. 1所示，具体方法如下本发明从美洲东部白松根中提取 DNA，根据国际基因库(GenBank)中已经发布的其它植物I3RlO基因上游DNA序列，设计引物，序列如下Fl :AAAAGCTTCTCGAGATGACTCTTRl :CATTTTCAACTCTCT CGCAACTA利用上述引物进行常规聚合酶链式反应(PCR)。将PCR产物与克隆载体(pEASY-T) 连接转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后筛选阳性重组子，进行序列测序，根据获得的序列设计引物，引物序列如下F796 :AAAAGCTTGGTGATTACTCCAACAAAATCR2 :AAGGATCCCATTTTCAACTCTCTCGCAAC以美洲东部白松根DNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物与克隆载体(pEASY_T)连接转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，然后筛选阳性重组子，进行序列测序，得到一个796bp 启动子序列，将该序列命名为PsPR10P796。该启动子序列SEQ. ID. NO. 1信息如下
长度:796bp
类型核酸
链型双链
来源美洲东部白松(Pinus ttrobus)
-796GTGATTACTCCAACA
-781AAATCTAATCCATCAATAAAAATGTACACAAACTAATTTTCATTTAATCTTTTTCTGCCC
-721ATTTAATAAAAAGATCAAAATTCTGGCAGCCGAATATTTGGTCTTTTGAACTTAACGAAT
-661ATATATATATCCACTGAAAAGTCATTTTGAAATATATGCATTCCACGGTAGCGATGGCAC
-601GGCGTTGGTGAATGTAGAAGCCTTTGTAAGCAATTTACGGCGTCTTTGACATTTGTGTAT
-541CTCTTCTAGATGGGTTAACAACACGGACTGACAAAACCGCGGTGGTTAGGGAAGTTAGAA
-481ACGATATTCATTGAAGGATCAGCCTGTAAATAAATAAATAAAAACAAATTATCCATTTCA
-421TGTCTTATCTTGTTATCTGGTCGTATCTACTCTTTGTCATTAATCGTCTCTGAAAGTGGG
-361AACCGGAACCGGAATCGTCTCTTGTCATTAGATGAGAAGAGAAATAACAAATCACCATGG
-301GATCTAGAAACATCCATCCATTCCGTTTATTCAAAGTCAGCACACACAGTGGGGTCCGGG
-241GGATCGTTGTCCTTTAGGACTTATCGAAACCAGGCATGGAGCTCGGTATTGTCGGCCACA
-181AAGGCCAAGGGTTCAATAAGAAAACCCAAGTAGTTGGCATTATGTGCGTCCATCGGTCAG
-121TCCAAATAACAAATAGTCACTTTCGAGTCTCATGTCATTACCTACGCGCTCTCTTTAATG
-61 TACAGATTTTAAAGGTTTGTAAACGACTACTATAAATACGGGCTCGTCTAGTGCAGTTGA
-1 GAACAAGGAGCTTTGTGCGATAATATTGAAGAAATATAAGTATTGTGTAGTTGCGAGAGA
60 GTTGAAAATG启动子序列SEQ. ID. NO. 1中负号表示启动子序列，正号表示启动子下游序列。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种新的 I^raiOP796启动子，具有较高的根特异诱导表达活性，能够提高下游抗逆基因根特异转录水平，从而能够增强转基因植物抗逆能力。
图1转基因烟草受不同信号分子诱导后⑶S在I^raiOP796启动子驱动下表达能力，(A B)为T3代对照处理转基因烟草；(C H)为T3转基因烟草分别利用以下信号分子处理NaCl，甘露醇，聚乙二醇，脱落酸，茉莉酸，水杨酸。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此基于本生烟草生长速度快、生活周期短、离体培养再生能力强和遗传转化效率高等特点，在下述实施例中以烟草为例对本发明进行了详细说明。氨苄LB固体培养基、LB固体培养基、MS培养基、YEP培养基、MS液体培养基、MS预分化培养基、MS基本培养基、MS生根培养基、1/2MS培养基及其组成均为公知常识。实施例1 调控目的基因高效特异表达于植物的根部组织的美洲东部白松 ^Ι^10Ρ796启动子的克隆1. DNA提取利用植物DNA提取试剂盒(TransGen，Bei jing)提取美洲东部白松基因组DNA，作为模板。2. PRlO基因上游DNA序列扩增利用引物Fl :AAAAGCTTCTCGAGATGACTCTT 和 Rl :CATTTTCAACTCTCT CGCAACTA 进行PCR扩增，体系如下10XBuffer5 μ L, 10mmoL/L dNTP 2 μ L，PCR引物各25pmol，DNA模板 1 μ L (约200ng)，Taq酶2U，加灭菌双蒸水至50 μ L0PCR反应步骤为94°C预变性5min ；93°C 变性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸90sec，循环30次；最后72°C延伸lOmin。琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒(TransGen，Beijing)回收片段，将所得片段连入pEASY_T载体(TransGen，Beijing)，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞CTransGen，Bei jing)，然后利用氨苄LB固体培养基筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，然后进行序列测序，获得一个1750bp 序列。
3. PsPR10P796 启动子获得利用引物F796 :AAAAGC TTG TGATTACTC CAACAAAAT C 禾口 R2 :AAG GAT CCC ATT TTC AAC TCT CTC GCAAC进行PCR扩增，体系如下=IOXBuffer 5 μ L, 10mmoL/L dNTP 2 μ L, PCR引物各25pmol，DNA模板1 μ L(以步骤2获得的1750bp序列为模板)，Taq酶2U，加灭菌双蒸水至50 μ L。PCR反应步骤为94°C预变性5min ；93°C变性30sec，5(TC退火30sec， 72°C延伸60sec，循环30次；最后72°C延伸lOmin。1 %琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒(TransGen，Beijing)回收片段，将所得片段连入pEASY_T载体，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后利用含50mg/mL氨苄的LB固体培养基筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，然后进行序列测序，获得一个796bp序列，命名为I^raiOP796启动子。实施例2 表达载体构建及重组细胞的构建(1)根据分离的I^raiOP796启动子核苷酸序列，设计引物正向引物5，-AAAAGCTTGGTGATTACTCCAACAAAATC-3，划横线部分为HindIII酶切位点反向引物5，-AAGGATCCCATTTTCAACTCTCTCGCAAC-3，划横线部分为BamH I酶切位点以该启动子全长测序质粒为模板，利用上述正向和反向引物进行PCR反应。(2)取步骤(I)PCR 产物 2μ L 与克隆载体 pEASY_T(TransGen，Beijing)连接转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(TransGen，Beijing)，然后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜，筛选阳性重组子，进行PCR鉴定，获得阳性大肠杆菌。(3)利用质粒提取试剂盒(TransGen，Beijing)提取上述步骤(2)得到的阳性大肠杆菌的质粒，将质粒用HindIII和BamH I酶切，与用相同限制酶酶切的pBI121表达载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜，对生长出的菌落进行PCR鉴定和质粒酶切鉴定，获得表达载体pBI 121。(4)取5μ 1表达载体pBI121，加入200μ 1农杆菌感受态细胞(Agrobacterium tumefaciens)，混勻；冰浴5min，再利用液氮冷冻lmin，迅速置于37°C水浴温育5min，然后冰浴aiiin ；加入800 μ 1 YEB液体培养基，在，250r/min培养4 证；用移液器将培养液转移至YEB固体培养基(含100 μ g/ml利福平，50 μ g/ml卡那霉素)表面，均勻涂布于整个平板；倒置培养1 2d，可看到单克隆，挑取单菌落用微量碱法提取质粒，进行PCR 和酶切检测，获得重组农杆菌细胞。实施例3 转基因植株的获得(1)本生烟草(Nicotiana tabacum)种子，播种于MS培养基中，25°C培养至5 6 片真叶期，备用。(2)挑取实施例2获得的重组农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含 50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，，250rpm，振荡培养4 至对数生长后期，将菌液用 MS液体培养基稀释10倍待用。(3)取步骤(1)培养的烟草叶片剪切成5mmX5mm小块，置于MS预分化培养基中， 280C，光照为16h/d，2000Lux,预培养2d，获得预培养后的烟草叶片外植体。(4)将步骤( 预培养后的烟草叶片外植体浸入上述步骤( 菌液中5 lOmin， 用灭菌滤纸吸干多余菌液，转入MS基本培养基，弱光，280C，共培养2d。
(5)将步骤(4)共培养后的烟草叶片外植体先用含氨苄青霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含氨苄青霉素250mg/L的MS培养基洗涤1次，然后用滤纸吸干，转入含卡那霉素100mg/L，氨苄青霉素250mg/L的MS培养基上，25°C恒温培养至芽长至Icm时，切下芽后，将芽转入含卡那霉素50mg/L，氨苄青霉素250mg/L的MS生根培养基中，25 °C培养促进生根，生根后，移入无菌土的花盆中，温室中25°C培养收种子，获得T1、T2和Τ3代转基因烟草种子。(6)转基因阳性植株的鉴定将步骤(5)中获得的Τ1、Τ2和Τ3代转基因烟草种子先用70%乙醇消毒30 60s，10%次氯酸钠消毒15min，用灭菌水漂洗至少4次；去尽水加入0.2%的琼脂，将种子均勻分布到V2MS培养基(含50mg/L卡那霉素)表面；转入光照培养箱中培养10天，叶片颜色为绿色的幼苗即为阳性苗(烟草转基因阳性植株)，并提取烟草转基因阳性植株叶片基因组DNA，禾Ij用PCR验证获得的转基因阳性植株。实施例4 启动子提高根部基因表达能力分析将上述实施例3获得的T3代烟草转基因阳性植株分别置于NaCl (200mM)，甘露醇 (300mM)和聚乙二醇(15% )胁迫条件下，或叶面喷洒水杨酸(5mM)，脱落酸(100 μ M)和茉莉酸(100 μ Μ)，并以相应无菌水处理作为对照。对小时后，GUS染色检测转基因烟草中 PsPR10P796启动子下游⑶S基因表达活性，结果见图1，(Α B)为Τ3代对照处理转基因烟草；(C H) Τ3代转基因烟草分别利用以下信号分子处理=NaCl，甘露醇，聚乙二醇，脱落酸，茉莉酸，水杨酸。通过以上胁迫诱导和信号分子诱导实验，发现Ι^Ι^10Ρ796启动子能够激活下游⑶S基因表达活性显著上调，达到1200pM Hig-1Iiiirr1,说明I^raiOP796启动子具有较高的根特异诱导表达能力。该基因可以转化水稻等农作物，提高其抗胁迫能力，具有重大的经济和社会价值。
权利要求
1.一种I^PR10P796启动子，其特征在于所述启动子含有下列任意一组核苷酸序列a、 SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列；b、与SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列互补的序列。
2.如权利要求1所述的I^raiOP796启动子，其特征在于所述启动子为含有SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列的启动子。
3.一种DNA构建体，其特征在于所述DNA构建体包含权利要求1所述的Ι^Ι^10Ρ796启动子以及与之进行可操作连接的基因序列。
4.一种载体，其特征在于所述载体含有权利要求1所述的启动子或权利要求3所述的 DNA构建体。
5.一种重组细胞，其特征在于所述的重组细胞包含权利要求1所述的启动子或权利要求3所述的DNA构建体或权利要求4所述的载体。
6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于所述的重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。
7.一种含有权利要求1或2所述的启动子或权利要求3所述的DNA构建体或权利要求 4所述的载体或权利要求5所述重组细胞的植物愈伤组织或植物。
8.如权利要求7所述的植物愈伤组织或植物为烟草。
9.如权利要求1或2所述的PsPR10P796启动子在植物抗逆基因工程中的应用。
10.如权利要求9所述的I^raiOP796启动子在植物抗逆基因工程中的应用，其特征在于所述的应用为I^raiOP796启动子在在抗逆转基因烟草中的应用，将抗逆基因置于 PsPR10P796启动子下游，构建植物表达载体，将载体导入烟草，得到抗逆转基因烟草。
全文摘要
本发明公开了一种PsPR10P796启动子、DNA构建体、载体、重组细胞、植物愈伤组织或植物及所述的PsPR10P796启动子在植物抗逆基因工程中的应用，所述启动子含有下列任意一组核苷酸序列a、SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列；b、与SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列互补的序列；本发明PsPR10P796启动子具有较高的根特异诱导表达活性，能够提高下游抗逆基因根特异转录水平，从而能够增强转基因植物抗逆能力。
文档编号C12N1/21GK102559675SQ20111038431
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者徐祥彬, 王慧中 申请人:杭州师范大学