专利名称：一种利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测microRNA的分析方法
技术领域：
本发明涉及了一种荧光纳米银簇探针检测microRNA的分析方法，属于检测分析领域。
背景技术：
microRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约18 25个核苷酸。它参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。近期研究发现，miCToRNA在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，已成为一类理想的肿瘤标记物。所以定量检测miCToRNA对了解其生物功能，癌症的早期诊断以及新药的开发，都具有十分重要的意义。与传统的核酸检测相比，miCToRNA其独有的特点，如序列短，家族序列同源性高及低丰度表达，增加了其检测的难度。目前检测microRNA的方法主要有Northern印迹分析,微阵列芯片技术,聚合酶链式反应(PCR)等。虽然Northern印迹是当前microRNA分析的标准方法,但操作繁琐,耗时长，灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，而且对污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。微阵列芯片技术虽然可实现高通量，多组分同时检测，但是其制作和检测费用高；芯片上可利用的样品体积很小，导致灵敏度不高；此外，microRNA序列短，序列相似性高，不能同时优化所有待测的microRNA杂交环境，所以选择性不高。聚合酶链式反应(PCR)是现在定量检测microRNA的主要方法，包括引物延伸RT-PCR，茎环引物RT-PCR和microRNA加尾RT-PCR等方法。虽然基于聚合酶链式反应的microRNA检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等特点，但是需要逆转录操作，增加了实验的成本和设计的复杂性。随着新的microRNA序列不断发现和对microRNA功能研究的逐步深入,对microRNA的分析检测提出了新要求。因此，开发简单直接，灵敏度高，特异性强，准确检测microRNA的分析技术仍然是一个挑战。
发明内容
本发明涉及一种利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测microRNA的分析方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性强，背景信号低、线性检测范围宽、适用范围广等优点，是一种简便实用的分析技术。本发明利用靶标microRNA诱导恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测microRNA的分析方法如下。设计一条含有三种功能序列的DNA扩增模板与祀标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列和合成荧光纳米簇的DNA互补序列。从3’端到5’端排列顺序为祀标microRNA结合序列,nicking核酸内切酶酶切序列,祀标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列，和合成荧光纳米簇的DNA互补序列。当靶标microRNA与DNA扩增模板结合后，诱导恒温扩增反应和nicking核酸内切酶特异性的酶切反应得到大量单链DNA产物，其中一种单链DNA产物能够与DNA扩增模板结合，继续充当靶标microRNA的引物作用，从而极大地提高扩增的效率。另一种单链DNA产物即为荧光纳米银簇的合成DNA序列，能与加入的硝酸银离子溶液在硼氢化钠还原作用下，合成荧光纳米银簇探针，在一定波长的入射光照射下，发射出相应的荧光，通过测定反应体系中的荧光信号并计算荧光改变值，与标准工作曲线比对，推算出靶标microRNA的浓度。此外，DNA扩增模板中功能序列也可以有不同的组合和排列模式，如从3’端到5’端排列顺序为靶标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列，合成荧光纳米簇的DNA互补序列，nicking核酸内切酶酶切序列，和合成荧光纳米簇的DNA互补序列。本发明的方法可以进一步描述如下利用祀标microRNA与DNA扩增模板结合后，诱导恒温扩增反应和nicking核酸内切酶特异性的酶切反应得到单链DNA产物，该单链DNA产物与加入的硝酸银溶液在硼氢化钠还原作用下制备荧光纳米银簇探针，测定反应体系中的荧光信号并计算荧光信号改变值，与标准工作曲线比对，推算出祀标microRNA的浓度。
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所述荧光纳米银簇探针粒径为I 10nm，激发波长为500 680nm，发射波长为510 900nm。本发明的靶标microRNA检测方法包括以下操作步骤步骤I将靶标microRNA加入到DNA扩增模板溶液中，进行孵育反应；步骤2向步骤I中所得的反应液中加入恒温扩增混合液，孵育反应后，热失活酶，终止反应；步骤3向步骤2中所得的反应液中加入硝酸银溶液与柠檬酸缓冲溶液，混匀后，离心取上清，然后加入硝酸银溶液和新鲜配制的硼氢化钠溶液，黑暗中反应后合成荧光纳米银簇；步骤4测定步骤3中所得的荧光纳米银簇溶液的荧光信号。所述步骤I中靶标microRNA来自于组织、血液或细胞的生物样本。所述步骤I中的孵育反应在37°C 55 °C和反应缓冲溶液中，步骤I中的DNA扩增模板反应液和靶标microRNA的体积比为0. I 10，反应时间为5 50分钟，所述的DNA扩增模板浓度为10 800nM ;所述的靶标microRNA浓度为IaM IOOnM ;所述的DNA扩增模板含有三种功能序列与靶标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列和合成荧光纳米簇的DNA互补序列，所述的反应缓冲溶液为25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸钠，5mM硝酸镁，0. 5mM 二硫苏糖醇和pH为6. O 8. 9。所述步骤2的孵育反应是在35°C 55°C和反应缓冲液中，步骤I所得的反应液和恒温扩增混合液体积比为0. I 10，反应20 200分钟，恒温扩增混合液中含有恒温聚合酶、nicking核酸内切酶、RNase抑制剂和dNTP ;所述的恒温聚合酶浓度为0. OlUy Γ1 I. OU μ L_\nicking核酸内切酶浓度为0. IU μ Γ1 I. OUy Λ RNase抑制剂浓度为0. IUμ Γ1 I. OU μ ΙΛ dNTP溶液浓度为80 500 μ M ;所述的反应缓冲液为IOmM硝酸钠、20mM硝酸铵、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸镁和 0. 1% Triton X-100 和 pH 为 6. O 8. 9。所述恒温聚合酶为商品化的VentR (610-)0嫩聚合酶411丨290嫩聚合酶或1(16110￥Fragment聚合酶。所述nicking 核酸内切酶为商品化的 Nt. CviPII、Nb. BbvCI> Nb. BtsI、Nt. BsmAI>Nt. BbvCI、Nt. BspQI、Nt. AlwI 或 Nt. BstNBI。
所述的标准工作曲线是由已知浓度的靶标microRNA的标准溶液，按照所述操作步骤反应后，测定反应体系中的荧光信号并计算荧光改变值，然后根据标准溶液中microRNA的浓度和体系中荧光改变值制作标准工作曲线。所述步骤3中硝酸银浓度为10 800 μ Μ，硼氢化钠溶液为新鲜配制，其浓度为10 10mM，反应温度为25°C 55°C，反应时间为20 120分钟。本发明的方法中DNA扩增模板中采用双nicking核酸内切酶酶切序列的设计，利用扩增得到的单链DNA序列与DNA扩增 模板再结合，充当引物作用，极大地提高了扩增效率。DNA扩增模板中合成荧光纳米簇的DNA互补序列的设计，实现了一种新型的荧光纳米探针的应用。与传统的荧光探针相比，荧光纳米探针具有优良的光学特性，如高荧光强度、抗光漂白性、发光颜色可调、激发波长和发射波长可调等。本发明的优点在于(I)灵敏度高DNA扩增模板中通过双microRNA结合序列(或双合成荧光纳米簇的DNA互补序列)和nicking核酸内切酶酶切序列的设计,使得扩增产物和祀标microRNA一样，能够与DNA扩增模板进行结合，启动恒温扩增反应，达到指数信号放大的作用，从而极大地提高了检测灵敏度。(2)选择性好基于靶标miRNA与DNA扩增模板的特异性碱基互补配对原则，使得其它分子的干扰影响很小。(3)背景信号低荧光纳米银簇的合成与DNA序列的碱基组成直接相关，只有碱基组成特异性的DNA序列才能合成稳定荧光信号的荧光纳米银簇。(4)多重检测利用不同碱基组成的DNA序列合成的纳米银簇探针光学特性的差异，针对不同的祀标microRNA,设计不同的DNA扩增模板,可以实现多重microRNA检测。(5)高通量检测采用96或384酶标板，可以实现同时制作标准工作曲线和待测样本的检测，减少检测误差。(6)操作过程简便快速整个检测过程简单。(7)无污染整个检测过程不需要用到有机溶剂或是有毒试剂。
图I利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测miR-141的分析方法的原
理示意图。图2工作曲线制备。(A)不同浓度miR-141反应溶液的荧光光谱；(B)不同浓度miR-141反应溶液的荧光改变值(F/Ffl)与miR-141浓度对数值的工作曲线。图3特异性实验。㈧不同靶标microRNA反应溶液的荧光光谱；⑶实验数据比较柱状图(f/fq-i)。图4利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测miR-21的分析方法的原
理示意图。图5利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测let_7a的分析方法的原理示意图。图6利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测miR-646的分析方法的原
理示意图。
图7利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针多重检测miR-141和miR-21的分析方法的原理示意图。符号说明附图I 中，miR-141 为 5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’，A 为靶标 miR-141 结合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’ )，X 为 Nt. B stNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3’ ) ,B为合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’-TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，T为扩增产生与miR-14一致的DNA序列(5’ -TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3’ )，R为合成荧光纳米银簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C 为 Nt. BstNBI 核酸内切酶,D 为VentR (exo-)DNA 聚合酶。附图2中，F为miR-141标准溶液在644nm处的荧光值，F0为空白样本(不含有miR-141)在644nm处的荧光值，(F/F0-l)表示miR-141标准溶液的荧光改变值。附图3中，F为靶标microRNA溶液在644nm处的荧光值，F0为空白样本(不含有microRNA)在644nm处的荧光值，(F/F0-l)表示microRNA溶液的荧光改变值。 附图4 中，miR-21 为 5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，A 为靶标 miR_21 结合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’)，X 为 Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3’)，B 为合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，T为扩增产生与miR-21一致的DNA序列(5，-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’ )，R为合成荧光纳米银簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C 为 Nt. BstNBI 核酸内切酶,D 为VentR (exo-)DNA 聚合酶。附图5 中，let-7a 为 5’ -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’，A 为靶标 let_7a 结合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’)，X 为 Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’)，B 为合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，T为扩增产生与let_7a一致的DNA序列(5’ -TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’ )，R为合成荧光纳米银簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C 为 Nb. BbvCI 核酸内切酶，D 为VentR (exo-)DNA 聚合酶。附图6 中，miR-646 为 5，-AAGCAGCUGCCUCUGAGGC-3’，A 为靶标 miR-646 结合序列(5，-GCCTCAGAGGCAGCTGCTT-3’)，X 为 Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’)，B 为合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’ )，T为扩增产生与miR-646一致的DNA序列(5’ -AAGCAGCTGCCTCTGAGGC-3’)，R/R’ 合成荧光纳米银簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C 为 Nb. BbvCI 核酸内切酶，D 为 phi29DNA 聚合酶。附图7 中，miR-141 为 5 ’ -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3 ’，miR_21序列为 5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，A 为靶标 miR-21 结合序列(5，-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’)，X 为 Nt. B stNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3’ )，E 为靶标 miR-141 结合序列(5’ -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’)，B 为合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，F为合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -ATCGGGGGCGA-3’)，T为扩增产生与miR-21 —致的 DNA 序列(5，-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’)，U 为扩增产生与 miR-141 — 致的DNA序列(5，-TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3，)，R为合成荧光纳米银簇的DNA序列(5，-ATCGCCCCCGAT-3’)，S 为合成荧光纳米银簇的 DNA 序列(5’ -CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C为Nt. BstNBI核酸内切酶，D为VentR (exo-)DNA聚合酶。
具体实施实例
通过下述实施例将有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容实施实例I :利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测miR-141 (5’ -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3，)的分析方法，检测原理如附图I所示。采用VentR (exo-) DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸内切酶。DNA扩增模板上的序列排布为靶标miR-141结合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3，)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3，)，miR-141结合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’ ) ,Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3’)，以及合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’端磷酸化。下面对miR-141检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。本发明中的室温是指进行实施操作的实验室温度23 28°C。具体操作步骤如下在4yL DNA扩增模板溶液(200nM)中加入I μ L靶标miR-141溶液，反应缓冲溶液为25mMTriS-HNO3，50mM硝酸钠，5mM硝酸镁，O. 5mM二硫苏糖醇，pH为7. 9。于88°C孵育10分钟后，然后加入恒温扩增混合液5 μ L，包括VentR (exo-) DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸内切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制剂(O. 8Uμ Γ1)和 dNTP (250 μ Μ)，反应缓冲液为 IOmM 硝酸钠、20mM 硝酸铵、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸镁和O. 1% Triton X-100，pH为8. 8。于53°C孵育反应50分钟，然后于90°C孵育5分钟终止反应。向上述反应液中加入8 μ L硝酸银溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L柠檬酸钠缓冲溶液(20mM，pH 7. O)，震荡混匀后，12，000转离心10分钟后取上清溶液，于黑暗中放置15分钟后，加入新鲜配制的I μ L硼氢化钠(3. 6mM)溶液,混匀，于黑暗中放置I小时，测定溶液的突光信号。工作曲线的制作分别准备已知浓度的miR-141标准溶液，浓度分别为laM，IOaM, IOOaM, IfM, IOfM, IOOfM, IpM, IOpM, IOOpM,和 InM,以及空白样本(不含有 miR-141,即miR-141浓度为0)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光光谱，如图2(A)所示。计算其荧光改变值(F/Ffl)，即miR-141标准溶液在644nm处的荧光值(F)与空白样本(不含有miR-141)在644nm处的荧光值(Ftl)的比值减1，然后根据miR-141标准溶液的浓度和其荧光改变值(F/Ffl)制作标准工作曲线，如图2(B)所示，miR-141标准溶液的浓度对数值与其荧光改变值(FAVl)在IaM InM范围内呈线性关系，线性方程为Y =
10.57+1. 251gX。图3所示为该本发明方法的特异性实验，选取miR-429，miR_200b，let_7d，miR-21作为miR-141对照样本(检测浓度为IpM)，以及空白样本(不含有miR-141，即miR-141 浓度为 0)，miR-429 序列为 5’ -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3’，miR-200b 序列为5’ -UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3’，let_7d 序列为 5’ -AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3’，miR_21序列为5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，如图3(A)为各个靶标反应液的荧光光谱，如图3(B)为各个靶标反应液的荧光改变值(F/Ffl)的柱状图，实验结果表明该方法特异性强。实施实例2 利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测miR-21 (5 ’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3，)的分析方法，检测原理如附图4所示。采用VentR (exo-) DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸内切酶。DNA扩增模板上的序列排布为靶标miR-21结合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3，)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3，)，miR-21结合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3’)，以及合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’端磷酸化。下面对miR-21检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。本发明中的室温是指进行实施操作的实验室温度23 28°C。具体操作步骤如下在4 μ LDNA扩增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶标miR-21溶液，反应缓冲溶液为25mMTris_HN03，50mM硝酸钠，5mM硝酸镁，O. 5mM 二硫苏糖醇，pH为7.9。于88°C孵育10分钟后，然后加入恒温扩增混合液5 μ L，包括VentR (exo-) DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸内切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制剂(O. 8Uμ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反应缓冲液为IOmM硝酸钠、20mM硝酸铵、20mMTris-HN03、2mM硝酸镁和0.1% Triton X-100，pH为8. 8。于53°C孵育反应50分钟，然后于90°C孵育5分钟终止反应。向上述反应液中加入8 μ L硝酸银溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L柠檬酸钠缓冲溶液(20mM, pH 7. O)，震荡混匀后，12，000转离心10分钟后取上清溶液，于黑暗中放置15分钟后，加入新鲜配制的I μ L硼氢化钠(3. 6mM)溶液，混匀，于黑暗中放置I小时，测定溶液的 突光信号。工作曲线的制作分别准备已知浓度的miR-21标准溶液和空白样本(不含有miR-21,即miR-21浓度为O)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光光谱，计算其荧光改变值(F/Ffl)，即miR-21标准溶液在644nm处的荧光值与空白样本在644nm处的荧光值的比值减I，然后根据miR-21标准溶液的浓度和其荧光改变值(F/Ffl)制作标准工作曲线。实施实例3 利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测I et_7a (5 ’ -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’ )的分析方法，检测原理如附图5所示。采用phi29DNA聚合酶和Nb. BbvCI核酸内切酶。DNA扩增模板上的序列排布为靶标let-7a结合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’ ) ,Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’ )，let_7a 结合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’)，Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’)，以及合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’端磷酸化。下面对let_7a检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。本发明中的室温是指进行实施操作的实验室温度23 28V。具体操作步骤如下在4μ L DNA扩增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶标let-7a溶液，反应缓冲溶液为25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸钠，5mM硝酸镁，O. 5mM 二硫苏糖醇，pH为7. 9。于88°C孵育10分钟后，然后加入恒温扩增混合液5 μ L，包括phi29DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nb. BbvCI 核酸内切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制剂(O. 8Uμ Γ1)和 dNTP (250 μ Μ)，反应缓冲液为 IOmM 硝酸钠、20mM 硝酸铵、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸镁和O. 1% Triton X-100，pH为8. 8。于37°C孵育反应50分钟，然后于90°C孵育5分钟终止反应。向上述反应液中加入8 μ L硝酸银溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L柠檬酸钠缓冲溶液(20mM，pH 7. O)，震荡混匀后，12，000转离心10分钟后取上清溶液，于黑暗中放置15分钟后，加入新鲜配制的I μ L硼氢化钠(3. 6mM)溶液,混匀，于黑暗中放置I小时，测定溶液的突光信号。工作曲线的制作分别准备已知浓度的let_7a标准溶液和空白样本(不含有let-7a,即let_7a浓度为0)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光光谱，计算其荧光改变值(F/Ffl)，即let-7a标准溶液在644nm处的荧光值与空白样本在644nm处的荧光值的比值减1，然后根据let-7a标准溶液的浓度和其荧光改变值(F/F^l)制作标准工作曲线。实施实例4 利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测miR-646 (5’-AAGCAGCUGC⑶⑶GAGGC-3’)的分析方法，检测原理如附图6所示。采用phi29DNA聚合酶和Nb. BbvCI核酸内切酶。DNA扩增模板上的序列排布为靶标miR-646结合序列(5’-GCCTCAGAGGCAGCTGCTT-3’)，Nb. BbvCI酶切序列(5’ -GCTGAGG-3’)，合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5，-GGGTGGGTGGGCGGGTT-3’ )，Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’ )，以及合成荧光纳米 银簇的DNA互补序列(5’ -GGGTGGGTGGGCGGGTT-3’)，3’端磷酸化。下面对miR-646检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。本发明中的室温是指进行实施操作的实验室温度23 28°C。具体操作步骤如下在4 μ LDNA扩增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶标miR-646溶液，反应缓冲溶液为25mMTris_HN03，50mM硝酸钠，5mM硝酸镁，
O.5mM 二硫苏糖醇，pH为7. 9。于88°C孵育10分钟后，然后加入恒温扩增混合液5 μ L，包括 phi29DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nb. BbvCI 核酸内切酶(O. 4U μ L-1) ,RNase 抑制剂(O. 8Uμ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反应缓冲液为IOmM硝酸钠、20mM硝酸铵、20mMTris-HN03、2mM硝酸镁和0.1% Triton X-100，pH为8. 8。于37°C孵育反应50分钟，然后于90°C孵育5分钟终止反应。向上述反应液中加入8 μ L硝酸银溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L柠檬酸钠缓冲溶液(20mM, pH 7. O)，震荡混匀后，12，000转离心10分钟后取上清溶液，于黑暗中放置15分钟后，加入新鲜配制的I μ L硼氢化钠(3. 6mM)溶液，混匀，于黑暗中放置I小时，测定溶液的突光信号。工作曲线的制作分别准备已知浓度的miR-646标准溶液和空白样本(不含有miR-646,即miR-646浓度为O)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光光谱，计算其荧光改变值(F/Ffl)，即miR-646标准溶液在644nm处的荧光值与空白样本在644nm处的荧光值的比值减I，然后根据miR-646标准溶液的浓度和其荧光改变值(F/F^l)制作标准工作曲线。实施实例5 利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针多重检测miR-141 (5’ -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’ )和 miR-21 (5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ )的分析方法，检测原理如附图7所示。采用VentR (exo-)DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸内切酶。DNA扩增模板I上的序列排布为靶标 miR-141 结合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’ )，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3，)，miR-141 结合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’ )，Nt. BstNBI酶切序列(5，-TCTTGACTC-3’)，以及合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’端磷酸化。DNA扩增模板2上的序列排布为革巴标 miR-21 结合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3’)，miR-21 结合序列(5’ -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’)，Nt. B stNBI酶切序列(5’ -ACGTGACTC-3’)，以及合成荧光纳米银簇的DNA互补序列(5，-TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’ 端磷酸化。下面对miR-141、miR-21检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。本发明中的室温是指进行实施操作的实验室温度23 28°C。具体操作步骤如下在4 μ LDNA扩增模板I和DNA扩增模板2的混合溶液(各200ηΜ)中加入I μ L靶标miR-141或者miR-21或者二者的混合溶液，反应缓冲溶液为25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸钠，5mM硝酸镁，O. 5mM 二硫苏糖醇，pH为7. 9。于88°C孵育10分钟后，然后加入恒温扩增混合液5 μ L,包括VentR (exo-)DNA聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸内切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制剂(O. 8U μ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反应缓冲液为IOmM硝酸钠、20mM硝酸铵、20mMTriS-HNO3、2mM硝酸镁和 O.1% Triton X-100，pH为8. 8。于53°C孵育反应50分钟，然后于90°C孵育5分钟终止反应。上述反应液中加入8 μ L硝酸银溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L柠檬酸钠缓冲溶液(20mM，pH 7. O)，震荡混匀后，12，000转离心10分钟后取上清溶液，于黑暗中放置15分钟后，加入新鲜配制的I μ L硼氢化钠(3. 6mM)溶液,混匀，于黑暗中放置I小时，测定溶液的荧光信号。工作曲线的制作分别准备已知浓度的miR-141和miR-21标准溶液和空白样本(不含有miR-141和miR-21)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光光谱，计算其荧光改变值(F/Ffl)，即miR-141标准溶液在其特征性发射峰644nm处的荧光值与空白样本在644nm处的荧光值的比值减1，miR-21标准溶液在其特征性发射峰625nm处的荧光值与空白样本在625nm处的荧光值的比值减I，然后根据miR-141和miR-21标准溶液的浓度和其荧光改变值(F/Ffl)分别制作标准工作曲线。
权利要求
1.一种利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针检测HiiCT0RNA的分析方法，其特征在于，利用IESmicroRNA与DNA扩增模板结合后,诱导恒温扩增反应和nicking核酸内切酶特异性的酶切反应得到大量单链DNA产物，该单链DNA产物与加入的硝酸银溶液在硼氢化钠还原作用下制备荧光纳米银簇探针，测定反应体系中的荧光信号并计算荧光信号改变值，与标准工作曲线比对，推算出祀标microRNA的浓度。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述荧光纳米银簇探针粒径为I 10nm，激发波长为500 680nm，发射波长为510 900nm。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的靶标microRNA检测包括以下操作步骤 步骤I将靶标microRNA加入到DNA扩增模板溶液中，进行孵育反应； 步骤2向步骤I中所得的反应液中加入恒温扩增混合液，孵育反应后，热失活酶，终止反应; 步骤3向步骤2中所得的反应液中加入硝酸银溶液，混匀后，离心取上清，然后加入硝酸银溶液和新鲜配制的硼氢化钠溶液，在黑暗中反应合成荧光纳米银簇； 步骤4测定步骤3中所得的荧光纳米银簇溶液的荧光信号。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤I中靶标microRNA来自于组织、血液或细胞的生物样本。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤I中的孵育反应在37°C 55°C和反应缓冲溶液中，步骤I中的DNA扩增模板反应液和靶标microRNA的体积比为O. I 10，反应时间为5 50分钟，所述的DNA扩增模板浓度为10 800nM ;所述的靶标microRNA浓度为IaM IOOnM ;所述的DNA扩增模板和靶标microRNA所述的DNA扩增模板含有三种功能序列与靶标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列和合成荧光纳米簇的DNA互补序列，所述的反应缓冲溶液为25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸钠，5mM硝酸镁，0. 5mM 二硫苏糖醇和pH为6. O 8. 9。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2的孵育反应是在35°C 55°C和反应缓冲液中，步骤I所得的反应液和恒温扩增混合液体积比为0. I 10，反应20 200分钟，恒温扩增混合液中含有恒温聚合酶、nicking核酸内切酶、RNase抑制剂和dNTP ;所述的恒温聚合酶浓度为Ο.Ο υμΙ^-Ι.Ου μ L'nicking核酸内切酶浓度为0. IU μ L—1 I. OUμ ΙΛ RNase抑制剂浓度为0. IU μ Γ1 I. OU μ Λ dNTP溶液浓度为80 500 μ M ;所述的反应缓冲液为IOmM硝酸钠、20mM硝酸铵、20mM 1^8-順03、21111硝酸镁和0. I % TritonX-IOO和pH为6. O 8. 9。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述恒温聚合酶为商品化的VentR (exo-)DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶或Klenow Fragment聚合酶。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述nicking核酸内切酶为商品化的Nt. CviPII、Nb. BbvCI、Nb. BtsI、Nt. BsmAI、Nt. BbvCI、Nt. BspQI、Nt. AlwI 或 Nt. BstNBI。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3中硝酸银浓度为10 800μ Μ，硼氢化钠溶液为新鲜配制，其浓度为10μΜ IOmM,反应温度为25°C 55°C,反应时间为20 120分钟。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的标准工作曲线，是由已知浓度的靶标microRNA的标准溶液，按照所述操作步骤反应后，测定反应体系中的荧光信号并计算荧光改变值，然后根据标准 溶液中microRNA的浓度和体系中荧光改变值制作标准工作曲线。
全文摘要
本发明提供一种利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测microRNA的分析方法。该方法是，设计一条含有三种功能序列的DNA扩增模板与靶标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列和合成荧光纳米簇的DNA互补序列。当靶标microRNA与DNA扩增模板结合后，诱导恒温扩增反应和nicking核酸内切酶特异性的酶切反应，得到大量单链DNA产物，其中合成荧光纳米银簇的DNA序列与硝酸银溶液在硼氢化钠的还原作用下制备荧光纳米银簇探针，测定反应体系的荧光信号并计算荧光改变值，与标准工作曲线比对，推算出靶标microRNA的浓度。该方法具有灵敏度高、特异性强、线性检测范围宽、背景信号低、操作简单等特点，可广泛应用于组织，血液或细胞的生物样本中microRNA检测。
文档编号C12Q1/68GK102719526SQ20121010745
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者刘玉强, 叶邦策, 尹斌成 申请人:华东理工大学