专利名称：微生物发酵生产低温果胶酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温果胶酶微生物发酵生产方法。该发明生产的低温果胶酶主要应用于食品加工、饲料、造纸与纺织、以及其它果胶酶应用行业。可以显著提高生产率、降低成本、缩短生产周期，改善并提高产品质量。
背景技术：
果胶酶(pectinases)是指能协同分解果胶的一组酶的总称。主要包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)和果胶酯酶(PE)等(裘纪莹，中国食品添加剂，2009)。果 胶酶作为生物酶制剂，已经广泛应用于食品工业、饲料工业、造纸业和纺织工业中，但目前使用的微生物发酵生产的果胶酶主要为中温果胶酶。虽然国内对果微生物发酵生产的果胶酶的研究有30多年，但主要是研究中温果胶酶；有关微生物发酵生产的低温果胶酶的研究是起步阶段，主要是菌种选育和发酵条件优化、生长特性和酶学性质、酶的分离纯化以及工程菌构建(陈姗姗，广西农业生物科学，2007 ;李祖明，工业微生物，2008 ;姜晓雷，中国酿造，2009)。我国微生物发酵生产的低温果胶酶产业化、规模化生产及应用还未见报道。微生物发酵生产的低温果胶酶与高温、中温果胶酶相比具有很大的应用优势，因为低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质(王伟，食品工业科技，2011)，这将有助于微生物发酵生产的低温果胶酶的推广和使用。微生物发酵生产的低温果胶酶的应用将对传统的农业、食品、医药、化工、能源和环保等领域产生深远的影响。近年来，随着我国国家政策和产业结构的调整，果汁和果酒行业得到迅猛发展。农产品加工业“十一五”发展规划指出在加工布局上，原料主产区建立浓缩加工厂，发展浓缩果蔬汁、果蔬浆等半成品；辽宁、山东、陕西等地发展浓缩苹果汁，果胶酶作为果汁加工的重要酶制剂，市场需求量巨大。微生物发酵生产的低温果胶酶将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如资源、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。微生物发酵生产的低温果胶酶具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温果胶酶的方法，该方法主要微生物经过低温驯化后，在10 16°C液体发酵生产低温果胶酶的方法，这种生产方法获得的低温果胶酶粗酶液活性可以达到200U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。在饲料中添加500mg/kg果胶酶制剂，能防止果胶类物质引起的雏鸡生产性能下降，并降低肝脂肪和血清胆固醇的质量浓度，显著提高21日龄肉鸡的平均日增质量和采食量，并提高饲料的转化率，降低了生产成本，改善并提高产品质量。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。本发明所述的一种微生物发酵生产低温果胶酶的方法具体包括以下步骤
(I)将产生果胶酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的果胶酶产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养72 144h时，即微生物发酵生产低温果胶酶结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。果胶酶产生菌(例如，CGMCC菌种编号1. 229)，菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温果胶酶，低温驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在零下80°C条件下可以长期保藏。
具体实施例方式实施例一(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水
I.0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基蛋白胨8.0 12. 0g，牛肉膏3.0 7. 0g，果胶2.0 6. 0g, NaCl 5. 0 15. Og,琼脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基牛肉膏2.0 5. 0g，蛋白胨7.0 12. 0g，NaCl 3. 0 6. 0g，自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基蛋白胨6. 0 9. Og,酵母膏2. 0 4. Og,果胶2. 0 8. Og,NaCl 2. 0 10. 0g，MgSO4 7H20 I. 6 2. 2g，自来水 I. 0L，pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌20mino(2)将产生果胶酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的果胶酶产生菌在10 16°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3 5%的接种量接入10L的产酶培养基中，在10 12°C培养120 144h时，即微生物发酵生产低温果胶酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温果胶酶制剂。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基蛋白胨8.0 12. 0g，牛肉膏3.0 7. 0g，果胶2. 0 6. 0g, NaCl 5. 0 15. Og,琼脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基牛肉膏2. 0 5. 0g，蛋白胨7. 0 12. 0g, NaCl 3. 0 6. Og,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基蛋白胨6. 0 9. Og,酵母膏2. 0 4. Og,果胶2. 0 8. Og, NaCl 2. 0 10. 0g，MgSO4 7H20 I. 6 2. 2g，自来水 I. 0L，pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌20mino(2)将产生果胶酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的果胶酶产生菌在10 16°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5 7%的接种量接入50L的产酶培养基中，在12 14°C培养96 120h时，即微生物发酵生产低温果胶酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温果胶酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基蛋白胨8.0 12. 0g，牛肉膏3.0 7. 0g，果胶2. 0
6.0g, NaCl 5. 0 15. Og,琼脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基牛肉膏2. 0 5. 0g，蛋白胨7. 0 12. 0g, NaCl 3. 0 6. Og,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基蛋白胨6. 0 9. Og,酵母膏2. 0 4. Og,果胶2. 0 8. Og,NaCl 2. 0 10. 0g，MgSO4 7H20 I. 6 2. 2g，自来水 I. 0L，pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌20mino(2)将产生果胶酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的果胶酶产生菌在10 16°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7 9%的接种量接入100L的产酶培养基中，在14 16°C培养72 96h时，即微生物发酵生产低温果胶酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液； (7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温果胶酶制剂。
权利要求
1.一种微生物发酵生产低温果胶酶的方法，其包括以下步骤 (1)将产生果胶酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好； (2)按常规方法将低温驯化后的果胶酶产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子； (3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养72 144h时，即微生物发酵生产低温果胶酶结束； (4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液； (5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求I所述的方法，在步骤(5)之后进一步包括将步骤(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、发酵产酶培养基分别为 (1)菌种低温驯化培养基蛋白胨8.0 12.0g，牛肉膏3.0 7. 0g，果胶2.0 6. Og,NaCl 5. 0 15. Og,琼脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。
(2)液体种子培养基牛肉膏2.0 5.0g，蛋白胨7.0 12. 0g，NaCl 3. 0 6. 0g，自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。
(3)发酵产酶培养基蛋白胨6.0 9. 0g，酵母膏2. 0 4. Og,果胶2. 0 8. 0g, NaCl.2.0 10. 0g，MgSO4WH2O 1.6 2.2g，自来水 I. 0L，pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌 20min。
全文摘要
本发明所述的一种微生物发酵生产低温果胶酶的方法是将产生果胶酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的果胶酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温果胶酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
文档编号C12N9/26GK102653744SQ20121010957
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者于爽, 张庆芳, 王春雨, 王晓辉, 窦少华, 迟乃玉 申请人:大连大学