专利名称：酵母由木质纤维素和甘油生产生物柴油的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过基因工程改变酵母中的脂质生物合成代谢途径，以利用葡萄糖、淀粉、木质纤维素和甘油基底物中的一种或更多种作为碳源过量产生和分泌脂肪酸酯(生物柴油)进入周围培养基。
背景技术：
生物柴油是指包含来源于植物油或动物脂肪的长链脂肪酸的单烷基酯的燃料，称作B100，并且满足了 ASTM D6571的需要。当前，产生生物柴油的最常用方法是可食用和不可食用的植物油或有时动物脂肪的转酯基反应。转酯基反应在醇如甲醇或乙醇和催化剂如碱或酸的存在下将甘油三酯转化 成脂肪酸烷基酯，其副产物是甘油。生物柴油具有与石油柴油相当的十六烧值和能值(energy content),因此被认为是石油柴油的极好替代品。其可以以纯的形式(100% )或以各种比例与石油柴油共混使用。大豆和油菜籽是用于产生生物柴油的植物油的通常来源。这些植物油为甘油三酯形式，之后需要将其降解成游离脂肪酸和甘油，之后脂肪酸通过已知为“转酯基”的方法化学或酶促酯化。这需要可用于粮食作物和燃料作物生产的可利用耕地上的无数植株，因此对于食品价格造成了不期望的压力。此外，因为油料种子是季节性作物，一旦收获并利用，就必须等待到下次收获。因此，需要克服食物或燃料的两难选择，并且需要持续将全球能量消耗从化石燃料向环保的生物燃料转移。另一个目的是开发能源，例如作为现有生物柴油工业副产物的便宜碳源(甘油)和最丰富的天然的不可食用糖源(即木质纤维素)。非淀粉碳源如纤维素、半纤维素、木糖和木质素的利用不仅将有利于经济地大量产生生物柴油，还将减少满足社会食物需求的农业资源植株。尽管已经尝试利用微生物有机体产生生物柴油，但是成功的主要障碍是开发稳定高产的微生物及产生其的方法。
发明内容
本发明涉及用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的经遗传修饰微生物，其中所述微生物的特征在于:脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通过以下一个或更多个方法实现:FAA2基因缺失；FAA1基因、FAA3基因和FAA4基因中任一个缺失；重组内源FAAl基因、FAA3基因或FAA4基因，其中所述基因与异源启动子有效连接；和/或乙酰CoA羧化酶的表达增强，其通过以下方法实现:重组内源基因ACCl基因，其中所述基因与异源启动子有效连接。例如所述微生物选自物种:曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、键刀菌属(Fusarium)、Lindnera、油脂酵母属(Lipomyces)、红曲霉属(Monascus)、毛霉属(Mucor)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia),根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosacchromyces)、丝抱酵母属(Trichosporon)、耶氏酵母属(Yarrowia)、和接合酵母属(Zygosacchromyces)。优选地，所述经遗传修饰生物是酵母属物种，特别是酿酒酵母。在一个实施方案中，所述经遗传修饰微生物的特征在于与来自酵母的TEFl启动子[SEQ ID NO:113]有效连接的重组内源ACCl基因。在一个实施方案中，所述经遗传修饰微生物的特征在于包含转基因，所述转基因编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶。所述经遗传修饰微生物包括FAA2缺失(或FAAl、FAA3或FAA4缺失)或者与异源启动子有效连接的重组内源ACCl基因，其特征可在于还包括转基因，所述转基因编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶。所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括转基因，所述转基因编码酰基CoA-ACP硫酯酶，其中所 述硫酯酶选自:大豆(Soyabean) (Glycinemax)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (Protein ID-A8HY17)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Protein ID-Q9SJE2)、蓖麻(Ricinuscommunis) (Protein ID-B9RAC3)、小麦(Triticumaestivum)、油菜(Brassica napus) CtFatA (Protein ID-Q43745)、红花(C.tinctorius)CtFatA(Protein ID-Q42715)、山竹(G.mangostana)GmFatAl (ProteinID-004792)、萼距花(C.hookeriana)CwFatBl (Protein ID-Q395I3)、赖特萼距花(C.wrightii)CwFatBl (蛋白质ID-Q39662)、山竹(G.Mangostana) GmFatBl (蛋白质 ID-004794)。所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括酰基辅酶A:乙醇0-酰基转移酶的表达增强，其通过重组内源乙酰辅酶A:乙醇0-酰基转移酶(EEBl)基因实现，其中所述基因与异源启动子有效连接。所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括编码异源胞浆酰基CoA硫酯酶(CTE-1)的转基因，其中所述 CTE-1 选自小鼠(Mus muscilis) (Protein ID-055137)、拟南芥(Protein ID-Q5FYU1)或大鼠(Rattusnorvegicus) (Protein ID-Q6AZ44)。所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括编码异源甘油激酶或木糖异构酶或编码二者的一个或更多个的转基因；其中所述甘油激酶选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甘油激酶(Protein ID-P32190),而所述木糖异构酶选自植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentas)木糖异构酶(Protein ID-A9KN98)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)木糖异构酶(Protein ID-Q8Z9Z1)。所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括内源甲酸脱氢酶FDH基因的缺失，其中所述 FDH 基因选自=GeneID:854570, GeneID:8300341 和 GeneID:2907923。所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括编码异源甲酸氢裂合酶的转基因，其中所述裂合酶为大肠杆菌(E.coli)甲酸氢裂合酶(ProteinID-C8UET5)。所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括内源醇脱氢酶(ADH)基因的缺失，其中所述 ADH 基因选自=GeneID:854068, GeneID:2538902, GeneID:2868277 和 GeneID:852442。本发明还涉及酵母或真菌菌株用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的用途，其中所述酵母或真菌菌株选自:热带假丝酵母(Candida tropicalis)、嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)、酵母FAA2缺失菌株和任一上述经遗传修饰微生物的酵母或真菌菌株。本发明还涉及用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的方法，包括步骤:a)向生长培养基中引入微生物酵母或真菌菌株以产生培养物山)孵育所述培养物，其中向所述培养物中的所述生长培养基通氧；c)在步骤b)后在不供应氧的情况下进一步孵育所述培养物；d)从所述培养物中回收包含游离脂肪酸和酯的胞外相；其中所述微生物为酵母或真菌菌株。所述方法还可使用选自热带假丝酵母、嗜鞣管囊酵母或任何上述经遗传修饰微生物的微生物。在一个实施方案中，所述方法的生长培养基包含选自葡萄糖、甘油、木糖、水解纤维素和半纤维素、淀粉、糖醇和木聚糖中至少之一的碳源，优选地，所述生长培养基包含下文所述成分或由其组成。本发明还提供了适于上述方法使用的生长培养基，其中所述培养基的组成包含以下成分。
权利要求
1.一种用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的经遗传修饰微生物，其中所述微生物的特征在于: a.脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通过FAA2基因缺失实现，和 b.乙酰CoA羧化酶的表达增强，其通过重组内源ACCl基因实现，其中所述基因与异源启动子有效连接，或 c.编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的转基因， 其中所述微生物选自物种:曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、键刀菌属(Fusarium)、Lindnera、油脂酵母属(Lipomyces)、红曲霉属(Monascus)、毛霉属(Mucor)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia),根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium),红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces),裂殖酵母属(Schizosacchromyces),丝抱酵母属(Trichosporon)、耶氏酵母属(Yarrowia)、和接合酵母属(Zygosacchromyces)。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰微生物，其特征在于:(a)的FAA2基因缺失，与异源启动子有效连接的重组内源ACCl基因(b)，和编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的转基因。
3.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于编码酰基CoA-ACP硫酯酶的转基因，其中所述硫酯酶选自:大豆(Soyabean) (Glycine max)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (Protein ID-A8HY17 ；SEQ ID NO:53)、拟南芥(Arabidopsis thaliana) (Protein ID-Q9SJE2 ;SEQ ID NO:54)、蓖麻(Ricinus communis)(Protein ID-B9RAC3 ；SEQ ID NO:56)、小麦(Triticum aestivum) (GeneID:543005)、油菜(Brassica napus)的 CtFatA (Protein ID-Q43745 ；SEQID NO:58)、红花(C.tinctorius)的 CtFatA (Protein ID-Q42715 ；SEQ IDNO:60)、山竹(G.mangostana)的 GmFatAl (ProteinID-004792 ；SEQID NO:62)、萼距花(C.hookeriana)的CwFatBl (Protein ID-Q39513 ；SEQIDNO:64)、赖特萼距花(C.wrightii)的 CwFatBl (蛋白质 ID-Q39662 ；SEQ ID NO:66)、山竹(G.Mangostana)的 GmFatBl (蛋白质 ID-004794 ；SEQ ID NO:68)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于酰基辅酶A:乙醇0-酰基转移酶的表达增强，其通过如下实现:a.重组内源酰基辅酶A:乙醇0-酰基转移酶(EEBl)基因，其中所述基因与异源启动子有效连接。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于编码异源胞浆酰基CoA硫酯酶(CTE-1)的转基因，其中所述CTE-1选自小鼠(Mus muscilis) (ProteinID-055137 ；SEQ ID NO:74)、拟南芥(Protein ID-Q5FYU1 ；SEQ ID NO:76)或大鼠(Rattusnorvegicus)(Protein ID-Q6AZ44 ；SEQ ID NO:78)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于编码异源甘油激酶或木糖异构酶或编码二者的一个或更多个转基因，其中所述甘油激酶选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甘油激酶(Protein ID-P32190 ;SEQ ID NO:92),而所述木糖异构酶选自植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentas)木糖异构酶(ProteinID-A9KN98 ；SEQ ID NO:88)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)木糖异构酶(ProteinID-Q8Z9Z1 ；SEQ ID NO:90)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于内源甲酸脱氢酶FDH基因的缺失，其中所述FDH基因选自:GeneID:854570 (SEQ ID NO:44)、GeneID:8300341 (SEQ ID NO:46)和 GeneID:2907923 (SEQ ID NO:48)。
8.根据权利要求7所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于编码异源甲酸氢裂合酶的转基因，其中所述裂合酶为大肠杆菌(E.coli)甲酸氢裂合酶(Protein ID-C8UET5 ；SEQ IDNO:51)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于内源醇脱氢酶(ADH)基因的缺失，其中所述 ADH 基因选自=GeneID:854068 (SEQ ID NO:79)、GeneID:2538902 (SEQ ID NO:81) ,GeneID:2868277 (SEQ ID NO:83)和 GeneID:852442 (SEQ ID NO:85)。
10.一种包含以下成分的生长培养基:
11.一种细胞外产生游离脂肪酸及其酯的方法，其包括步骤: a.将酵母或真菌菌株引入到生长培养基中以产生培养物； b.孵育所述培养物，其中对所述培养物中所述生长培养基通氧； c.在步骤(b)后不供应氧的情况下进一步孵育所述培养物； d.从所述培养物中回收包含游离脂肪酸及其酯的胞外相； 其中所述微生物为酵母或真菌菌株。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述微生物为具有以下一个或更多个特征的经遗传修饰微生物: a.脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通过FAA2基因缺失实现， b.乙酰CoA羧化酶的表达增强，其通过重组内源ACCl基因实现，其中所述基因与异源启动子有效连接，和 c.编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的转基因， 其中所述微生物选自物种:曲霉属、假丝酵母属、隐球酵母属、德巴利酵母属、镰刀菌属、Lindnera、油脂酵母属、红曲霉属、毛霉属、管囊酵母属、毕赤酵母属，根霉属、红冬孢酵母属，红酵母属、酵母属，裂殖酵母属，丝孢酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述微生物选自(Candidatropicalis)、嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilus)或根据权利要求1至9中任一项所述的微生物。
14.根据权利要求11至13中任一项所述方法，其中所述生长培养基包含选自葡萄糖、甘油、木糖、水解纤维素和半纤维素、淀粉、糖醇和木聚糖中至少之一的碳源。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生长培养基包含权利要求11给出的成分或由其组成。
16.酵母或真菌菌株用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的用途，其中所述微生物为具有以下一个或更多个特征的经遗传修饰微生物:a.脂酰-Cok合成酶的活性降低，其通过FAA2基因缺失实现， b.乙酰CoA羧化酶的表达增强，其通过重组内源ACCl基因实现，其中所述基因与异源启动子有效连接，和 c.编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的转基因， 其中所述微生物选自物种:曲霉属、假丝酵母属、隐球酵母属、德巴利酵母属、镰刀菌属、Lindnera、油脂酵母属、红曲霉属、毛霉属、管囊酵母属、毕赤酵母属，根霉属、红冬孢酵母属，红酵母属、酵母属，裂殖酵母属，丝孢酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述微生物选自热带假丝酵母、嗜鞣管囊酵母或根据权利要求1至9中任一项所述的微生物。
全文摘要
本发明涉及用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的经遗传修饰微生物，其中所述微生物的特征在于改进的脂质生物合成代谢途径例如脂酰-CoA合成酶活性降低，使得微生物能够利用葡萄糖、淀粉、木质纤维素和甘油基底物中的一种或更多种作为碳源过量产生和分泌脂肪酸酯(生物柴油)进入周围培养基。本发明还提供了用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的方法，包括使用所述经遗传修饰微生物和适于所述方法的生长培养基。
文档编号C12N1/16GK103080305SQ201180029886
公开日2013年5月1日 申请日期2011年6月20日 优先权日2010年6月18日
发明者安巴里什·戈文德·帕德纳维斯, 彼得·鲁达尔詹森 申请人:丹麦科技大学