专利名称：一种葡萄籽原花青素的制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种葡萄籽原花青素的制备方法，具体涉及ー种采用两株真菌发酵葡萄籽浆后提取原花青素的方法，属生物工程领域。
(ニ)
背景技术：
近年来，多酚类物质的生物活性及对人体的保健防病作用日益受到广泛关注。自由基被认为是人体衰老和某些慢性疾病发生的原因之一。当人体内的自由基产生过多或清除过慢，就会转而攻击各种细胞，器官并使之受到损伤，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。多酚类化合物分子结构中含有若干个酚羟基，对自由基有较强的清除能力，从而起到对生物组织的保护作用。原花青素是广泛存在于植物中的ー类天然多酚类化合物，具有水溶、无毒、无过敏、安全性好等特性，是ー种天然的自由基清除剂和抗氧化剂，而且还有抗衰老，抗肿瘤，抗癌变，预防心脑血管疾病，预防动脉粥样硬化等功能。葡萄籽作为原花青素的重要来源之一，在国外已得到很好的利用.我国葡萄年产量约有200万吨，约有10%用于酿酒和加工果汁，其下角料葡萄籽约占鲜果总量的4% — 5%，这些葡萄废弃物利用率很低，大部分作为饲料、烧材或被丢弃，不仅造成环境污染，对资源也是ー种浪费。因此，研究和解决葡萄籽利用问题，可以变废为宝，防止环境污染，具有很好的社会效益和经济效益。葡萄籽提取物原花青素是从葡萄籽中提取出的生物类黄酮，具有抗氧化活性，广泛应用于食品、药品、化妆品等领域，其销售额近年来一直位于美国膳食补充剂的前十名。目前国内外关于葡萄籽花青素的提取方法主要有溶剂萃取法、微波法和超临界CO2萃取法等，这些方法得到的产品得率和纯度较低，主要原因在于原花青素在葡萄籽中与高分子纤维素和半纤维素形成致密的结合体，难以在溶剂或者微波状态下打开，直接导致提取效率较低。本发明采用两株真菌复合发酵葡萄籽浆，将原花青素在葡萄籽中与高分子纤维素和半纤维素形成的致密结合体充分水解而使原花青素释放出来，大大提高了原花青素的得率和纯度。
发明内容
本发明目的在于提供ー种葡萄籽原花青素的制备方法。本发明的目的是这样实现的本发明中所涉及的百分比除另有注明之外为质量比，本发明的产品采用这样的方法来制备的
I.发酵菌株的选择及培养基的制备
发酵菌株采购于中国エ业微生物菌种保藏管理中心，分别如下
A菌-像今木霉，Trichoderma koningii编号为CICC40505,培养基为取去皮的马
铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。B菌——黑曲霉，Asperぬ7ΛΛ5 niger,编号为CICC41130，培养基为鹿糖30克，硝酸钠2克，硫酸镁O. 5克，氯化钾O. 5克，硫酸亚铁O. 01克，磷酸氢ニ钾I克，蒸馏水1000毫升，15磅灭菌30分钟。
2.直投式发酵剂的制备过程
2.I冻干菌粉末的活化
分别量取O. 9%的生理盐水IOml于2只试管内，经121°C灭菌20分钟冷却至30°C，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入O. 9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在30°C恒温箱中静止活化30分钟，备用。
2. 2扩大培养
2.2. I母发酵剂的制备
分别量取2株菌培养基各200ml于2只500ml三角瓶内，121 °C灭菌20分钟冷却至300C，按培养基体积的10%接种2. I步骤中已经活化的菌种，在30°C、150转/分钟，摇床培养24小时，作为母发酵剂。2. 2. 2生产发酵剂的制备
首先配置10%的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入5%的液态甘油、2%低聚木糖、2%蔗糖，121 °C灭菌20分钟冷却至30°C，分别按5%体积比例接种母发酵剂，在30°C、150转/分钟，摇床培养30— 36小时，检测2株菌生产发酵剂活菌数，各生产发酵剂活菌数> IO9个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数< IO9个/ml，继续培养，直至达到IO9个/ml。2. 3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度O. 8 — lcm，加盖瓶塞后放入_30°C冰柜速冻,冻结后将玻璃安瓶用托盘盛装,放入冻干机进行冷冻干燥。2. 4直投式发酵剂的复配
按冻干菌粉末重量，取A菌粉末2-4份，B菌粉末3-5份，充分混匀后制成直投式发酵齐U，用于发酵葡萄籽浆，直投式发酵剂的添加量为葡萄籽浆中固形物重量的O. 125%。需要进ー步说明的是本发明中选用的菌种购于中国エ业微生物菌种保藏管理中心，这些菌的活化、冻干方法不仅仅限于本发明所述的具体方法，培养基的成分也不限于此，其它常规技术和方法都是可以的，只要可以提高菌种的活力、并将其制备成冻干粉状而方便使用即可。3.葡萄籽原花青素的制备
3.I原料粉浆
选择无虫害、无病害、未发热霉变、水分含量5%以下的葡萄籽，按葡萄籽重量的3倍添加去离子水，然后进入胶体磨，循环磨浆制成葡萄籽浆。3. 2 配料
按葡萄籽浆重量的1%添加葡萄糖粉，充分搅拌，溶解葡萄糖，制成加糖葡萄籽浆。3. 3高温灭菌
将加糖葡萄籽浆加热至121°C灭菌20分钟，然后冷却至30°C。3. 4接菌发酵
按加糖葡萄籽浆中固形物重量的O. 125%接种2. 4步骤制备的直投式发酵剂，30°C、150转/分钟，摇床培养48小吋。3. 5离心除渣
用管式离心机15000转/分钟离心去除发酵葡萄籽浆中的不溶性物质。3. 6超滤提取用截留分子量为5000 Da的超滤膜过滤，取滤过液，再用截留分子量为150 Da的超滤膜过滤，弃滤过液，取150 Da超滤膜截留的液体。3. 7 干燥
将经过3. 6步骤处理后获得的150 Da超滤膜截留的液体进行喷雾干燥，获得葡萄籽原花青素，即为成品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述
实施例一
1.发酵菌株的选择及培养基的制备
发酵菌株采购于中国エ业微生物菌种保藏管理中心，分别如下
A菌-像今木霉，Trichoderma koningii编号为CICC40505,培养基为取去皮的马
铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。B菌——黑曲霉，Asperぬ7ΛΛ5 ni’gvr，编号为:CICC41130，培养基为鹿糖30克，硝酸钠2克，硫酸镁O. 5克，氯化钾O. 5克，硫酸亚铁O. 01克，磷酸氢ニ钾I克，蒸馏水1000毫升，15磅灭菌30分钟。2.直投式发酵剂的制备过程
2.I冻干菌粉末的活化
分别量取O. 9%的生理盐水IOml于2只试管内，经121°C灭菌20分钟冷却至30°C，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入O. 9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在30°C恒温箱中静止活化30分钟，备用。2. 2扩大培养
2.2. I母发酵剂的制备
分别量取2株菌培养基各200ml于2只500ml三角瓶内，121 °C灭菌20分钟冷却至300C，按培养基体积的10%接种2. I步骤中已经活化的菌种，在30°C、150转/分钟，摇床培养24小时，作为母发酵剂。2. 2. 2生产发酵剂的制备
首先配置10%的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入5%的液态甘油、2%低聚木糖、2%蔗糖，121 °C灭菌20分钟冷却至30°C，分别按5%体积比例接种母发酵剂，在30°C、150转/分钟，摇床培养30— 36小时，检测2株菌生产发酵剂活菌数，各生产发酵剂活菌数> IO9个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数< IO9个/ml，继续培养，直至达到IO9个/ml。2. 3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度O. 8 — lcm，加盖瓶塞后放入_30°C冰柜速冻,冻结后将玻璃安瓶用托盘盛装,放入冻干机进行冷冻干燥。2. 4直投式发酵剂的复配
按冻干菌粉末重量，取A菌粉末2份，B菌粉末3份，充分混匀后制成直投式发酵剂，用于发酵葡萄籽浆，直投式发酵剂的添加量为葡萄籽浆中固形物重量的O. 125%。3.葡萄籽原花青素的制备
3.I原料粉浆选择无虫害、无病害、未发热霉变、水分含量5%以下的葡萄籽，按葡萄籽重量的3倍添加去离子水，然后进入胶体磨，循环磨浆制成葡萄籽浆。3. 2 配料
按葡萄籽浆重量的1%添加葡萄糖粉，充分搅拌，溶解葡萄糖，制成加糖葡萄籽浆。
3. 3高温灭菌
将加糖葡萄籽浆加热至121°C灭菌20分钟，然后冷却至30°C。3. 4接菌发酵
按加糖葡萄籽浆中固形物重量的O. 125%接种2. 4步骤制备的直投式发酵剂，30°C、150转/分钟，摇床培养48小吋。3. 5离心除渣
用管式离心机15000转/分钟离心去除发酵葡萄籽浆中的不溶性物质。3. 6超滤提取
用截留分子量为5000 Da的超滤膜过滤，取滤过液，再用截留分子量为150 Da的超滤膜过滤，弃滤过液，取150 Da超滤膜截留的液体。3. 7 干燥
将经过3. 6步骤处理后获得的150 Da超滤膜截留的液体进行喷雾干燥，获得葡萄籽原花青素，即为成品。实施例ニ
1.发酵菌株的选择及培养基的制备
发酵菌株采购于中国エ业微生物菌种保藏管理中心，分别如下
A菌-像今木霉，Trichoderma koningii编号为CICC40505,培养基为取去皮的马
铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。B菌——黑曲霉，Asperぬ7ΛΛ5 niger,编号为CICC41130，培养基为鹿糖30克，硝酸钠2克，硫酸镁O. 5克，氯化钾O. 5克，硫酸亚铁O. 01克，磷酸氢ニ钾I克，蒸馏水1000毫升，15磅灭菌30分钟。2.直投式发酵剂的制备过程
2.I冻干菌粉末的活化
分别量取O. 9%的生理盐水IOml于2只试管内，经121°C灭菌20分钟冷却至30°C，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入O. 9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在30°C恒温箱中静止活化30分钟，备用。2. 2扩大培养
2.2. I母发酵剂的制备
分别量取2株菌培养基各200ml于2只500ml三角瓶内，121 °C灭菌20分钟冷却至300C，按培养基体积的10%接种2. I步骤中已经活化的菌种，在30°C、150转/分钟，摇床培养24小时，作为母发酵剂。2. 2. 2生产发酵剂的制备
首先配置10%的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入5%的液态甘油、2%低聚木糖、2%蔗糖， 121 °C灭菌20分钟冷却至30°C，分别按5%体积比例接种母发酵剂，在30°C、150转/分钟，摇床培养30— 36小时，检测2株菌生产发酵剂活菌数，各生产发酵剂活菌数> IO9个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数< IO9个/ml，继续培养，直至达到IO9个/ml。2. 3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度O. 8 — lcm，加盖瓶塞后放入_30°C冰柜速冻,冻结后将玻璃安瓶用托盘盛装,放入冻干机进行冷冻干燥。
2. 4直投式发酵剂的复配
按冻干菌粉末重量，取A菌粉末4份，B菌粉末5份，充分混匀后制成直投式发酵剂，用于发酵葡萄籽浆，直投式发酵剂的添加量为葡萄籽浆中固形物重量的O. 125%。3.葡萄籽原花青素的制备
3.I原料粉浆
选择无虫害、无病害、未发热霉变、水分含量5%以下的葡萄籽，按葡萄籽重量的3倍添加去离子水，然后进入胶体磨，循环磨浆制成葡萄籽浆。3. 2 配料
按葡萄籽浆重量的1%添加葡萄糖粉，充分搅拌，溶解葡萄糖，制成加糖葡萄籽浆。3. 3高温灭菌
将加糖葡萄籽浆加热至121°C灭菌20分钟，然后冷却至30°C。3. 4接菌发酵
按加糖葡萄籽浆中固形物重量的O. 125%接种2. 4步骤制备的直投式发酵剂，30°C、150转/分钟，摇床培养48小吋。3. 5离心除渣
用管式离心机15000转/分钟离心去除发酵葡萄籽浆中的不溶性物质。3. 6超滤提取
用截留分子量为5000 Da的超滤膜过滤，取滤过液，再用截留分子量为150 Da的超滤膜过滤，弃滤过液，取150 Da超滤膜截留的液体。3. 7 干燥
将经过3. 6步骤处理后获得的150 Da超滤膜截留的液体进行喷雾干燥，获得葡萄籽原花青素，即为成品。
权利要求
1. ー种葡萄籽原花青素的制备方法，其特征在于它是按以下步骤进行制备 1)发酵菌株的选择及培养基的制备 发酵菌株采购于中国エ业微生物菌种保藏管理中心，分别如下 A菌-像今木霉，Trichoderma koningii编号为CICC40505,培养基为取去皮的马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。
B菌——黑曲霉，Aspergillus nigvr，编号为:CICC41130，培养基为鹿糖30克，硝酸钠2克，硫酸镁O. 5克，氯化钾O. 5克，硫酸亚铁O. 01克，磷酸氢ニ钾I克，蒸馏水1000晕升，15膀灭菌30分钟。
2)冻干菌粉末的活化 分别量取O. 9%的生理盐水IOml于2只试管内，经121°C灭菌20分钟冷却至30°C，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入O. 9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在30°C恒温箱中静止活化30分钟，备用。
3)母发酵剂的制备 分别量取2株菌培养基各200ml于2只500ml三角瓶内，121 °C灭菌20分钟冷却至.300C，按培养基体积的10%接种2)步骤中已经活化的菌种，在30°C、150转/分钟，摇床培养24小时，作为母发酵剂。
4)生产发酵剂的制备 首先配置10%的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入5%的液态甘油、2%低聚木糖、2%蔗糖， .121 °C灭菌20分钟冷却至30°C，分别按5%体积比例接种母发酵剂，在30°C、150转/分钟，摇床培养30— 36小时，检测2株菌生产发酵剂活菌数，各生产发酵剂活菌数> IO9个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数< IO9个/ml，继续培养，直至达到IO9个/ml。
5)粉末冻干菌种的制备 将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度O. 8 — lcm，加盖瓶塞后放入_30°C冰柜速冻,冻结后将玻璃安瓶用托盘盛装,放入冻干机进行冷冻干燥。
6)直投式发酵剂的复配 按冻干菌粉末重量，取A菌粉末2-4份，B菌粉末3-5份，充分混匀后制成直投式发酵齐U，用于发酵葡萄籽浆，直投式发酵剂的添加量为葡萄籽浆中固形物重量的O. 125%。
7)原料粉浆 选择无虫害、无病害、未发热霉变、水分含量5%以下的葡萄籽，按葡萄籽重量的3倍添加去离子水，然后进入胶体磨，循环磨浆制成葡萄籽浆。
8)配料 按葡萄籽浆重量的1%添加葡萄糖粉，充分搅拌，溶解葡萄糖，制成加糖葡萄籽浆。
9)高温灭菌 将加糖葡萄籽浆加热至121°C灭菌20分钟，然后冷却至30°C。
10)接菌发酵 按加糖葡萄籽浆中固形物重量的O. 125%接种6)步骤制备的直投式发酵剂，30°C、150转/分钟，摇床培养48小吋。
11)离心除渣用管式离心机15000转/分钟离心去除发酵葡萄籽浆中的不溶性物质。
12)超滤提取 用截留分子量为5000 Da的超滤膜过滤，取滤过液，再用截留分子量为150 Da的超滤膜过滤，弃滤过液，取150 Da超滤膜截留的液体。
13)干燥 将经过12)步骤处理后获得的150 Da超滤膜截留的液体进行喷雾干燥， 获得葡萄籽原花青素，即为成品。
全文摘要
本发明提供了一种葡萄籽原花青素的制备方法，首先制备康宁木霉和黑曲霉直投式发酵剂，然后将葡萄籽经加水磨浆、加葡萄糖配料、高温灭菌、接菌发酵、离心除渣、超滤提取、干燥等工艺制成葡萄籽原花青素。
文档编号C12R1/885GK102690858SQ20121017087
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者佟晓芳, 姜帆, 陈成 申请人:哈尔滨市海澳斯生物科技开发有限公司