用于通过同源重组转化和选择酵母转化体的盒和方法

用于通过同源重组转化和选择酵母转化体的盒和方法
【专利摘要】本发明涉及用于选择具有通过同源重组整合的目的核酸片段的转化酵母细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使酵母细胞与以下物质相接触：包含正选择基因和含夹有限制性位点之51和31重组区的同源重组位点的载体，以及待通过同源重组插入所述载体的同源重组位点中的目的核酸片段，所述核酸片段的侧翼是与同源重组位点的51和31重组区基本相同的区域；以及(ii)用所述载体和所述目的核酸片段转化所述酵母细胞；(iii)选择含有带所述正选择基因之所述载体的酵母细胞，所述酵母细胞的特征在于：负选择基因也存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接；以及25(iv)所述方法还包括使用所述负选择基因选择含有所述目的DNA片段的酵母细胞的步骤。本发明还提供了用于实施本发明方法的盒和试剂盒。
【专利说明】用于通过同源重组转化和选择酵母转化体的盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于容易地选择通过同源重组得到的期望转化酵母细胞的盒(cassette)和方法。
【背景技术】
[0002]酵母细胞特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是生产重组蛋白的重要生物体，原因是它们在化合物如工业用酶的情况下满足进行有效大量生产的需求以及在药用蛋白质情况下满足安全性和可靠性标准二者。已对酿酒酵母进行了广泛研究，因此对其进行操作的分子和遗传工具是可用的并且其是成功的工业微生物。
[0003]使用不同技术来通过表达载体将目的DNA片段插入酵母细胞中。第一种方法是公知的通过DNA修饰酶(DNA限制酶和DNA连接酶)进行的DNA亚克隆。简言之，为了将DNA片段亚克隆到穿梭载体中，在启动子的3’端一般存在多克隆位点(MCS)。该MCS DNA包含核酸内切酶(称为限制酶)所识别的在基因组中很罕见的核苷酸序列。在用存在于底物两者中的特定限制酶通过典型分子方法对DNA(待亚克隆的DNA和穿梭载体)两者进行酶消化(Sambrook J 和 Russel D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2001,第 3 版，CSHL Press)之后，进行连接并在用连接产物进行细菌转化之后在细菌中得到质粒的增殖。为了选择携带有期望质粒的细菌转化体，通过分析多个个体转化体的质粒含量(通过PCR或通过限制酶)进行最后一步。在选择了携带有期望质粒的单个细菌转化体后，就使用传统技术进行 质粒生产、提取和纯化。使用几百纳克的该纯化质粒来转化酵母。
[0004]用于将DNA亚克隆到穿梭酵母载体中的一种更简单的方法利用在酵母中发生的同源重组事件。在该情况下，不需要使用细菌作为用于质粒增殖的宿主，原因是在一步酵母共转化(经单切的去磷酸化载体和PCR扩增DNA)中使用了在两侧均携带有与位于表达载体中之序列同源的序列的PCR扩增DNA片段。
[0005]但是，同源重组不允许得到100%的期望转化体:通过该方法得到的酵母转化体携带有空载体(当同源重组不发生时)或期望质粒。本发明人示出全部转化体的约仅70%含有期望质粒。为了在所有酵母转化体中选出目的酵母转化体，必须对几个单一的酵母转化体进行几个步骤，其由酵母DNA纯化和分析或酵母功能测定组成。
[0006]因此，需要用于容易地选择通过同源重组得到的目的酵母转化体的新工具和方法。

【发明内容】

[0007]本发明人开发了用于容易地选择通过同源重组在表达载体中整合有目的核酸片段的转化酵母细胞的新方法和盒。所述方法和盒使得能够节约金钱和时间:因此，它们避免了用以选择期望酵母的DNA纯化步骤，并且它们允许在一步中选择期望的转化酵母细胞。
[0008]本发明涉及用于选择具有通过同源重组整合于载体中的目的核酸片段的转化酵母细胞的方法，所述方法包括以下步骤:[0009](i)使酵母细胞与以下物质相接触:
[0010]-包含以下的载体:
[0011]〇正选择基因，
[0012]〇包含夹有(framing)限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和
[0013]-待通过同源重组插入所述载体的同源重组位点中的目的核酸片段，所述核酸片段的侧翼是与同源重组位点的5’和3’重组区基本相同的区域；以及
[0014](ii)用所述载体和所述目的核酸片段转化所述酵母细胞；
[0015](iii)选择含有带所述正选择基因之所述载体的酵母细胞，
[0016]其特征在于:
[0017]-负选择基因也存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接；以及
[0018](iv)所述方法还包括使用负选择基因选择含有目的DNA片段的酵母细胞的步骤。 [0019]本发明还提供了包含以下部分的盒:
[0020]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，以及
[0021]-存在于所述同源重组位点下游的负选择基因；
[0022]以及包含以下部分的载体:
[0023]-复制起点，
[0024]-正选择基因,所述正选择受启动子控制，
[0025]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，以及
[0026]-负选择基因，其存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接并且受终止子控制。
[0027]本发明还涉及用于得到本发明载体的方法，所述方法包括将根据本发明的盒整合到载体(优选质粒)中的步骤，所述载体(优选质粒)包含:
[0028]-正选择基因，和
[0029]-启动子，
[0030]从而使位于盒之所述同源重组位点下游的所述负选择基因受载体中所存在的所述启动子控制，所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。
[0031]本发明最后提供了包含以下部分的试剂盒:
[0032]-根据本发明的盒，和
[0033]-至少一种酵母细胞培养基。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]附图构成本说明书的一部分，其包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参照这些附图的一幅或更多幅，并与本文所示的具体实施方案的详细描述相结合，可更好地理解本发明。
[0035]图1:产生可插入pRS316表达载体的启动子区下游的盒。
[0036]该构建的目的是产生盒,其中ura30RF将处于任意穿梭酵母载体his3, Leu2或Trpl形式的启动子控制之下。如图1a所示，ura3的前面是5’同源区(RH5)、独特限制性位点和3，同源区(RH3)。
[0037]启动子与ura30RF起始密码子之间的距离在该结构中应导致ura3表达，而如果由于DNA片段在RH5与RH3序列之间插入使得ura3基因距启动子很远，则ura3将不表达。
[0038]然后，将转化体与5-F0A —起孵育将导致表达URA3的转化体死亡，而导致含有在其中插入PCR扩增片段之载体的转化体生长(图1b)。
[0039]图2:通过5-F0A孵育选择含有HIV-1蛋白酶的酵母重组体。
[0040]用XhoI切割vs3gal-RH，纯化，与HIV-蛋白酶的PCR扩增序列(在其5’和3’末端存在RH1-5’和RH1-3’序列)混合并用于转化W303酵母菌株。使转化体在缺少组氨酸和5-F0A的基本培养基(minimal media)中在30°C下生长24小时至最终浓度为Img /ml，然后在缺少组氨酸的基本培养基中保持48小时。用无菌水将细胞清洗3次，测试HIV-1蛋白酶在含半乳糖培养基中的表达。酵母中HIV-1蛋白酶的表达导致细胞死亡(Blanco等，2003，专利申请W02011 / 007244)。结果清楚地证明，所产生的DNA盒对于通过5-F0A孵育仅仅选择其中DNA片段被插入载体中的克隆是实际有效的，所述克隆如通过在半乳糖(SGalR-his培养基)中细胞生长的停滞所示，该停滞通过添加HIV-1蛋白酶的特定抑制剂(IP)来阻止。[0041]发明详述
[0042]本发明的方法
[0043]本发明的第一个目的涉及用于选择具有通过同源重组整合于载体中的目的核酸片段的转化酵母细胞的方法，所述方法包括以下步骤:
[0044](i)使酵母细胞与以下物质相接触:
[0045]-包含以下的载体:
[0046]〇正选择基因、
[0047]〇包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和
[0048]-待通过同源重组插入所述载体的同源重组位点中的目的核酸片段，所述核酸片段的侧翼是与同源重组位点的5’和3’重组区基本相同的区域；以及
[0049](ii)用所述载体和所述目的核酸片段转化所述酵母细胞；
[0050](iii)选择含有带所述正选择基因之所述载体的酵母细胞，
[0051]其特征在于:
[0052]-负选择基因也存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接；以及
[0053](iv)所述方法还包括使用负选择基因选择含有目的DNA片段的酵母细胞的步骤。
[0054]应注意，通过本发明的方法:
[0055].因为低与所述启动子可操作地连接的负选择基通的表达，所以在载体中未整合有目的DNA片段的转化酵母细胞在步骤(iv)中死亡，并且
[0056].因为当目的核酸片段插入所述负选择基因与其启动子之间时不再与所述启动子可操作地连接的负选择基因不表达，所以在载体中整合有目的DNA片段的轾化酵母细胞在步骤(iv)之后存活。[0057]术语“转化”是指使DNA片段、质粒或载体转移到宿主生物体中。包含这样的DNA片段、质粒或载体的宿主生物体称为“重组”或“转化”生物体。
[0058]在本发明的方法中，转化生物体是酵母，例如酿酒酵母、白假丝酵母(Candidaalbicans)和麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula poIymorpha) >脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、季氏毕赤酵母(Pichia guillerimondii)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。优选地，转化酵母细胞是酿酒酵母。
[0059]术语“载体”或“质粒”是指常携带有不是细胞中心代谢之一部分的基因并且通常是环状双链DNA分子形式的染色体外元件。这样的元件可以是来源于任何来源的单链或双链DNA或RNA的线状或环状的自主复制序列、基因组整合序列、噬茵体或核苷酸序列，其中大量核苷酸序列被连接或重组成独特的构建体，其能够将用于所选基因产物的启动子序列和DNA序列与适当的3’未翻译序列一起引入细胞中。
[0060]因此本发明的载体和质粒包含在酵母中有功能的复制起点。术语“在酵母中有功能的复制起点”是指允许载体或质粒独立于染色体复制的任意核酸序列。一般来说，复制起点在以下酵母的至少一种或更多种中有功能:酵母酵母、白假丝酵母(Candida albicans)和麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、季氏毕赤酵母(Pichiaguillerimondii)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。合适的复制起点包括例如arsl、着丝点ori 和 2 μ ori。 [0061]在一个实施方案中，本发明的方法包括通过将盒整合到包含:
[0062]-正选择基因，和
[0063]-启动子，
[0064]的载体(优选质粒)中从而得到本发明载体的早先步骤，所述盒包含:
[0065]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和
[0066]-存在于所述同源重组位点下游的负选择基因，
[0067]从而使位于盒的所述同源重组位点下游的所述负选择基因受载体中存在于盒之所述同源重组位点上游的所述启动子控制，所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。
[0068]根据本发明，术语“盒(cassette)”应认为是包含通过任意方式(例如，通过酶消化和DNA连接、通过重组，更特别地通过同源重组)整合到质粒中的特定核酸序列的元件。
[0069]本文所使用的术语“启动子”是指能够引导与所述启动子可操作地连接的基因或编码序列转录(因此表达)的DNA序列。
[0070]一般来说，术语“可操作地连接”意指转录调节核酸相对于任意编码序列位于使得转录开始的位置。如本文所使用的，其意指启动子位于编码区的5’端，其距离允许所述编码区表达。启动子可整体来源于天然基因，或者由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成DNA区段。本领域技术人员应理解，不同启动子可在不同组织或细胞类型中或在不同发育阶段中或响应于不同环境条件引导基因的表达。[0071]有不同种类的启动子。本文所使用的启动子可以是诱导型或调节型启动子(其活性受生物因子或非生物因子的存在或不存在而上调或下调)或者组成型启动子(其通常在大多数细胞类型中导致基因表达)。根据本发明使用的启动子可以是强启动子(导致高基因表达)或弱启动子(导致低基因表达)(Maya,D,Quintero,MJ,Munoz-Centeno,M,Chavez,S,Systems for applied gene control in Saccharomyces cerevisiae.2008.BiotechnolLett30:979-987)。
[0072]根据本发明使用的启动子在酵母细胞中有功能。可用于本发明的在酵母中有功能的启动子的实例包括但不限于=GALl启动子(SEQ ID n° 1)、ADH1启动子(SEQ ID n° 2)和强 GPD(甘油醛 3P DH)启动子(SEQ ID η。3)。(MAYA 等，Biotechnol.Lett.，第 30 卷，第 979-987 页，2008)。
[0073]“选择基因”(或“报道基因”、“可选择基因”)意指通过其在宿主细胞中的存在(即，表达后)可允许将宿主与不包含可选择基因的细胞区分开的基因。可选择基因可分类为几种不同类型，包括正选择基因和负选择基因。其可以是在某些条件下导致特定作用的核酸或蛋白质表达产物。可另外地添加另外的组分(例如底物、配体等)以允许基于可选择基因进行选择或分选。
[0074]如本文所使用的，本发明的选择基因以起始密码子开始并且以终止密码子结束，其前面是启动子(允许并控制基因表达)，后面是有功能的终止子。
[0075]“正选择基因”是允许表达正选择基因的细胞在杀死缺少所述基因的细胞或防止其生长的生长条件下存活的核酸序列。正选择基因的实例是启动抗生素抗性基因(例如新霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因)表达的核酸序列。通过施用G418来选择不包含新霉素抗性基因的细胞，而G418对表达新霉素抗性基因的细胞无害(正选择)。
[0076]优选的在酵母中有功能的正选择基因有存活基因，其包括ADE2、HIS3、LEU2或TRPl。ALG7赋予增加的衣霉素抗性，新霉素磷酸转移酶基因赋予G418抗性，并且CUPl基因允许酵母在铜离子存在下生长。
[0077]根据本发明，载体中存在的正选择基因是受功能性酵母启动子控制的在酵母中有功能的典型正选择基因。
[0078]优选地，所述正选择基因是HIS3基因(SEQ ID n° 4)。为了选择在其基因组中缺少功能性HIS3基因的含有根据本发明方法步骤(iii)之载体的酵母细胞，将培养的酵母细胞放置在缺少组氨酸的培养基上。仅有表达His3基因的酵母细胞能够在其培养基中生长。
[0079]“负选择基因”是通常在施用适当外源物质之后杀死表达所述负选择基因的细胞、防止其生长或者以其他方式进行负选择的核酸序列。负选择基因的一个实例是启动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)表达的核酸序列。通过施加更昔洛韦来负选择表达HSV-TK的细胞(负选择)，而更昔洛韦对不表达所述基因的细胞相对无害。美国专利N0.5，464，764 (通过引用并入本文)进一步定义了术语并进一步解释了方法。负选择基因的另一个实例是“URA” (乳清苷5’磷酸脱羧酶)。“URA3”是出芽酵母酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的“URA”基因，而“URA4”是粟酒裂殖酵母的“URA”基因。本文所使用的术语“URA3基因”是指这样的基因，其编码参与嘧啶核糖核 苷酸合成并且对于在缺少尿嘧啶或尿苷之培养基中的细胞生长所必需的酶。所述酶还将5-氟乳清酸(5-F0A)转化为有毒化合物5-氟尿嘧啶，导致细胞死亡。URA3基因可用作用于DNA转化特别是酵母DNA转化的阳性和负选择基因。
[0080]本文所使用的“URA3基因”包括来源于任意酵母，优选来源于酿酒酵母或乳酸克鲁维酵母的URA3基因，以及含有突变并且维持上述URA3活性的这种URA3功能保守性变体。SEQ ID n° 5给出了酿酒酵母URA3基因序列的一个实例。
[0081]本文所使用的“变体”或“功能保守性变体”包括这样的核酸序列，其中改变了一个或几个核苷酸，并且如通过BLSAT或FASTA算法确定的，其与与之相比较的天然或亲本基因具有至少80%核苷酸同一性，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%核苷酸序列同一性，并且与与之相比较的天然或亲本基因具有相同或基本相似的性质或功能。
[0082]优选地，所述负选择基因是URA3基因。为了根据本发明方法的步骤(iv)选择含有目的核酸片段的酵母细胞，将酵母细胞放置在包含5-F0A的培养基上。
[0083]在没有所述片段的细胞中，URA3基因与控制URA3基因表达的启动子在本发明载体中可操作地连接，并且表达URA3。因为在URA3基因表达时5-F0A转化为有毒化合物，所以没有所述片段的酵母细胞死亡。
[0084]在含有所述片段的细胞中，URA3基因与所述启动子被所述片段隔开，并且不再根据本发明可操作地连接。因此，URA3不表达，5-F0A对于这些细胞是无毒的，这些细胞仍然存活并继续生长。
[0085]实际上，根据本发明，负选择基因受在酵母中有功能的启动子控制。在本发明的载体中，虽然负选择基因与所述启动子被同源重组位点隔开，但是仍与所述启动子可操作地连接(例如，与所述启动子足够近以允许所述启动子控制负选择基因的表达)。
[0086]当发生同源重组时，目的核酸片段被插入同源重组位点中，从而在启动子与负选择基因之间。在这种情况下，启动子与负选择基因不是可操作地连接的(原因是它们之间的距离太大)。
[0087]本发明人示出“可操作地连接”的概念取决于启动子的种类。
[0088]在一个特定的实施方案中，本发明涉及选择通过同源重组整合有目的核酸片段的转化酵母细胞的所述方法，其中:
[0089]-负选择基因受强启动子优选GPD启动子控制，并且
[0090]-通过同源重组插入本发明的目的核酸片段使负选择基因与其启动子隔开至少2000pb，特别地至少3000pb，更特别地至少4000pb，优选至少5000pb。
[0091]在一个特定的实施方案中，本发明涉及选择具有通过同源重组整合于载体中的目的核酸片段的转化酵母细胞的所述方法，其中:
[0092]-负选择基因受诱导型启动子(在非诱导型培养基中有渗漏表达(leaky))优选GAL-1启动子控制，并且
[0093]-通过同源重组插入本发明的目的核酸片段使负选择基因与其启动子隔开至少120pb，特别地至少150pb，更特别地至少188pb。
[0094]在一个特定的实施方案中，本发明涉及选择通过同源重组整合有目的核酸片段的转化酵母细胞的所述方法，其中:
[0095]-负选择基因受中间启动子优选ADHl启动子控制，并且
[0096]-通过同源重组插入本发明的目的核酸片段使负选择基因与其启动子隔开至少120pb，特别地至少150pb，更特别地至少169pb。[0097]在本发明的一个实施方案中，选择步骤(iii)和(iv) 二者可同时实现或分别实现，优选同时实现。
[0098]术语“同源重组位点”是指允许通过同源重组将目的核酸片段引入载体或穿梭载体中的位点。简言之，同源重组是链交换过程，其可自发地随着同源序列(即，互补链的集合)对准而发生。如本领域所已知的，酵母的同源重组是高效的。Orr-Weaver等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:6345-6358.1981 ；Ma 等，Gene, 58:201-216(1987) ；Petermann,Nucleic Acids Res.,26(9):2252-2253(1998);其各自通过引用并入本文。允许进行同源重组的方法和条件在本领域是公知的。
[0099]因此，一般来说，同源重组位点包含两个不同的但一般毗连的区域。第一区(本文中称为5’区)一般与待插入载体中的目的核酸片段侧翼的5’区相同。第二区(本文中称为3’区)一般与待插入载体中的目的核酸片段侧翼的3’区相同。优选地，5’区和3’区各自为至少12或15个核酸长。更优选地，5’区和3’区各自为至少约20或30个核酸长，并且更优选地至少约50个核酸长，并且最优选地至少约60个核酸长。根据本发明，同源重组位点序列是指 这样的任意核酸序列,其由于载体不包含对应于同源重组位点序列的另一序列而对于载体来说是独特的并且其与待插入目的核酸片段的侧翼区同源。
[0100]实施例中提供了 5’和3’同源重组区对的实例(分别是SEQ ID n° 6和SEQ IDn° 7 或者分别是 SEQ ID n° 16 和 SEQ ID n° 17)。
[0101]本文所使用的术语“目的核酸片段”是指待在同源重组位点插入载体中的任意核酸。
[0102]根据本发明，目的核酸片段的侧翼是与本文所提供载体上同源重组位点的5’和3’区相同(或基本相同)的5’和3’区。因此，当将目的核酸片段插入载体中时，目的核酸片段侧翼的5’和3’区在同源重组期间替换了同源重组位点的5’和3’区。
[0103]本文所使用的基本相同是在待插入DNA片段与重组区的碱基之间具有约80%，特别是90 %，优选95 %，更优选99 %的同一性。
[0104]根据本发明，所述目的核酸片段是编码(或不编码)待生产蛋白质的任意DNA序列。例如，所述片段可以是编码任意外源或酵母蛋白质的基因，或者非编码核酸序列。优选地，所述片段选自包含以下的组=HIv-1或HIV-2逆转录酶基因序列、HIV-1或HIV-2蛋白酶基因序列、HIV-1或HIV-2整合酶基因序列、HIV-1或HIV-2gag-poi前体基因全序列或部分序列。
[0105]在本发明的一个实施方案中，用于选择通过同源重组整合有目的核酸片段的转化酵母细胞的方法，所述方法包括在合成目的核酸片段的更早先步骤，所述片段包含待研究或待生产的核酸序列，其侧翼是与步骤(i)载体上的同源重组位点的5’和3’区基本相同的序列。
[0106]本文所使用的术语“限制性位点”或“限制性识别位点”是DNA分子上包含限制酶所识别的核苷酸特定序列的位置。特定限制酶可在其识别位点中或者在附近的其他地方在两个核苷酸之间切割序列。根据本发明，限制性位点在本发明载体中是独特的，原因是载体不包含对应于所述限制性位点的另一序列。可使用任意的限制性位点；限制性位点的实例包括但不限于:Not1、BamH1、Xho1、EcoR1、Nco1、Sac1、Sail、Sma1、PvuI1、ScaI 等。本发明的限制性位点允许使本发明载体线性化用于同源重组。实际上，用经单切的去磷酸化载体进行同源重组。
[0107] 本发明的盒和载体
[0108]本发明的第二个目的涉及包含以下部分的盒:
[0109]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，以及
[0110]-存在于所述同源重组位点下游的负选择基因。
[0111]根据本发明，将所述盒用于插入包含正选择基因和启动子的载体(优选质粒)中，从而使盒的负选择基因置于载体的启动子控制之下(即在所述盒的所述同源重组位点下游)，所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。
[0112]所得载体(例如，所述盒已被正确插入其中的质粒)用于实施本发明的方法。
[0113]根据本发明，载体包含复制起点并且正选择基因受启动子控制。本发明选择基因的每一个都还受终止子控制。
[0114]本文所使用的术语“终止子”或“转录终止子”是指示出基因组DNA上基因或操纵子之转录末端的核酸序列区域。在酵母细胞中有功能的终止子在本领域是公知的，如ADHl终止子、STE2终止子、CycEl。
[0115]本发明的第三个目的涉及包含以下部分的载体:
[0116]_复制起点，
[0117]-正选择基因，所述正选择受启动子控制，
[0118]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，以及
[0119]-负选择基因，其存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接并且受终止子控制。
[0120]根据本发明，正选择基因和负选择基因每个均处于启动子和终止子控制之下。
[0121]在本发明的一个实施方案中，所述载体是穿梭载体，例如构建成使得其可在酵母和细菌细胞(例如大肠杆菌)两者中增殖的载体。
[0122]因此，在本发明的一个特定实施方案中，所述载体还包含细菌复制起点和细菌正选择基因(例如，氨苄西林抗性基因)。
[0123]根据本发明，所述载体可用于转化酵母细胞以通过同源重组将目的核酸片段插入所述细胞中，并通过上述选择方法选择在表达载体中实际含有所述目的核酸片段的转化酵母细胞。
[0124]在一个实施方案中，本发明涉及用于得到本发明载体的方法，所述方法包括将盒整合到包含:
[0125]-正选择基因，和
[0126]-启动子，
[0127]的载体中，所述盒包含:
[0128]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，以及
[0129]-存在于所述同源重组位点下游的负选择基因，
[0130]从而使位于盒所述同源重组位点下游的所述负选择基因受载体中所存在的所述启动子控制，所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。
[0131]以上更详细地描述了本发明的盒和载体。[0132]本发明的试剂盒
[0133]本发明的第四个目的涉及用于实施本发明方法的试剂盒。
[0134]在一个实施方案中，本发明涉及包含以下部分的试剂盒:
[0135]-本发明的盒，
[0136]-至少一种酵母细胞培养基。
[0137]根据本发明，所述试剂盒用于将所述盒插入载体中并且用所述载体和目的核酸片段转化酵母细胞以实施本发明的方法。
[0138]所述载体可以是包含正选择基因和启动子的任意功能性载体。
[0139]在一个特定实施方案中，所述试剂盒还可包含:
[0140]-允许通过 本发明载体中存在的负选择和/或正选择基因进行选择的选择性培养基或化合物，
[0141]在另一个特定实施方案中，所述试剂盒还可包含:
[0142]-与5’和3’同源重组区相同或基本相同的核酸片段序列。
[0143]在一个实施方案中，本发明涉及包含以下的试剂盒:
[0144]-如上所定义的根据本发明的载体，和
[0145]-至少一种培养酵母细胞的培养基。
[0146]在一个特定实施方案中，所述试剂盒还可包含:
[0147]-允许通过本发明载体中存在的负选择和/或正选择基因进行选择的选择性培养基或化合物，
[0148]在另一个特定实施方案中，所述试剂盒还可包含:
[0149]-与5’和3’同源重组区相同或基本相同的核酸片段序列。
[0150]在另一个实施方案中，本发明的试剂盒还包含酵母细胞，优选酿酒酵母的酵母细胞。
[0151]本文所使用的术语“试剂盒”是指用于运输物质的任意运输系统。在反应测定的上下文中，这样的递送系统包括允许存储、运送或运输反应试剂(例如，适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲剂，用于进行测定的书面说明等)由一个位置到另一个位置的系统。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或更多个包裹体(enclosure)(如,盒)。本文所使用的术语“分散化试剂盒(fragmented kit)”是指包含两个或更多个独立容器的运输系统，所述容器各自包含总试剂盒组件的亚部件(subportion) 0容器可一起或单独运输至目的接受者。例如，第一容器可包含用于测定的酶，而第二容器包含寡核苷酸。术语“分散化试剂盒”旨在涵盖下述试剂盒，其包含联邦食品、药品和化妆品法案(Federal Food,Drug, and Cosmetic Act) 520 (e)章节所规定的分析特异性试剂(Analyte specific reagent,ASR),但是并不限于此。实际上,术语“分散化试剂盒”包括含有两个或更多个独立容器的任意运输系统，所述容器各自包含总试剂盒组件的亚部件。相反地，“组合试剂盒”是指在单一容器中(例如，在容纳各期望组件的单一盒中)包含所有的反应测定组件的运输系统。术语“试剂盒”包括分散化试剂盒和组合试剂盒二者。
[0152]本发明试剂盒还可包含一种或更多种试剂、缓冲剂、杂交介质、核酸、引物、核苷酸、探针、分子量标志物、酶、固体支持物、数据库、用于计算分配顺序的计算机程序和/或可丢弃式实验室设备(如多孔板)，以容易地帮助实施本发明方法。可包含在本发明试剂盒中的酶包括核苷酸聚合酶等。固体支持物可包括珠子等，而分子量标志物可包括可缀合标志物，例如生物素和链霉亲和素等。
[0153]在一个实施方案中，试剂盒包含用于实施本文所述方法的说明书。所述说明书可通过有形介质以任意可理解的形式来提供，例如印刷在纸上、计算机可读介质等。
[0154]实施例
[0155]以下实施例描述了进行和实施本发明的优选实施方式中的一些。但是，应理解，实施例仅是说明性目的的并且不意在限制本发明的范围。
[0156]实施例1:将“自杀盒(suicidal cassette) ”插入经修饰DRS表达载体的GAL启动子区下游。
[0157]在37°C用 SacI 将使用引物 5SacUra(SEQ ID η。8)和 3UraSac (SEQ ID η。9)进行PCR扩增的URA3编码区消化I小时，从而将其克隆到GALl启动子控制下的也用SacI消化过的PRS载体经修饰版本中。位于GALl启动子下游的新产生的盒包含以下序列:
[0158]-RHl5’ (SEQ ID η。6)
[0159]-独特的XhoI限制酶位点
[0160]-RHl3’ (SEQ ID η ° 7)
[0161]-URA30RF。
[0162]在该结构中，URA3基因的起始密码子位于GALl启动子末端的下游88bp处。在该新产生的表达载体vs3gal-RH中，由于GALl启动子在pRS骨架的HIS3版本中的“渗漏表达”特征，所以该启动子与URA30RF起始密码子之间的距离导致即使在葡萄糖培养基中也有URA3表达(表1)。
[0163]
【权利要求】
1.一种用于选择转化酵母细胞的方法，所述酵母细胞具有通过同源重组整合于载体中的目的核酸片段，所述方法包括以下步骤: (i)使酵母细胞与以下物质相接触: -包含以下的载体: 〇正选择基因， 〇包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和-待通过同源重组插入所述载体的所述同源重组位点中的目的核酸片段，所述核酸片段的侧翼是与所述同源重组位点的所述5’和3’重组区基本相同的区域；以及(?)用所述载体和所述目的核酸片段转化所述酵母细胞； (iii)选择含有带所述正选择基因之所述载体的酵母细胞， 其特征在于: -负选择基因也存在于所述载体中所述同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在所述目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接；以及 (iv)所述方法还包括使用所述负选择基因选择带有所述目的DNA片段的酵母细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过将盒整合到包含: -正选择基因，和 -启动子 的载体中从而得到本发明载体的早先步骤，所述盒包含: -包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和 -在所述同源重组位点下游的负选择基因， 从而使位于所述盒之所述同源重组位点下游的所述负选择基因受所述载体中存在的所述启动子控制，所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，所述方法包括合成目的核酸片段的更早先步骤，所述片段包含待研究或待生产的核酸序列，其侧翼是与步骤(i)的所述载体上同源重组位点的5’和3’区基本相同的序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述负选择基因是URA3基因。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中控制所述负选择基因表达的所述启动子是GALl。
6.根据权利要求4和5所述的方法，其中: -所述负选择基因URA3受诱导型启动子(在非诱导型培养基中有渗漏表达)优选GAL-1启动子控制，并且 -通过同源重组插入本发明的所述目的核酸片段使得所述负选择基因与其启动子隔开至少120个碱基对，最优选至少188个碱基对。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中控制所述负选择基因表达的所述启动子是ADHl。
8.根据权利要求4和7所述的方法，其中: -所述负选择基因URA3受ADH-1启动子控制，并且-通过同源重组插入本发明的所述目的核酸片段使得所述负选择基因与其启动子隔开至少100个碱基对,最优选至少169个碱基对。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中同时实现选择步骤(iii)和(iv)。
10.一种盒，其包含: -包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和 -存在于所述同源重组位点下游的负选择基因。
11.根据权利要求10所述的盒，其中所述负选择基因是URA3基因。
12.—种载体，其包含: -复制起点， -正选择基因，所述正选择受启动子控制， -包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，以及-负选择基因，其存在于所述载体中所述同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接并且受终止子控制。
13.一种得到如权利要求12所限定的载体的方法，所述方法包括将根据权利要求10至11中任一项所述的盒整合到包含: -正选择基因，和 -启动子 的载体中， 从而使位于所述盒所述同源重组位点下游的所述负选择基因受所述载体中所存在的所述启动子控制，所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。
14.一种试剂盒，其包含: -根据权利要求10至11中任一项所述的盒， -至少一种酵母细胞培养基。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，所述试剂盒还包含: -允许通过本发明载体中存在的所述负选择和/或正选择基因进行选择的选择性培养基或化合物，和/或 -与所述5’和3’同源重组区相同或基本相同的核酸片段序列。
【文档编号】C12N15/90GK103917648SQ201180072966
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2011年6月20日 优先权日:2011年6月20日
【发明者】克里斯特勒·佩林-伊斯特, 帕布洛·格卢尚科夫 申请人:阿米卡纳生物技术公司