微生物浓集方法和装置的制作方法

专利名称：微生物浓集方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于捕获或浓集微生物，从而它们保持活力以便检测或测定的方法。在其他方面，本发明还涉及用于实施这类方法的浓集装置(以及包括这些装置的诊断试剂盒)并涉及用于装置制备的方法。
背景技术：
由微生物污染导致的食源性疾病和医院内获得性感染为世界各地许多地方所关注。因此，测定多种临床样品、食品样品、环境样品或其他样品中细菌或其他微生物的存在以确定所存在的微生物的种类和/或量常常是合乎需要的或是必要的。
例如，可以分析细菌DNA或细菌RNA，以甚至在存在其他细菌种类的情况下评估特定细菌物种的存在与否。然而，检测特定细菌的存在的能力至少部分取决于所分析的样品中细菌的浓度。可以对细菌样品进行平板涂布或培养，以增加样品中细菌的数目，以便确保足够的水平用于检测，但培养步骤通常需要大量的时间且因此会显著延缓评估结果。
浓集样品中的细菌可以缩短培养时间或甚至消除对于培养步骤的需要。因此，已经开发了通过使用针对特定细菌菌株特异的抗体(例如，抗体包被的磁性粒子或非磁性粒子的形式)来分离(并由此浓集)这些菌株的方法。然而，此类方法往往倾向于昂贵，而且对于至少一些诊断应用来说速度仍比期望的稍慢。
也已经使用了并非菌株特异性的浓集方法(例如，以获得对样品中所存在的微生物的较为一般性的评估)。在浓集了微生物混合群体之后，如果需要，通过使用菌株特异性探针确定特定菌株的存在。·
已经通过基于糖和凝集素蛋白相互作用的方法实现了微生物的非特异性浓集或捕获。涂覆壳聚糖的支持物已经用作非特异性捕获装置，并且用作微生物营养素的物质(例如，糖、维生素、铁螯合的化合物以及铁载体)也已经被描述为可用作配体以进行微生物的非特异性捕获。
多种无机材料(例如，羟基磷灰石和金属氢氧化物)已经用于非特异性结合和浓集细菌。物理浓集方法(例如，过滤、色谱法、离心和重力沉降)已经被用于非特异性捕获，其使用和/或不使用无机结合剂。这类非特异性浓集方法具有不同的速度(至少一些食品检测程序仍需要至少过夜孵育作为主培养富集步骤)、成本(至少一些需要昂贵的设备、材料和/或受训技术人员)、样品要求(例如，样品特性和/或体积限制)、空间要求、易于使用性(至少一些需要复杂的多步骤方法)、就地使用的合适性和/或有效性。发明内容
因此，我们认识到迫切需要用于快速检测病原微生物的方法。所述方法将优选不仅快速而且成本低、简单(不涉及复杂的设备或程序)、和/或在多种条件下(例如，不同类型样品基质和/或病原微生物、不同微生物负荷、以及不同样品体积)有效。
简而言之，在一个方面，本发明提供了一种用于非特异性浓集样品中存在的微生物菌株(例如，细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)和细菌内生孢子的菌株)的方法，从而出于检测或测定一种或多种菌株的目的，微生物保留活力。该方法包括(a)提供浓集装置，该浓集装置包含(I)多孔纤维非织造基质和(2)至少一种浓集剂的多个粒子，该浓集剂包含金属硅酸盐，所述粒子网结于多孔纤维非织造基质中；(b)提供样品(优选地以流体的形式)，该样品包含至少一种靶细胞分析物(例如，至少一种微生物菌株)；(c)使浓集装置与样品接触(优选地使该样品通过该浓集装置)从而至少一种靶细胞分析物的至少一部分由该浓集装置结合或捕获；以及(d)检测至少一种结合的靶细胞分析物的存在。
该方法还可以任选地包括将浓集装置与样品分离和/或培养性地富集至少一种结合的靶细胞分析物(例如，通过在通用或微生物特异性的培养基中孵育分离的浓集装置，这取决于需要通用的微生物富集还是选择性的微生物富集)和/或在样品接触(例如，通过使洗脱剂或裂解剂通过浓集装置)之后将捕获的靶细胞分析物(例如，微生物或其一种或多种组分)与浓集装置隔离或分离。然而，如果需要，对所述靶细胞分析物的检测(例如，通过基于培养物的、显微法/成像、遗传学、基于发光的或免疫检测方法)通常可以在该浓集装置存在的情况下进行。
本发明的方法并非靶向于特定的细胞分析物(例如，特定的微生物菌株)。相反，已经发现，包含网结于多孔纤维非织造基质中的某些相对廉价的无机材料的浓集装置可以在捕获多种微生物方面出乎意料地有效(并且相对不具有无机材料的相应装置而言，在通过洗脱隔离或分离捕获的微生物方面出乎意料地有效)。这类装置可以以非菌株特异性方式浓集存在于样品(例如，食品样品·)中的微生物菌株，从而可以更容易且快速地测定一种或多种微生物菌株(优选地，一种或多种细菌菌株)。
本发明的方法是相对简单和低成本的(无需复杂的装备或昂贵的菌株特异性材料)并且可以是相对快速的(相对于未与浓集装置接触的对应对照样品，优选的实施例在低于约10分钟内捕获至少约70% (更优选地，至少约80% ;最优选地，至少约90% )的存在于相对均质的流体样品中的微生物)。与单独使用粒状浓集剂相比，本发明的方法可以在仅使用相对短的样品接触时间(例如，短至约20秒)且无需沉降步骤的情况下在微生物捕获方面出乎意料地有效。
本发明的方法还出乎意料地是“分析适用的”(assay-friendly)。检测通常可以在浓集装置存在下有效进行而无显著的分析干扰(例如，不存在由于浓集装置对分析试剂的吸收而造成的检测误差或由于分析抑制剂从浓集装置中的浸出而造成的检测误差)。这实现了在采样环境下快速(例如，快至10分钟或更短时间)进行浓集和检测。
另外，该方法可以对于多种微生物(包括诸如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之类的病原体)和多种样品(不同的样品基质，并且与至少一些现有技术的方法不同，甚至具有低微生物含量和/或大体积的样品)有效。因此，本发明方法的至少一些实施例可以满足上述对于在多种条件下快速检测病原微生物的低成本、简单方法的迫切需要。
本发明的方法可以特别有利于浓集食品样品中的微生物(例如，含颗粒的食品样品，尤其是包含相对粗的颗粒的那些)，因为所述方法中所用的浓集装置与至少一些过滤装置(例如，绝对的微米过滤器)相比可以显示具有至少稍高的抗阻塞性。这可以促进更完整的样品处理(这对于消除食品检测中的假阴性测定至关重要)和相对较大体积样品的处理(例如，在现场条件下)。
优选的浓集方法包括
(a)提供浓集装置，其包含
(I)多孔纤维非织造基质，其包含(i)至少一种原纤化纤维和
(ii)至少一种聚合物粘合剂，以及
(2)至少一种浓集剂的多个粒子，该浓集剂包含至少一种非晶态球化金属硅酸盐；
所述粒子网结于多孔纤维非织造基质中；
(b)提供流体样品，其包含至少一种靶细胞分析物；以及
(C)使流体样品以如此方式通过浓集装置，从而至少一种靶细胞分析物的至少一部分由浓集装置结合或捕获。
在另一方面，本发明还提供了浓集装置，其包含(a)多孔纤维非织造基质；以及(b)至少一种浓集剂的多个粒子，该浓集剂包含非晶态球化金属硅酸盐；其中所述粒子网结于多孔纤维非织造基质中。本发明还提供了用于进行本发明的浓集方法的诊断试剂盒，该试剂盒包含(a)至少一种本发明的浓集装置；以及(b)用于进行上述浓集方法的至少一种测试容器或测试试剂。
在又一方面，本发明提供了用于制备浓集装置的方法，所述方法包括(a)提供多根纤维；(b)提供至少一种浓集剂的多个粒子，该浓集剂包含非晶态球化金属硅酸盐；以及(C)将多根纤维的至少一部·分形成使所述多个粒子的至少一部分网结于其中的多孔纤维非织造基质。
在又一方面，本发明还提供了过滤介质，其包含(a)多孔纤维非织造基质；以及(b)至少一种浓集剂的多个粒子，该浓集剂包含非晶态球化金属硅酸盐；其中所述粒子网结于多孔纤维非织造基质中。
具体实施方式
在以下详细说明中，描述了各组数值范围(例如，特定部分中的碳原子数的数值范围、特定组分的量的数值范围等等)，并且在每组数值范围内，范围的任何下限可以与范围的任何上限配对。这种数值范围另外旨在包括包含在该范围内的所有数(例如，I至5包括 1、1.5、2、2.75,3,3.80、4、5 等等)。
如本文所用，术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组合。
术语“优选的”和“优选地”是指本发明的实施例在某些情况下可以提供一定的益处。然而，其他实施例在相同或其他情况下也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其他实施例是不可用的，且并非意图将其他实施例排除在本发明范围之外。
当术语“包含”及其变型出现在说明书和权利要求中时不具有限制的意思。
本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一个或多个)”可互换使用。
上述“发明内容”部分并非旨在描述本发明的每个实施例或每种实施方式。以下具体实施方式
更具体地描述了示例性实施例。在整个具体实施方式
中，通过实例的列表提供指导，这些实例可以各种组合使用。在每种情况下，所述列表仅用作代表性的组类，并且不应解释为排它性列表。
定义
如本专利申请中所用的:
“芳酰胺”是指芳族聚酰胺；
“细胞分析物”是指细胞来源的分析物(即，微生物或其组分(例如，细胞或细胞组分，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、蛋白质、核苷酸如三磷酸腺苷(ATP)等，以及它们的组合)；在本说明书全部内容中对微生物或微生物菌株的引述意在更广义地适用于任何细胞分析物)；
“浓集剂”是指结合细胞分析物的材料或组合物(优选地，其细胞分析物捕获或结合效率为至少约60% ;更优选地，至少约70% ;甚至更优选地，至少约80% ;最优选地，至少约 90% )；
“培养装置”是指可以用于在允许至少一次细胞分裂发生的条件下繁殖微生物的装置(优选地，培养装置包括用于降低或最小化偶发污染可能性的壳体和/或支持微生物生长的营养物质源)；
“检测”是指鉴定细胞分析物(例如，靶微生物的至少一种组分，从而确定这种靶微生物存在)；
“网结”(针对处于纤维非织造基质中的浓集剂的粒子)是指所述粒子夹带于所述纤维非织造基质(并且优选地分布于其内部)中，而非仅仅携带于其表面；
“原纤化”(针对纤维·或纤维材料)是指以形成附接于纤维主干上的原纤或分枝的方式进行处理(例如，通过打浆)；
“纤维非织造基质”是指并非织造或针织织物的幅材或介质，其包含互层的纤维(例如，包含通过熔吹、纺粘法或其他气流成网技术；粗梳法；湿法成网；等等进行互层的纤维的幅材)；
“基因检测”是指对衍生自靶微生物的遗传物质组分如DNA或RNA的鉴定。
“免疫检测”是指对衍生自靶微生物的抗原物质如蛋白质或蛋白多糖的鉴定。
“微生物”是指具有适于分析或检测的遗传物质的任何细胞或粒子(包括(例如)细菌、酵母、病毒和细菌内生孢子)；
“微生物菌株”是指通过检测方法可区分的特定类型的微生物(例如，不同属的微生物，属内不同种的微生物或种内不同分离物的微生物)；
“对位聚芳酰胺”是指聚芳酰胺，其酰胺键与取代的(例如，烷基取代的)或非取代的苯环以对位关系(键合至I位和4位碳)进行键合；
“样品”是指所采集的(例如，待分析的)物质或材料；
“样品基质”是指除细胞分析物之外的样品组分；
“靶细胞分析物”是指需要进行检测的任何细胞分析物；
“靶微生物”是指需要检测的任何微生物；和
“穿透孔”(关于多孔基质)是指包括穿过基质的通道或沟槽(具有单独的入口和出口)的孔。
浓集剂
适用于进行本发明方法的浓集剂包括含有至少一种金属硅酸盐的那些粒状浓集齐U。金属硅酸盐可以是结晶或非晶态的(优选是非晶态的)。
使用上述浓集剂进行的浓集或捕获通常不专用于任何特定株系、物种或类型的微生物，因此提供对样品中微生物总体群落的浓集。然后，可以使用任何已知的检测方法用菌株特异性探针从捕获的微生物群落中检测特定的微生物菌株。因此，所述浓集剂可以用于检测临床样品、食品样品、环境样品或其他样品中的微生物污染物或病原体(特别是食源性病原体，例如细菌)。
当分散于或悬浮于水体系中时，无机材料如金属硅酸盐呈现出材料和水体系pH特征性的表面电荷。跨材料-水界面的电位称为电位”，其可通过电泳迁移率(即，材料粒子在设置于水体系中的带电电极之间移动的速率)进行计算。优选地，浓集剂在约7的PH具有负ζ电位。
可用的金属硅酸盐包括以下金属的硅酸盐，例如镁、钙、锌、铝、铁、钛等(优选地，镁、锌、铁和钛；更优选地，镁)，以及它们的组合。优选为至少部分熔融颗粒形式的非晶态金属硅酸盐(更优选地，非晶态、球化金属硅酸盐；最优选地，非晶态球化硅酸镁)。金属硅酸盐为已知的并且可以通过已知方法化学地合成或者通过开采和加工天然存在的原始矿石获得。
非晶态、至少·部分熔融颗粒形式的金属硅酸盐可以通过下述已知方法中的任何一种来制备，所述已知方法为在受控条件下熔化或软化相对小的进料粒子(例如，平均粒度至多为约25微米)以制备总体上椭圆形或球形粒子(即，具有总体上为圆形且不含尖角或尖锐边缘的放大二维图像的粒子，包括真正或基本上圆形和椭圆形的形状以及任何其他的圆形或弯曲形状)。这类方法包括原子化、火抛光、直接熔融等等。优选方法为火焰熔融，其中通过直接熔融或火抛光固体进料粒子形成至少部分熔融的、基本上玻璃状的粒子(例如，如同描述于美国专利号6，045，913 (Castle)的方法，其说明书以引用方式并入本文中)。最优选地，这类方法可以用来通过将无规则形状进料粒子的相当大一部分(例如，约15至约99体积％ ;优选地，约50至约99体积％ ;更优选地，约75至约99体积％ ;最优选地，约90至约99体积％ )转换成大致椭圆形或球形的粒子而制备非晶态、球化金属硅酸盐。
一些非晶态金属硅酸盐为市售的。例如，非晶态、球化硅酸镁是可商购获得用于化妆品制剂中的(例如，作为3M Cosmetic Microspheres CM-111,可得自明尼苏达州圣保罗市的 3M 公司(3MCompany, St.Paul, MN))。
除金属硅酸盐外，浓集剂还可以包含其他材料，所述材料包括金属(例如铁或钛)的氧化物、其他晶态材料等，以及它们的组合。然而，浓集剂对于至少一些应用来说优选地基本不包含结晶娃。
在实施本发明的方法中，浓集剂可以基本上以任何颗粒形式(优选地，相对干燥或无挥发物的形式)使用，所述粒状形式适于与纤维共混以形成用于所述方法中的浓集装置。例如，浓集剂可以粉末形式使用或者可施用至诸如微珠等等的粒状载体。
优选的是，浓集剂以粉末形式使用。可用的粉末包括含有微粒子(优选地，具有处于约I微米(更优选地，约2微米；甚至更优选地，约3微米；最优选地，约4微米)至约100微米(更优选地，约50微米；甚至更优选地，约25微米；最优选地，约15或20微米)范围内粒度的微粒子，其中任何下限可以与所述范围的任何上限成对，如上文引述)的那些粉末。
适用于进行本发明方法的特别优选的浓集剂包括含有非晶态金属硅酸盐并且具有下述表面组成的那些浓集剂，其中如通过X射线光电子能谱(XPS)所测定，所述表面组成具有小于或等于约0.5 (优选地，小于或等于约0.4 ;更优选地，小于或等于约0.3 ;最优选地，小于或等于约0.2)的金属原子对硅原子比率。这类浓集剂包括在2010年7月29日公布的美国专利申请公开N0.US 2010/0190171 (Kshirsagar等人；3M创新有限公司(3MInnovative Properties Company))中描述的那些浓集剂,这些浓集剂及其制备方法的描述以引用的方式并入本文。
优选地，特别优选的浓集剂的表面组成还包括至少平均约10原子％的碳(更优选地，至少平均约12原子％的碳；最优选地，至少平均约14原子％的碳)，如通过X射线光电子能谱(XPS)所测定。XPS是一种可以测定样品表面的最外侧约3至10纳米(nm)的元素组成并且对周期表中除氢和氦之外的所有元素均敏感的技术。XPS是定量技术，对大多数元素的检测限在0.1至I原子％浓度范围内。优选的XPS表面组成评估条件可以包括相对于接受立体角为±10度的样品表面测得的90度飞离角。
这种优选的金属硅酸盐浓集剂可以具有比(例如)普通金属硅酸盐(如普通滑石)更多负电性的 电位。然而令人惊讶地是，浓集剂比滑石粉更有效地浓集表面通常趋于带负电的微生物(如细菌)。优选地，浓集剂在约7的pH具有负ζ电位(更优选地，在约7的pH具有在约-9毫伏至约-25毫伏范围内的斯莫卢霍夫斯基ζ电位(Smoluchowskizeta potential);甚至更优选地，在约7的pH具有在约-10毫伏至约-20毫伏范围内的斯莫卢霍夫斯基^电位；最优选·地，在约7的pH具有在约-11毫伏至约-15毫伏范围内的斯莫卢霍夫斯基 电位)。
适用于进行本发明方法的其他特别优选的浓集剂包括含有经吸附缓冲剂改性的非晶态金属硅酸盐的浓集剂。这类浓集剂包括在2009年12月22日提交的美国临时专利申请 N0.61/289，213 (Kshirsagar ;3Μ 创新有限公司(3Μ Innovative Properties Company))中描述的那些浓集剂，这些浓集剂及其制备方法的描述以引用的方式并入本文。_7] 浓集装置
适用于实施本发明的方法的浓集装置包括含这些浓集装置:所述浓集装置包含(a)多孔纤维非织造基质和(b)多个上述浓集剂粒子，所述粒子网结于多孔纤维非织造基质中。这类浓集装置可以基本上通过能够提供使浓集剂粒子网结于其中的纤维非织造基质(即，并非织造或针织织物的幅材或介质，其包含互层的纤维)的任何方法而制备。可用的方法包括熔吹、纺粘法和其他气流成网技术；粗梳法；湿法成网；等等；以及它们的组合(优选地为气流成网、湿法成网以及它们的组合；更优选地，湿法成网)。
适用于制备浓集装置的多孔纤维非织造基质的纤维包括可制浆纤维。优选的可制浆纤维为对辐射和/或对多种溶剂稳定的那些纤维。可用的纤维包括聚合物纤维、无机纤维及其组合(优选地为聚合物纤维及其组合)。优选地，至少一些所使用的纤维表现出一定程度的亲水性。
合适的聚合物纤维包括从天然聚合物(动物或植物)和/或合成聚合物(包括热塑性聚合物和溶剂可分散的聚合物)制成的那些聚合物纤维。可用的聚合物包括羊毛；丝；纤维素聚合物(例如纤维素、纤维素衍生物等)；氟化聚合物(例如，聚(氟乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、偏二氟乙烯共聚物(例如，聚(偏二氟乙烯-共-六氟丙烯))、三氟氯乙烯共聚物(例如，聚(乙烯-共-三氟氯乙烯)等)；氯化聚合物；聚烯烃(例如，聚(乙烯)、聚(丙烯)、聚(1-丁烯)、乙烯和丙烯的共聚物、α烯烃共聚物(诸如乙烯或丙烯与1-丁烯、1-己烯、1-辛烯和1-癸烯的共聚物)、聚(乙烯-共-1-丁烯)的聚合物、聚(乙烯-共-1-丁烯-共-1-己烯)等) ’聚(异戊二烯) ’聚(丁二烯)；聚酰胺(例如，尼龙6 ;尼龙6，6 ;尼龙6，12 ’聚(亚氨己二酰亚氨六亚甲基) ’聚(亚氨己二酰亚氨十亚甲基)；聚己内酰胺；等)；聚酰亚胺(例如，聚(均苯四酰亚胺)等)；聚醚；聚(醚砜)(例如，聚(二苯醚砜)、聚(二苯砜-共-二苯醚砜)等)；聚(砜)；聚(醋酸乙烯酯)；醋酸乙烯酯的共聚物(例如，聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯))，其中至少一些醋酸酯基团已经水解以提供多种聚(乙烯醇)的共聚物，包括聚(乙烯-共-乙烯醇)等) ’聚(磷腈) ’聚(乙烯酯)；聚(乙烯醚)；聚(乙烯醇)；聚芳酰胺(例如，聚对-芳酰胺，诸如聚(对苯二甲酰对苯二胺)以及特拉华州·威名顿市的杜邦公司(DuPont C0., Wilmington, DE)以商品名“KEVLAR”销售的纤维，其浆液以基于制成浆液的纤维长度的多种品级商购获得，所述品级诸如“KEVLAR 1F306”和“KEVLAR 1F694”，两者均包含长度至少4mm的聚芳酰胺纤维；等)；聚(碳酸酯)；等等；以及它们的组合。优选的聚合物纤维包括聚酰胺、聚烯烃、聚砜以及它们的组合(更优选地为聚酰胺、聚烯烃以及它们的组合；最优选地为尼龙、聚乙烯以及它们的组合)。
合适的无机纤维包括含有至少一种无机材料的无机纤维，所述无机材料选自玻璃、陶瓷以及它们的组合。可用的无机纤维包括玻璃纤维(例如，E-玻璃、S-玻璃等)、陶瓷纤维(例如，由金属氧化物(诸如氧化铝)、碳化硅、氮化硼、碳化硼等制成的纤维)等，以及它们的组合。可用的陶瓷纤维可以是至少部分晶态的(表现出可识别的X射线粉末衍射花纹或同时包含晶态相和非晶态(玻璃)相)。优选的无机纤维包括玻璃纤维及其组合。
用于形成多孔纤维非织造基质的纤维可以具有这样的长度和直径，所述长度和直径可以为具体应用(例如，用于特定类型的样品基质)提供具有充分结构完整性和充分孔隙率的基质。例如，至少约0.5謹、I謹、2謹、3謹、4謹、6謹、8謹、10mm、15謹、2Ctam、25謹或甚至30mm(以及它们的组合)的长度和至少约10 μ m(微米)>20 μ m、40 μ m、或甚至60 μ m(以及它们的组合)的直径可能是有用的。优选的纤维长度和直径将根据包括纤维性质和应用类型在内的因素而变化。例如，对于多种样品基质，长度约Imm至约3_的原纤化聚乙烯可以是有用的，并且长度约6mm至约12.5mm的非原纤化尼龙可以是有用的。
为辅助夹带浓集剂粒子和/或确保高表面积基质，用于形成多孔纤维非织造基质的纤维优选地包含至少一种原纤化纤维(例如，处于被大量较小的连接原纤所围绕的主纤维形式)。主纤维一般可以具有约0.5mm至约4mm范围的长度以及约I至约20微米范围内的直径。所述原纤通常可以具有亚微米直径。
多孔纤维非织造基质可以包含两种、三种、四种或者甚至更多种不同类型的纤维。例如，可以为了强度和完整性而加入尼龙纤维，同时可以为了夹带颗粒而加入原纤化聚乙烯。如果使用原纤化和非原纤化纤维，则通常，原纤化纤维对非原纤化纤维的重量比可以为至少约1: 2、1: 1、2: 1、3: 1、5: I或甚至8: I。无论选择什么类型的纤维，所得浓集装置中纤维的量(干形式)(基于所述浓集装置的全部组分的总重量)优选地为至少约10,12,12.5、14、15、18、20 或甚至 22 重量％，最高达约 20、25、27、30、35 或甚至 40 重量％。
优选地，该多孔纤维非织造基质还包含至少一种聚合物粘合剂。合适的聚合物粘合剂包括相对惰性(与纤维或浓集剂粒子几乎不表现出或不表现出化学相互作用)的天然和合成聚合物材料。可用的聚合物粘合剂包括聚合物树脂(例如，粉末和胶乳形式)、聚合物粘合剂纤维等，以及它们的组合。对于至少一些应用而言，优选的聚合物粘合剂包括聚合物粘合剂纤维及其组合。对于其他应用而言，聚合物树脂及其组合可以为优选的聚合物粘合剂。
合适的聚合物树脂包括但不限于天然橡胶、氯丁橡胶、苯乙烯-丁二烯共聚物、丙烯酸酯树脂、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯等，以及它们的组合。优选的聚合物树脂包括丙烯酸酯树脂及其组合。合适的聚合物粘合剂纤维包括纯粘合剂型纤维(例如，Kodel 43UD纤维，可得自田纳西州金斯波特市的伊士曼化学品公司(Eastman Chemical Products,Kingsport, TN))、双组分纤维(例如，并列型形式,诸如Chisso ES聚烯烃热粘合双组分纤维，可得自日本大阪市的智索株式会社(Chisso Corporation, Osaka, Japan);皮/芯型形式，诸如Melty 纤维4080型双组分纤维，其具有聚酯芯和聚乙烯外皮，可得自日本大阪市的尤尼吉可株式会社(Unitika Ltd., Osaka, Japan);等等)等等，以及它们的组合。优选的聚合物粘合剂纤维包括双组分纤维及其组合(更优选地，皮/芯型双组分纤维及其组合)。
无论使用什么类·型的聚合物粘合剂，在所得浓集装置中粘合剂的量(干形式)基于浓集装置的全部组分的总重量，一般可以为约3重量％至约7重量％ (优选地，约5重量％ )。此类量的聚合物粘合剂通常可以为多孔纤维非织造基质提供充分的完整性以用于多种应用，而并不显著地涂覆所述粒子。令人惊讶地是，相对纤维在浓集装置中的重量，聚合物粘合剂在浓集装置中的量可以低于约5、4、3、2或甚至I重量％。
在该浓集装置的优选实施例中，聚合物粘合剂基本上不粘附于所述粒子。换句话讲，当通过扫描电子显微镜法检验浓集装置时，低于约5、4、3、2或甚至1%的所述粒子总表面积被聚合物粘合剂覆盖。
本发明的方法中使用的浓集装置可以通过包括下述方法制备，所述方法包括(a)提供多根上述纤维；(b)提供多个上述浓集剂粒子；以及(C)将多根纤维的至少一部分形成使所述多个粒子的至少一部分网结于其中的多孔纤维非织造基质。如上文提及，所述形成过程可以基本上通过能够提供使所述浓集剂粒子网结于其中的纤维非织造基质(即，并非织造或针织织物的幅材或介质，其包含互层的纤维)的任何方法而进行。可用的方法包括熔吹、纺粘法和其他气流成网技术；粗梳法；湿法成网；等等；以及它们的组合(优选地为气流成网、湿法成网以及它们的组合；更优选地，湿法成网)。
优选地，所述形成过程通过使用湿法成网或“湿成网”方法进行，所述方法包括(a)形成分散体，所述分散体包含处于至少一种分散液(优选地是水)中的多根纤维、多个粒子(其可在进行其他加工步骤前与其他组分一起加入并分散，或者如果需要，可在该方法中稍后但通常在除去分散液之前加入并分散)以及至少一种聚合物粘合剂；(b)将该聚合物粘合剂至少部分地沉积在纤维的至少一部分上；以及(C)从分散体中除去分散液。在这种方法中，纤维可以在分散液中分散以形成浆液。如果需要，纤维可以包含添加剂或化学基团或部分来辅助其分散。例如，聚烯烃基的纤维可以包含马来酸酐或琥珀酸酐官能团，或在对聚乙烯纤维的熔融加工期间可以加入合适的表面活性剂。
可以在除去分散液或脱水步骤之前或之后实施聚合物粘合剂在纤维上的沉积，这取决于聚合物粘合剂的特性。例如，当聚合物乳胶用作聚合物粘合剂时，可以在粒子加入之前或之后并且在脱水之前将该聚合物乳胶沉淀在纤维上。在脱水之后，可以施加热以完成脱水并且对所得的沉积乳胶定型。当聚合物粘合剂纤维用作聚合物粘合剂时，一般可以首先进行脱水，随后加热来完成脱水并且熔化聚合物粘合剂纤维(并且由此而将聚合物粘合剂沉积在纤维上)。
一种或多种助剂或添加剂可以用于制备该浓集装置。可用的助剂包括加工助剂(例如，沉淀剂，诸如铝酸钠和硫酸铝，它们可以有助于使聚合物粘合剂沉淀于纤维上)，可以增强所得浓集装置的整体性能的材料，等等。当使用时，这类助剂的量可以是从大于零最多至约2重量％ (优选地最多至约0.5重量％ ;其基于浓集装置的组分总重量)，不过优选地使它们的量保持尽可能低以便最大化可以包括的浓集剂粒子的量。
在一个优选的湿成网方法中，纤维(例如，短纤维)可以在分散液(例如，水、水混溶性有机溶剂，诸如醇类，或它们的组合)存在的情况下在容器中共混。未发现共混所得混合物的剪切力的量影响所得浓集装置的最终性质，但共混期间引入的的剪切力的量优选是相对高的。此后，可以向该容器中加入粒子、聚合物粘合剂以及过量的沉淀剂(例如，pH调节剂，诸如明帆)。
当通过使用本领域中已知的抄片法(hand-sheet)实施优选的湿成网方法时,未发现向纤维分散体添加这三种成份的顺序显著地影响浓集装置的最终性能。然而，在加入粒子之后加入聚合物粘合剂可提供表现出粒子对纤维一定程度上更好的粘附力的浓集装置。当通过使用连续法实施优选的湿成网方法时，三种成份优选地以下列顺序加入。(以下描述是基于抄片法，尽管本领·域的技术人员可以容易地了解如何调整这一方法以提供连续方法。)
将粒子、聚合物粘合剂和沉淀剂加入纤维-液体浆液中后，可以将所得混合物倾入模具，所述模具的底部可以由筛网覆盖。可以使分散液(优选地是水)通过该筛网从混合物(以湿片材的形式)中排出。在足够的液体从片材排出后，一般可以从模具中移出湿片材，并通过压轧、加热或两者的组合来使之干燥。可以在这些干燥过程中使用约300至约600kPa的压力和约100至约200°C的温度(优选地，约100至约150°C )。在优选的湿成网方法中使用聚合物粘合剂纤维作为聚合物粘合剂时，无需沉淀剂，并且所施加的热可用于熔融该聚合物粘合剂纤维。
所干片材可以具有至少约0.2、0.5、0.8、1、2、4或甚至5mm最多至约5、8、10、15或甚至20mm的平均厚度。可以除去最多至约100%的分散液(优选地，最多至约90重量％ )。如果需要，可以使用压延来提供额外的压轧或熔合。
如上提及，浓集剂粒子可以是微粒子。根据所使用的纤维的性质，微粒子可以通过化学相互作用(例如，化学键)或物理相互作用(例如，吸附或机械夹带)夹带于多孔纤维非织造基质之中。浓集装置的优选实施例包括含有至少一种原纤化纤维的浓集装置，其中所述原纤化纤维可以影响对浓集剂粒子的机械夹带。在浓集装置的一个实施例中，粒子的有效平均直径比所得湿成网片材的未经压延的厚度低至少约175倍(优选地，比该片材的未经压延的厚度低至少约250倍；更优选地，比该片材的未经压延的厚度低至少约300倍)。
由于浓集装置的容量和效率可以根据其中所包含的浓集剂粒子的量变动，因此相对高的粒子载量一般可能是想要的。浓集装置中的粒子量(基于浓集装置的全部组分的总重量)优选地可以为至少约20、30、40、50、60、70或甚至80重量％。粒子夹带于多孔纤维非织造基质中并且优选地分布于其中(更优选地，粒子基本上均匀地遍及整个基质分布)。
所得浓集装置可以具有受控的孔隙率(优选地，对于IOOmL的空气具有至少约0.1秒(更优选地，至少约2至约4秒；最优选地,至少约4秒)的格利时间(Gurley time))。浓集装置(以片材材料形式)的基重可以在约250至约5000g/m2 (优选地约400至约1500g/m2 ;更优选地，约500至约1200g/m2)的范围内。
如通过扫描电子显微镜法(SEM)测量，片材材料的平均孔隙尺寸一般可在约0.1至约10微米范围内。处于约20至约80体积％范围内的空隙体积是可用的(优选地，约40至约60体积％ )。可以通过在纤维混合物中引入具有较大直径或刚度的纤维来修改(增加)片材材料的孔隙率。
该片材材料可以是柔性的(例如，能够围绕0.75英寸(约2cm)直径的芯成辊)。这种柔性可以使片材材料起褶或成辊。片材材料可以具有相对低的背压(意味着相对高体积的液体可以相对快速地通过片材材料而不产生相对高的背压)。(如本文所用，“相对低的背压”是指在3mL/cm2的流速低于约3磅每平方英寸(20.7Kpa)、2.5 (17.2) ,2(13.8)、1.5(10.3)或甚至I磅每平方英寸(6.9kPa)的背压差，其中流速基于片材材料的前表面积计。)
可以将未压延·的片材材料切割成所需的尺寸并且用来实施本发明的浓集方法。如果需要(例如，当跨片材的显著压降不成问题时)，可以在使用前压延片材材料来提高其抗张强度。当欲将片材材料起褶时，可以优选地避免干燥和压延。
单层片材材料可以有效实施本发明的浓集方法。如果需要，可以使用多层来提供更大的浓集容量。
浓集装置的多孔纤维非织造基质的明显益处在于可以使用非常小的浓集剂粒子粒度(IOmm或更小)和/或具有相对宽广的粒度分布的浓集剂粒子。这允许优异的单程通过动力学，原因在于增大的表面积/质量比，以及对于多孔粒子而言最小化的内扩散距离。由于相对低的压降，可以使用最低驱动力(例如重力或真空)以推动样品通过浓集装置，甚至当使用小的浓集剂粒子粒度时仍是如此。
如果需要，浓集装置还可以包括一种或多种其他组件，例如(如)一种或多种预滤器(例如，以便在样品通过多孔基质之前从样品移除相对较大的食物粒子)、用于多孔基质的支持物或基座(例如，以玻璃料或网格的形式)、用于施加跨装置压差的歧管(例如，以有助于使样品通过多孔基质)和/或外部壳体(例如，容纳和/或保护多孔基质的一次性料筒)。
趙蓝
本发明的方法可用于多种不同类型的样品，包括但不限于医学样品、环境样品、食品样品、饲料样品、临床样品和实验室样品以及它们的组合。医学或兽医样品可包括(例如)来自生物来源(例如，人或动物)的待测定以进行临床诊断的细胞、组织或流体。环境样品可以例如来自医学或兽医设施、工业设施、土壤、水源、食品制备区(食品接触和非接触区)、实验室或已潜在遭受生物恐怖的区域。优选的是食品加工、处理以及制备区样品，这是因为这些在细菌病原体导致的食品供应污染方面常常受到特别的关注。
以液体形式或者以固体在液体中的分散体或悬液形式获得的样品可直接使用，或可进行浓集(例如，通过离心法)或稀释(例如，通过添加缓冲(控制PH的)溶液)。固体或半固体形式的样品可直接使用或可根据需要通过(例如)用流体介质(例如，缓冲溶液)洗涤或冲洗或者悬浮或分散于流体介质中的方法来提取。可以从表面(例如，通过擦拭或冲洗)获取样品。优选地，样品为流体(例如，液体、气体或者固体或液体在液体或气体中的分散体或悬液)。
可用于实施本发明的方法的样品的例子包括食品(例如，新鲜农产品或即食午餐或“熟食”肉类)、饮料(例如，果汁或碳酸饮料)、水(包括饮用水)和生物流体(例如，全血或其组分，如血浆、富含血小板的血液级分、血小板浓缩物或压积的红细胞；细胞制品(例如分散的组织、骨髓吸出物或锥体骨髓)；细胞悬液；尿液、唾液和其他体液；骨髓；肺液；脑脊液；伤口渗出物；伤口活检标本；眼液；脊液；等)，以及可以使用已知工序(如使用裂解缓冲液)形成的裂解制品如细胞裂解物，等等。优选的样品包括食品、饮料、水、生物流体以及它们的组合(其中食品、饮料、水以及它们的组合为最优选的)。
样品体积可以根据具体应用而变动。例如，当本发明的方法用于诊断或研究应用时，样品的体积可通常为微升范围(例如，10微升或更大)。当所述方法用于食品病原体检测分析或用于饮用水安全性检测时，样品的体积可通常为毫升至升的范围(例如，100毫升至3升)。在工业应用中，例如生物·工艺或制药配制中，所述体积可为成千上万升。
本发明的方法可以从浓集状态的样品分离微生物，并且还可使得能从可对待使用的检测程序造成限制的样品基质组分分离微生物。在所有这些情况下，本发明的方法可以伴随或替代细胞分析物或微生物浓集的其他方法而使用。因此，任选地，如果需要另外的浓集，可在进行本发明的方法之前或之后从样品培养培养物。这种培养富集可为总体的或初级的(以便富集大部分或基本上所有微生物的浓集物)或者可为特异性或选择性的(以便仅富集一种或多种选定微生物的浓集物)。
腿
可以通过多种已知的或后来开发的提供两种材料间接触的方法中的任何一种来进行本发明的方法。例如，可以将浓集装置添加至样品，或者可以将样品添加至浓集装置。可以将浓集装置浸于样品中、可以将样品倾注到浓集装置上、可以将样品倾注到含有浓集装置的管或孔内，或优选地，可使样品在浓集装置其上或其内(优选地，其内)穿过(或反之亦然)。优选地，以下述方式进行接触，从而样品穿过多孔纤维非织造基质的至少一个孔(优选地，通过至少一个穿透孔)。
可以在多种容器或夹持器(任选地，加盖的、关闭的或密封的容器；优选地为柱、注射针筒或设计用于容纳该装置而基本无样品泄漏的其他夹持器)中将浓集装置与样品结合(使用任何添加顺序)。用于进行本发明方法的合适容器将由具体样品决定，并且可在尺寸和性质上大不相同。例如，所述容器可为小容器(例如10微升容器(例如，试管或注射器))或较大容器(例如100毫升至3升容器(例如，锥形瓶或环状圆柱形容器)。
直接接触样品的容器、浓集装置、以及任何其他装置或添加剂可在使用前进行灭菌(例如，通过受控热、环氧乙烷气体或辐射来进行)，以便减少或防止任何可导致检测误差的样品污染。浓集装置中足以捕获或浓集特定样品的微生物以便成功检测的浓集剂的量是可变动的(取决于例如，浓集剂和装置的性质和形式以及样品的体积)，并且可由本领域的技术人员容易地确定。
接触可以进行所需的一段时间(例如，对于数升的样品体积或对于涉及多次通过浓集装置的方法而言，最多至约60分钟的接触可能是有用的；优选地，约15秒至约10分钟或更长；更优选地，约15秒至约5分钟；最优选地，约15秒至约2分钟)。任选但可优选的是，可以通过混合(例如，通过搅动、摇动或通过在整个装置上施加压差以有利于样品穿过其多孔基质)和/或通过孵育(例如，在环境温度下)来增强接触，以便增加浓集装置的微生物接触。
优选的是，可以通过使样品穿过浓集装置(例如，通过泵送)至少一次(优选地，仅一次)来实现接触。可使用用于在整个装置(例如，注射器或柱塞)上建立压差的泵(例如，蠕动泵)或其他设备中的基本上任何一种。可用的流速将根据此类因素如样品基质的特性和具体应用而变化。
例如，以最多至约100毫升/分钟或更高的样品流速通过所述装置可以为有效的。优选地，对于诸如饮料或水这样的样品而言，可以使用每分钟约10-20毫升的流速。对于预过滤的或其他方式澄清的食·品样品而言，每分钟约6毫升(每15秒1.5毫升)的流速可能是有用的。更长的接触时间和更慢的流速对于更复杂的样品基质(诸如牛肉馅或火鸡肉馅)可能是有用的。
优选的接触方法包括将样品如此通过浓集装置(例如，通过泵送)。如果需要，可在接触中向浓集装置和样品的组合中添加一种或多种添加剂(例如，裂解试剂、生物发光测定试剂、核酸捕获试剂(例如，磁珠)、微生物生长培养基、缓冲液(例如，用于润湿固体样品)、微生物染色试剂、洗涤缓冲液(例如，用于洗除未结合材料)、洗脱剂(例如，血清白蛋白)、表面活性剂(例如，可得自联合碳化物与塑料公司(德克萨斯州休斯敦市)(UnionCarbide Chemicals and Plastics (Houston, TX))的 Triton X-100 非离子型表面活性剂)、机械磨蚀/洗脱剂(例如，玻璃珠)、吸附缓冲剂(例如，用于制备上述吸附缓冲剂改性的浓集剂的相同缓冲剂或不同缓冲剂)等等)。
本发明的方法还可以任选地包括将所得的结合靶细胞分析物的浓集装置与样品分离。可以通过本领域中熟知的多种方法来实施分离(例如，通过泵送、滗析或虹吸流体样品，以便将结合靶细胞分析物的浓集装置留在用于实施所述方法的容器或夹持器中)。也可以在样品接触之后从浓集装置隔离或分离(例如，通过使洗脱剂或裂解剂在浓集装置之上或之内穿过)捕获的靶细胞分析物(靶微生物或其一种或多种组分)。
本发明的方法可以人工实施(例如，以批次方式)或可为自动的(例如，以便能够进行连续或半连续处理)。
检湿
可以通过使用本发明的方法浓集和检测多种微生物，包括，例如，细菌、真菌、酵母、原生动物、病毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)、细菌内生孢子(例如，芽孢杆菌属(Bacillus)(包括炭疽芽抱杆菌(Bacillus anthracis)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))和梭状芽孢杆菌(Clostridium)(包括肉毒梭状芽抱杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽抱杆菌(Clostridium difficile)和产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens))等等，以及它们的组合(优选地是细菌、酵母、病毒、细菌内生孢子、真菌，以及它们的组合；更优选地是细菌、酵母、细菌内生孢子、真菌，以及它们的组合；甚至更优选地是细菌、酵母、真菌，以及它们的组合；更为优选的是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母、真菌，以及它们的组合；最优选地是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母，以及它们的组合)。所述方法可用于检测病原体，这对于食品安全或对于医学、环境或反恐原因来说是重要的。所述方法尤其可用于检测病原性细菌(例如，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)以及多种酵母菌和霉菌(以及这些中的任何的组合)。
待检测的靶微生物属包括(但不限于)李斯特菌属(Listeria)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭状芽抱杆菌属(Clostridium)、螺杆菌属(Helicobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、志贺氏菌属(Shigella)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、博德特氏菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、酵母菌属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)等以及它们的组合。样品可以含有多种微生物菌株，并且任何一种菌株可以独立于任何其他菌株被检测到。可作为检测靶的具体微生物菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血性弧菌(Vi·brio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(以无害李斯特菌为替代物)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、葡萄球菌肠毒素亚种(Staphylococcal enterotoxin ssp)、腊样芽抱杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽抱杆菌(Bacillus anthracis)、萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、产气荚膜梭状芽抱杆菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭状芽抱杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽抱杆菌(Clostridium difficile)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、人类感染性无包膜肠道病毒(以大肠杆菌Escherichiacoli曬菌体为替代物)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等，以及它们的组合(优选地，金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌肠道沙门氏菌(以无害李斯特菌为替代物)、肠道沙门氏菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、人类感染性无包膜肠道病毒(以大肠杆菌噬菌体为替代物)以及它们的组合；更优选地是金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌(以无害李斯特菌为替代物)、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、以及它们的组合)。
已被浓集装置捕获或结合(例如，通过吸附或通过筛分)的微生物可通过基本上任何目前已知或将来开发的所需方法来检测。这类方法包括(例如)基于培养的方法(当时间允许时可为优选的)、显微镜法(例如，使用可用于观察标记有荧光染料的微生物的透射光显微镜或落射荧光显微镜)以及其他成像方法、免疫检测方法和基因检测方法。在微生物捕获之后进行的检测过程可以包括进行淋洗以除去样品基质组分、对浓集装置的多孔纤维非织造基质进行切片或其他方式的破碎、染色、煮沸或使用洗脱缓冲液或裂解剂以从浓集装置中释放细胞分析物，等等。
免疫检测是对衍生自靶生物体的抗原物质的检测，该抗原物质通常是充当细菌或病毒粒子的表面上的标志的生物分子(例如，蛋白质或蛋白多糖)。抗原物质的检测通常可以通过抗体、选自诸如噬菌体展示之类的过程的多肽或来自筛选过程的适体来进行。
免疫检测方法是熟知的，并且包括(例如)免疫沉淀和酶联免疫吸附测定(ELISA)。可以多种方式(例如，通过用荧光染料、用量子点或用可产生化学发光的酶或有色底物来标记第一抗体或第二抗体，和使用酶标仪或侧流装置)来检测抗体结合。
还可以通过基因检测(例如，通过核酸杂交或引物定向的扩增)来进行检测，基因检测常常是优选的方法。可以将捕获或结合的微生物裂解，以使它们的遗传物质可供检测。裂解方法是熟知的，包括例如下述处理:声裂法、渗压震扰、高温处理(例如，约50°C至约100°C )以及与酶一起孵育，该酶例如为溶菌酶、葡萄糖酶、酵母裂解酶(zymolose)、溶细胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒内溶素。
许多常用的基因检测分析可检测特定微生物的核酸，包括DNA和/或RNA。基因检测方法中使用的条件的严格性与所检测的核酸序列的变异水平相关。高度严格的盐浓度和温度条件可使检测限于靶标的精确核酸序列。因此，使用高度严格的基因检测可区分靶核酸序列存在小变异的微生物菌株。基因检测可以基于核酸杂交，其中，单链核酸探针与微生物的变性核酸杂交，使得产生包含探·针链的双链核酸。本领域技术人员应熟悉用于在凝胶电泳、毛细管电泳或其他分离方法之后检测杂交物的探针标记，例如放射性标记、荧光标记以及化学发光标记。
特别有用的基因检测方法是基于引物指导的核酸扩增。引物指导的核酸扩增方法包括，例如，热循环方法(例如，聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和连接酶链反应(LCR))，以及等温方法和链置换扩增(SDA)(以及它们的组合；优选地是PCR或RT-PCR)。用于检测扩增产物的方法包括(但不限于)例如凝胶电泳分离和溴化乙锭染色以及检测产物中掺入的荧光标记或放射性标记。还可以使用在检测扩增产物之前不需要分离步骤的方法(例如，实时PCR或均相检测)。
生物发光检测方法是熟知的，并且包括(例如)三磷酸腺苷(ATP)检测方法，包括美国专利N0.7，422，868 (Fan等人)中所描述的那些方法，所述专利的说明内容以引用方式并入本文。也可使用其他基于发光的检测方法。
由于本发明方法是非菌株特异性的，它提供了容许在同一样品中靶向多种微生物菌株以检测的通用捕获系统。例如，在测定食品样品的污染时，将同一样品中的单核细胞增多性李斯特菌、大肠杆菌以及沙门氏菌(Salmonella) —并检测是合乎需要的。在单个捕获步骤之后接着可进行例如PCR或RT-PCR测定，其使用特异性引物来扩增来自这些微生物菌株中每个菌株的不同核酸序列。因此，可以避免需要对每个菌株分开进行样品处理和制备程序。
诊断试剂盒
用于实施本发明浓集方法的诊断试剂盒包括用于实施本发明浓集方法的(a)至少一种上述浓集装置；以及(b)至少一种测试容器或测试试剂(优选地为无菌测试容器或测试试剂)。优选地，诊断试剂盒还包括用于进行所述方法的说明书。
可用的测试容器或夹持器包括上文所述的那些并且可用于(例如)接触、孵育、采集洗脱液或其他所需的方法步骤。可用的测试试剂包括微生物培养基或生长培养基、裂解齐 、洗脱剂、缓冲液、发光检测分析组分(例如，发光计、裂解试剂、荧光素酶、酶底物、反应缓冲液等等)、基因检测分析组分等等以及它们的组合。优选的裂解剂是在缓冲液中提供的分解酶或化学品，并且优选的基因检测分析组分包括靶微生物的一种或多种特异性引物。所述试剂盒还可以任选包括无菌镊子等等。
过滤介质
在其他实施例中，本发明提供了一种过滤介质，其用于从样品中除去微生物污染物或病原体。根据本发明适用的过滤介质包括这些过滤介质，所述介质包含(a)多孔纤维非织造基质和(b)多个上述浓集剂粒子，所述粒子网结于所述多孔纤维非织造基质中。这类过滤介质可以通过与上文针对浓集剂和浓集装置的描述的基本相同的方法制备，并且基本上包括相同的材料。
实魁
通过以下实例进一步说明了本发明的目的和优点，但是这些实例中叙述的特定材料及其用量、以及其他条件和细节不应理解为对本发明进行不当限制。除非另外指明，否则下述实例中的所有份数、百分数、比率等均按重量计。除非另外指明，否则溶剂和其他试剂均来自威斯康辛州密尔沃基的西格玛奥德里奇化学公司(Sigma-Aldrich ChemicalCompany, Milwaukee, WI)。所·有微生物培养物均购自弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心(ATCC ；Manassas, VA)。除非另外指明，实验性结果是2组测试的平均值。通过将选择的微生物划线于胰酶大豆琼脂平板上并随后在37°C过夜孵育来制备过夜培养物。全部微生物计数根据用于菌落形成单位的标准微生物学计数方法进行，并且计数是近似值。
浓集剂
结晶硅酸镁浓集剂(下文中，滑石粉)购自新泽西州菲利普斯堡市的Mallinckrodt Baker 公司(Mallinckrodt Baker, Inc.(Phillipsburg, NJ))。
非晶态球化硅酸镁浓集剂(此后称为AS-滑石粉)以M 化妆品微球(CosmeticMicrospheres)CM-1lK成型为实心球；粒子密度2.3g/立方厘米；表面积3.3m2/g ;粒度:90%小于约11微米，50%小于约5微米，10%小于约2微米；可得自明尼苏达州圣保罗市的3M 公司(3MCompany, St.Paul, MN))的形式获得。
ζ电势测丨定
利用装配有ΤΜ200自动滴定模块、pH电极和在线电导池的Colloidal DynamicsAcoustosizer II 多频电声光谱分析仪(Colloidal Dynamics,罗得岛州沃威克(Warwick, RI))，测量滑石粉和AS-滑石粉浓集剂的水分散体(分别为18兆欧姆的去离子水中的5.75重量％的滑石粉和5.8重量％的AS滑石粉，所述去离子水是通过使用来自马萨诸塞州贝德福德市的密理博公司(Millipore Corporation, Bedford, MA)的Mill1-Q Elix 10 Synthesis AlO去离子系统获得的)的ζ电势为随添加的盐酸(pH)而变化。利用具有下述一般参数的极性校准物和极性样品设定来进行测定:
权利要求
1.一种浓集方法，包括 (a)提供浓集装置，其包含 (1)多孔纤维非织造基质，以及 (2)至少一种浓集剂的多个粒子，所述浓集剂包含金属硅酸盐，所述粒子网结于所述多孔纤维非织造基质中； (b)提供包含至少一种靶细胞分析物的样品； (C)使所述浓集装置与所述样品接触，从而所述至少一种靶细胞分析物的至少一部分由所述浓集装置结合或捕获；以及 (d)检测至少一种结合的靶细胞分析物的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔纤维非织造基质通过湿成网方法形成。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述多孔纤维非织造基质包含至少一种原纤化纤维。
4.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述多孔纤维非织造基质的纤维选自聚合物纤维、无机纤维以及它们的组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述聚合物纤维包含选自聚酰胺、聚烯烃、聚砜以及它们的组合的至少一种聚合物。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述无机纤维包含选自玻璃、陶瓷以及它们的组合的至少一种无机材料。
7.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述多孔纤维非织造基质包含至少一种聚合物粘 合剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚合物粘合剂选自聚合物树脂、聚合物粘合剂纤维以及它们的组合。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述聚合物粘合剂基本上不附着于所述浓集剂粒子。
10.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述粒子机械夹带于所述多孔纤维非织造基质之中。
11.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述粒子包括微粒子。
12.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述金属硅酸盐是非晶态的。
13.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述金属选自镁、钙、锌、铝、铁、钛以及它们的组合。
14.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述金属是镁。
15.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述样品处于流体形式。
16.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述靶细胞分析物选自细菌、真菌、酵母、原生动物、病毒、细菌内生孢子的细胞、其组分以及它们的组合。
17.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述接触通过将所述样品通过所述浓集装置而实施。
18.根据权利要求1或任何其他前述权利要求所述的方法，其中所述检测通过选自以下方法来实施:基于培养的方法、显微镜法和其他成像方法、基因检测方法、免疫检测方法、基于发光的检测方法以及它们的组合。
19.一种浓集方法，包括 (a)提供浓集装置，其包含 (1)多孔纤维非织造基质，其包含 (1)至少一种原纤化纤维，以及 ( )至少一种聚合物粘合剂，以及 (2)至少一种浓集剂的多个粒子，该浓集剂包含至少一种非晶态球化金属硅酸盐； 所述粒子网结于所述多孔纤维非织造基质中； (b)提供流体样品，其包含至少一种靶细胞分析物；和 (c)将所述流体样品以如此方式通过所述浓集装置，从而所述至少一种靶细胞分析物的至少一部分由所述浓集装置结合或捕获。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法还包括检测至少一种结合的靶细胞分析物的存在；和/或其中所述非晶态球化金属硅酸盐是非晶态球化硅酸镁；和/或其中所述多孔纤维非织造基质通过湿成网方法形成。
21.一种浓集装置，包含 (a)多孔纤维非织造基质；以及 (b)至少一种浓集剂的多个粒子，所述浓集剂包含非晶态球化金属硅酸盐； 其中所述粒子网结于所述多孔纤维非织造基质中。
22.—种试剂盒，包括: (a)根据权利要求21的至少一种浓集装置；以及 (b)用于实施根据权利要求1所述的方法的至少一种测试容器或测试试剂。
23.一种用于制备浓集装置的方法，包括: (a)提供多根纤维； (b)提供至少一种浓集剂的多个粒子，该浓集剂包含非晶态球化金属硅酸盐；以及 (C)将所述多根 纤维的至少一部分形成使所述多个粒子的至少一部分网结于其中的多孔纤维非织造基质。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述形成过程通过湿成网方法实施；和/或其中所述非晶态球化金属硅酸盐是非晶态球化硅酸镁。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述湿成网方法包括 (a)在至少一种分散液中形成所述多根纤维、所述多个粒子以及至少一种聚合物粘合剂的分散体； (b)将所述聚合物粘合剂沉积于所述多根纤维的至少一部分上；以及 (C)从所述分散体中除去所述分散液。
26.一种过滤介质，包含: (a)多孔纤维非织造基质；和 (b)至少一种浓集剂的多个粒子，所述浓集剂包含非晶态球化金属硅酸盐； 其中所述粒子网结于所述多孔纤维非织造基质中。
全文摘要
本发明提供了一种用于捕获或浓集用于检测或测定的微生物的方法，其包括(a)提供浓集装置，所述浓集装置包含(1)多孔纤维非织造基质和(2)至少一种浓集剂的多个粒子，所述浓集剂包含金属硅酸盐，所述粒子网结于所述多孔纤维非织造基质中；(b)提供包含至少一种靶细胞分析物的样品；(c)使所述浓集装置与所述样品接触，从而所述至少一种靶细胞分析物的至少一部分由所述浓集装置结合或捕获；以及(d)检测至少一种结合的靶细胞分析物的存在。
文档编号C12Q1/02GK103221550SQ201180055862
公开日2013年7月24日 申请日期2011年11月30日 优先权日2010年12月6日
发明者M·T·克舍撒加, A·W·雷宾斯 申请人:3M创新有限公司