专利名称：一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，特别是指一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法。
背景技术：
树突状细胞(dendritic cell ；DC)是存在于外周血、皮肤、淋巴器官及胸腺中的抗原递呈细胞(APC)之一，富集于淋巴组织及非淋巴组织中。树突状细胞具有强大的抗原递呈能力，可将抗原肽表达到树突状细胞的I类和II类上，并分别激活CD4、CD8T细胞，由此诱导活体内对特定抗原(病原微生物抗原、肿瘤抗原、移植抗原等)的免疫应答。DC的强 大免疫诱导功能非常适用于多种肿瘤的免疫疗法(DC治疗)。以往的报告表明，在小鼠试验中，用仙台病毒(SeV)刺激的DC具有较强的抗肿瘤效果(S. Shibata et al.，J. Immunol,2006177 :3564_3576 ；Yoneyama, Y. et al.，Biochem.Biophys. Res. Commun.，2007，355 129- 135)。而抗肿瘤疗效颇受DC按种量的影响。临床试验也认为接种的DC量很大程度影响到治疗效果，但出于患者状态的原囱，可提取的DC前提细胞(Dcprogenitors)数量大多极为有限，不能获取足够数量的DC，因而无法达到理想的治疗效果。所以，如何高效率地扩增有限的DC前体细胞，是解决问题的关键。
发明内容
本发明提出一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，解决了现有技术中无法高效率地扩增有限的树突状细胞的问题。本发明的技术方案是这样实现的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，包括如下步骤使用羟乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓树突状细胞分离液；使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶；使用L-脯氨酸、胰岛素、维生素C、L_谷氨酰胺、人脐带血浆、重组人纤维母细胞生长因子和DMEM/F12基础培养基配制人血及骨髓树突状细胞培养液；分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞。进一步地，使用羟乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓树突状细胞分离液的具体步骤为称取羟乙基淀粉加热溶解于蒸馏水中，以双蒸水定容，制成质量分数为40%的羟乙基淀粉550料液，备用；称取泛影葡胺溶于双蒸水中，用氢氧化钠溶液调整pH至pH = 7. 5 pH = 8. 0，制成质量分数为60%的泛影葡胺料液，备用；取质量分数为60 %的泛影葡胺料液，加入蒸馏水制成质量分数为34%的泛影葡胺溶液，取质量分数为40%的羟乙基淀粉550料液加入蒸馏水制成质量分数为9 %的羟乙基淀粉550溶液，将质量分数为34%的泛影葡胺溶液和质量分数为9%的羟乙基淀粉550溶液混和均匀并将其降温至20°C ；用质量分数为60%的泛影葡胺料液调整质量分数为34%的泛影葡胺溶液和质量分数为9%的羟乙基淀粉550溶液的混合液，使其在20°C下比重为I. 065-1. 077g/ml,即为人血及骨髓树突状细胞分离液粗制品；用G3漏斗、含IOOnm亲水性滤芯的亲水性微孔滤器装置以及隔膜真空泵以(O. 06MPa的负压过滤人血及骨髓树突状细胞分离液粗制品，将滤液于百级工作台内灌装于棕色玻璃瓶中，120°C 高压灭菌20分钟，即为人血及骨髓树突状细胞分离液成品；常温避光保存。优选地，羟乙基淀粉的平均分子量为550万。优选地，氢氧化钠溶液的质量分数为10%。进一步地，使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶的具体步骤为称取碳酸钠、碳酸氢钠于烧杯中并加双蒸水溶解，制成O. 05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，备用；称取CD123抗体，加制成的O. 05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，制成浓度为10 μ g/ml的CD 123抗体包被液；向人血及骨髓树突状细胞培养瓶中加入浓度为10 μ g/ml的⑶123抗体包被液，于37°C温箱中包被处理4小时，制成人血及骨髓树突状细胞培养瓶。优选地，人血及骨髓树突状细胞培养瓶为聚苯乙烯培养瓶。进一步地，使用L-脯氨酸、胰岛素、维生素C、L-谷氨酰胺、人脐带血浆、重组人纤维母细胞生长因子和DMEM/F12基础培养基配制人血及骨髓树突状细胞培养液的具体步骤为用DMEM/F12基础培养基将500mg L-脯氨酸、200mg胰岛素、50mg维生素C、IOOmg L-谷氨酰胺、体积百分比为10-20%的人脐带血浆和2yg重组人纤维母细胞生长因子定容至IL0进一步地，分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞的具体步骤为向玻璃离心管中加入2ml人血及骨髓树突状细胞分离液，取人外周血、骨髓或脐带血2ml叠加于人血及骨髓树突状细胞分离液之液面上，形成上下两层液体；用水平转子医用离心机以离心力400g离心20分钟，使所述上下两层液体之间出现一层白色环状细胞层，吸取白色环状细胞层加于人血及骨髓树突状细胞培养瓶中，于37°C温箱中静置反应1-2小时；反应完成后，弃去悬浮的细胞，加入人血及骨髓树突状细胞培养液，置于CO2培养箱中进行培养至显微镜下观察细胞铺满瓶底。优选地，使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶以及分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞均在20 V无菌净化环境下进行。本发明的有益效果为I、本人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法可有效制备大量人血及骨髓树突状细胞，且本人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法分为四部分，与现有方法相比，操作过程简单明了，同时也缩短了操作时间。2、本人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法中配制的人血及骨髓树突状细胞分离液，其pH为pH = 7. 5 pH = 8. O、比重为I. 065g/ml、内毒素水平< O. 5EU/ml、无菌及不溶性颗粒物为每50ml溶液中含10 μ m以上的不溶性微粒20粒以下、含25 μ m以上的不溶性微粒5粒以下。3、本人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法中制备的人血及骨髓树突状细胞培养瓶为聚苯乙烯材质，在碱性条件下，CD123抗体(即白细胞介素3受体a/IL-3Ra)的蛋白可与聚苯乙烯产生特异性吸附，在37°C温箱中包被处理4小时，所得人血及骨髓树突状细胞培养瓶可与人血及骨髓树突状细胞特异性结合。4、本人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法中配制的人血及骨髓树突状细胞培养液，无动物源性血清及蛋白，高安全性、无细胞毒性、低热原(内毒素 < O. 5EU/ml)、无菌、无支原体、无病毒，人血及骨髓树突状细胞培养液在现行的GMP(GoodManufacture Practice,即《药品生产质量管理规范》)标准下生产,所培养的人血及骨髓树突状细胞具有高细胞活性。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图I为本发明一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法的步骤流程图。
具体实施例方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如图I所示，一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，包括如下步骤I、使用羟乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓树突状细胞分离液，该步骤具体为I. I、称取40g羟乙基淀粉加热溶解于蒸馏水中，以双蒸水定容至100ml，制成质量分数为40%的羟乙基淀粉550料液，备用；I. 2、称取60g泛影葡胺溶于双蒸水中，用氢氧化钠溶液调整pH，用pH计测定pH，将pH调整至pH = 7. 5 pH = 8. 0，制成质量分数为60%的泛影葡胺料液，备用；I. 3、取80ml质量分数为60 %的泛影葡胺料液，加入61. 16ml蒸馏水制成质量分数为34%的泛影葡胺溶液，取76. 8ml质量分数为40%的羟乙基淀粉550料液加入261. 96ml蒸馏水制成质量分数为9%的羟乙基淀粉550溶液，将质量分数为34%的泛影葡胺溶液和质量分数为9%的羟乙基淀粉550溶液混和均匀并将其降温至20°C ；I. 4、用质量分数为60%的泛影葡胺料液调整质量分数为34%的泛影葡胺溶液和质量分数为9%的羟乙基淀粉550溶液的混合液，加入质量分数为60%的泛影葡胺料液过程中使用比重计在20°C下监测比重,使该混合液比重为I. 065-1. 077g/ml,即为人血及骨髓树突状细胞分离液粗制品；I. 5、用G3漏斗、含IOOnm亲水性滤芯的亲水性微孔滤器装置以及隔膜真空泵以(O. 06MPa的负压过滤人血及骨髓树突状细胞分离液粗制品，将滤液于百级工作台内灌装于250ml规格的棕色玻璃瓶中，每瓶内滤液为200mml，然后120°C高压灭菌20分钟，即为人血及骨髓树突状细胞分离液成品；1.6、常温避光保存。其中，优先选择平均分子量为550万的羟乙基淀粉，氢氧化钠溶液的质量分数优先选择为10%。。2、使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶，该步骤具体为2. I、称取O. 15g碳酸钠、O. 29g碳酸氢钠于烧杯中并加双蒸水溶解定容至100ml,此时溶液PH经pH计测定为PH = 9. 3，即为O. 05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，备用；2. 2、称取Img CD123抗体，加制成的O. 05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液100ml，即为浓度为 ο μ g/ml的⑶123抗体包被液；2. 3、向人血及骨髓树突状细胞培养瓶中加入浓度为10 μ g/ml的⑶123抗体包被液，于37°C温箱中包被处理4小时，制成人血及骨髓树突状细胞培养瓶。其中，人血及骨髓树突状细胞培养瓶为聚苯乙烯培养瓶，因为在碱性条件下CD123抗体的蛋白可与聚苯乙烯产生特异性吸附，所以所得培养瓶可与树突状细胞特异性结合。3、使用L-脯氨酸、胰岛素、维生素C、L_谷氨酰胺、人脐带血浆、重组人纤维母细胞生长因子和DMEM/F12基础培养基配制人血及骨髓树突状细胞培养液，该步骤具体为用DMEM/F12基础培养基将500mg L-脯氨酸、200mg胰岛素、50mg维生素C、IOOmgL-谷氨酰胺、体积百分比为10-20%的人脐带血浆和2μ g重组人纤维母细胞生长因子定容至IL04、分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞,该步骤具体为4. I、向IOml玻璃离心管中加入2ml人血及骨髓树突状细胞分离液，取人外周血、骨髓或脐带血2ml叠加于人血及骨髓树突状细胞分离液之液面上，形成明显可见清晰的上下两层液体；4. 2、用水平转子医用离心机以离心力400g(约为1500转)离心20分钟，使所述上下两层液体之间出现一层白色环状细胞层(此细胞层中含有树突状细胞、T细胞及B细胞)，吸取白色环状细胞层加于人血及骨髓树突状细胞培养瓶中，于37°C温箱中静置反应1-2小时；4. 3、反应完成后，弃去悬浮的细胞，加入人血及骨髓树突状细胞培养液，置于CO2培养箱中进行培养至显微镜下观察细胞铺满瓶底，此时提纯培养的树突状细胞即为样品中90%以上的树突状细胞。
本发明所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶步骤以及分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞步骤均在20°C无菌净化环境下进行。
本发明所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其原理为I、利用密度为I. 065g/ml的人血及骨髓树突状细胞分离液分离出包括人血及骨髓树突状细胞在内的密度为1.065g/ml的细胞群(含T、B细胞及人血及骨髓树突状细胞)后，再利用特殊处理的人血及骨髓树突状细胞培养瓶(包被了人血及骨髓树突状细胞特殊抗体CD123)与人血及骨髓树突状细胞、干细胞、粒细胞及红细胞发生特异性抗原抗体反应，这样利用人血及骨髓树突状细胞分离液分离得到了 T、B细胞及人血及骨髓树突状细胞，再利用CD123的特异性抗原抗体反应去除T、B细胞，加入人血及骨髓树突状细胞培养液 培养后既得纯度高的人血及骨髓树突状细胞。2、体积、形态和密度不同，其中人血及骨髓树突状细胞密度为1.065g/ml，使用人血及骨髓树突状细胞分离液经过密度梯度离心使人外周血中各细胞按相应密度梯度分布，从而使人血及骨髓树突状细胞得以分离。3、人血及骨髓树突状细胞培养瓶经⑶123抗体包被可与人血及骨髓树突状细胞产生特异性抗原抗体反应，经37°C静置反应1-2小时后可获得单一人血及骨髓树突状细胞，加入人血及骨髓树突状细胞培养液经细胞培养即可获得高细胞活性及高细胞纯度的人血及骨髓树突状细胞。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，包括如下步骤 使用羟乙基淀粉和泛影葡胺使用羟乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓树突状细胞分离液； 使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶； 使用L-脯氨酸、胰岛素、维生素C、L-谷氨酰胺、人脐带血浆、重组人纤维母细胞生长因子和DMEM/F12基础培养基配制人血及骨髓树突状细胞培养液； 分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞。
2.根据权利要求I所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，使用羟乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓树突状细胞分离液的具体步骤为 称取羟乙基淀粉加热溶解于蒸馏水中，以双蒸水定容，制成质量分数为40%的羟乙基淀粉550料液，备用； 称取泛影葡胺溶于双蒸水中，用氢氧化钠溶液调整pH至pH = 7. 5 pH = 8. 0，制成质量分数为60 %的泛影葡胺料液，备用； 取质量分数为60 %的泛影葡胺料液，加入蒸馏水制成质量分数为34%的泛影葡胺溶液，取质量分数为40%的羟乙基淀粉550料液加入蒸馏水制成质量分数为9%的羟乙基淀粉550溶液，将质量分数为34%的泛影葡胺溶液和质量分数为9 %的羟乙基淀粉550溶液混和均匀并将其降温至20°C ； 用质量分数为60 %的泛影葡胺料液调整质量分数为34%的泛影葡胺溶液和质量分数为9%的羟乙基淀粉550溶液的混合液，使其在20°C下比重为I. 065-1. 077g/ml,即为人血及骨髓树突状细胞分离液粗制品； 用G3漏斗、含IOOnm亲水性滤芯的亲水性微孔滤器装置以及隔膜真空泵以彡O. 06MPa的负压过滤人血及骨髓树突状细胞分离液粗制品，将滤液于百级工作台内灌装于棕色玻璃瓶中，120°C高压灭菌20分钟，即为人血及骨髓树突状细胞分离液成品； 常温避光保存。
3.根据权利要求2所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，羟乙基淀粉的平均分子量为550万。
4.根据权利要求3所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，氢氧化钠溶液的质量分数为10%。
5.根据权利要求2所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶的具体步骤为 称取碳酸钠、碳酸氢钠于烧杯中并加双蒸水溶解，制成O. 05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，备用； 称取⑶123抗体，加制成的O. 05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，制成浓度为10 μ g/ml的⑶123抗体包被液； 向人血及骨髓树突状细胞培养瓶中加入浓度为10 μ g/ml的⑶123抗体包被液，于37°C温箱中包被处理4小时，制成人血及骨髓树突状细胞培养瓶。
6.根据权利要求5所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，人血及骨髓树突状细胞培养瓶为聚苯乙烯培养瓶。
7.根据权利要求6所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，使用L-脯氨酸、胰岛素、维生素C、L-谷氨酰胺、人脐带血浆、重组人纤维母细胞生长因子和DMEM/F12基础培养基配制人血及骨髓树突状细胞培养液的具体步骤为用DMEM/F12基础培养基将500mgL-脯氨酸、200mg胰岛素、50mg维生素C、IOOmgL-谷氨酰胺、体积百分比为10-20%的人脐带血浆和2μ g重组人纤维母细胞生长因子定容至1L。
8.根据权利要求7所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞的具体步骤为 向玻璃离心管中加入2ml人血及骨髓树突状细胞分离液，取人外周血、骨髓或脐带血 .2ml叠加于人血及骨髓树突状细胞分离液之液面上，形成上下两层液体； 用水平转子医用离心机以离心力400g离心20分钟，使所述上下两层液体之间出现一层白色环状细胞层，吸取白色环状细胞层加于人血及骨髓树突状细胞培养瓶中，于37°C温箱中静置反应1-2小时； 反应完成后，弃去悬浮的细胞，加入人血及骨髓树突状细胞培养液，置于CO2培养箱中进行培养至显微镜下观察细胞铺满瓶底。
9.根据权利要求8所述的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，其特征在于，使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶以及分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞均在20°C无菌净化环境下进行。
全文摘要
本发明提出了一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，包括如下步骤使用羟乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓树突状细胞分离液；使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶；使用L-脯氨酸、胰岛素、维生素C、L-谷氨酰胺、人脐带血浆、重组人纤维母细胞生长因子和DMEM/F12基础培养基配制人血及骨髓树突状细胞培养液；分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞。本发明的一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法可有效制备大量人血及骨髓树突状细胞，且本人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法分为四部分，与现有方法相比，操作过程简单明了，同时也缩短了操作时间。
文档编号C12N5/0784GK102643782SQ201210114089
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者高旭 申请人:高旭