专利名称：一种中国汉族人结核病基因检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体地说，涉及一种中国汉族人结核病基因检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
结核病是由结核杆菌侵入人体引起的一种具有较强的传染性慢消耗性疾病。每个器官和系统都可患病，其中以肺结核最为常见。结核病是全球各类传染病的首位杀手，全球有1/3的人(约20亿)感染了结核病。现有结核病人约2000万。每年新增病人约900万，每年死亡人数达到300万。近年来，由于多发耐药结核、结核菌与艾滋病病毒的双重感染和流动人口增多，结核病疫情出现回升，严重危害着广大人们群众的身体健康，已成为重大的公共卫生问题和社会问题。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，据统计我国结核病的发病率为121/10万，结核病患者数量居世界第二位，严重制约我国经济和社会的发展。肺结核病的临床表现是低热、盗汗、疲劳、食欲不振、体重减轻。肺结核局部症状有咳嗽、胸闷、气短、咯血等。病情轻者，诸症未必全部出现，重者则各种症状大多俱现，或先后相继发生，或合并出现。发病多慢，常逐渐加重，但亦有偶有急骤发病，很快恶化者。有些病人在潜伏期、甚至进展期无任何症状，偶尔体检时才发现。越来越多的证据表明，除病菌和环境等因素以外，遗传学基因因素在结核病，包括复发和耐药性结核病的发生与发展过程中扮演着重要的角色。通过以家族研究为基础的相关分析，表明个体对结核病易感性或抗性的差异与宿主的基因相关。在动物实验研究的基础上，已筛选出了多种人的结核病相关候选基因，并在不同人种间得到了研究的验证。结核病是一种顽固的慢性疾病，一旦感染发病，若不及时规范地彻底治疗，可以慢性带菌、复发、恶化、耐药，难以治愈，形成慢性传染源。因此，结核病如能及时发现，采用适当的治疗手段，往往能取得满意疗效。人们希望有一种简单而客观的方法可以进行肺结核病基因检测，做到早发现、早诊断，提早采取预防措施，尽量避免病患的发生。
发明内容
针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种中国汉族人结核病基因检测试剂盒及检测方法，可以在可能发病之前快捷地进行成人肺结核病易感基因的检测，通过对成人肺结核病基因检测，做到早发现，早诊断，提前采取预防措施，尽量避免病患的发生。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下一种中国汉族人结核病基因检测试剂盒，包括探针、DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品、SAP反应液、iPlex反应液。所述探针由通常的核苷酸引物合成仪合成，序列如下扩增MYBBP1A基因的引物序列如下上游引物ACGITGGATGITCGTGITTCGGTGAGTGTG
下游引物ACGTTGGATGACTCTGCGTCGCTTCTCCA延伸弓I 物CGTCGCTTCTCCAGGCGACATCGGCT扩增RELA基因的引物序列如下上游弓I 物ACGITGGATGAGCTGAATCAGGGCCTGITG下游引物ACGTTGGATGTCAGTTTCCTCTCTGGAGGG延伸弓丨物GGCCTGTTGTACTTTCTTAAGGAAAA。所述DNA抽提试剂包括缓冲液A :0. 5mmol/L的SDS，缓冲液B 50mmol/L的NaOH,缓冲液D lmmol/L的碳酸钠-丙酮，缓冲液W :无水乙醇，洗脱液10mmol/L的Tris盐。所述预混PCR反应液含有中国汉族人结核病相关的MYBBP1A和RELA基因突变位 点的扩增引物，引物为包含突变位点的上游引物和正常的下游引物，序列分别如下扩增MYBBP1A基因的引物序列如下上游引物ACGITGGATGITCGTGITTCGGTGAGTGTG下游引物ACGTTGGATGACTCTGCGTCGCTTCTCCA延伸引物CGTCGCTTCTCCAGGCGACATCGGCT扩增RELA基因的引物序列如下上游弓I 物ACGITGGATGAGCTGAATCAGGGCCTGITG下游引物ACGITGGATGTCAGITTCCTCTCTGGAGGG延伸引物GGCCTGITGTACTITCTTAAGGAAAA。所述标准阳性对照品是含有MYBBP1A和RELA的两个基因中含有突变核苷酸片段构成的Pgem-T重组质粒，包含有四种，序列分别如下Seql gCacacGtgtTTCGTGTTTCGGTGAGTGTGgcggagatggagagccgggatcccgccgagccgatgtcgccTGGAGAAGCGACGCAGAGTggcgCccgGcSeq2 gCacacGtgtTTCGTGTTTCGGTGAGTGTGgcggagatggagagccgggatcccgcccagccgatgtcgccTGGAGAAGCGACGCAGAGTggcgCccgGcSeq3 tCcagaGggaAGCTGAATCAGGGCCTGTTGtactttcttaaggaaaactgagggagggcacgccccacctCCCTCCAGAGAGGAAACTGAatcagAtgcgSeq4 tCcagaGggaAGCTGAATCAGGGCCTGTTGtactttcttaaggaaaattgagggagggcacgccccacctCCCTCCAGAGAGGAAACTGAatcagAtgcg。所述标准阴性对照品包含的序列为含有拟南芥基因片断100个核苷酸构成的Pgem-T重组质粒,序列如下Seq5 ATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTG。所述Pgem-T重组质粒是通过转化大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取,经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释到109cOpy/ul，-20°C保存。贮存液为109copy/ul,使用浓度为 105copy/ul。一种结核病基因检测试剂盒对结核病基因的检测方法，包括步骤如下(I)用DNA抽提试剂提取待测样本；(2)将上述待测样本和标准阴性、阳性对照品分别加入装有预混PCR反应液的反应管中，混匀，低速离心数秒，立即进行PCR扩增反应；(3)上述PCR反应程序结束后，在上述PCR反应管中加入SAP反应液，放入PCR仪中进行反应；(4)上述反应结束后，在PCR反应管中加入iPlex反应液，再次放入PCR仪中进行反应;(5)将反应产物点在基因芯片上后，放入质谱仪进行检测； (6)对检测结果进行分析和判断。上述步骤(2)中的反应条件如下
权利要求
1.ー种中国汉族人结核病基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括探针、DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品、SAP反应液、以及iPlex反应液。
2.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针由通常的核苷酸引物合成仪合成，序列如下 扩增MYBBP1A基因的引物序列如下 上游引物ACGTTGGATGTTCGTGTTTCGGTGAGTGTG 下游引物ACGTTGGATGACTCTGCGTCGCTTCTCCA 延伸弓 I 物CGTCGCTTCTCCAGGCGACATCGGCT 扩增RELA基因的引物序列如下上游弓 I 物ACGTTGGATGAGCTGAATCAGGGCCTGTTG 下游引物ACGTTGGATGTCAGITTCCTCTCTGGAGGG延伸弓 I 物GGCCTGTTGTACTTTCTTAAGGAAAA。
3.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征在干，所述DNA抽提试剂包括缓冲液AO.5mmol/L的SDS,缓冲液B 50mmol/L的NaOH,缓冲液D lmmol/L的碳酸钠-丙酮，缓冲液W :无水こ醇,洗脱液10mmol/L的Tris盐。
4.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征在于，所述预混PCR反应液含有中国汉族人结核病相关的MYBBP1A和RELA基因突变位点的扩增引物，引物为包含突变位点的上游引物和正常的下游引物，序列分别如下 扩增MYBBP1A基因的引物序列如下 上游引物ACGTTGGATGTTCGTGTTTCGGTGAGTGTG 下游引物ACGTTGGATGACTCTGCGTCGCTTCTCCA 延伸弓 I 物CGTCGCTTCTCCAGGCGACATCGGCT 扩增RELA基因的引物序列如下上游弓 I 物ACGTTGGATGAGCTGAATCAGGGCCTGTTG下游引物ACGTTGGATGTCAGITTCCTCTCTGGAGGG延伸弓 I 物GGCCTGTTGTACTTTCTTAAGGAAAA。
5.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性对照品是含有MYBBPIA和RELA的两个基因中含有突变核苷酸片段构成的Pgem-T重组质粒，包含有四种，序列分别如下 Seql gCacacGtgtTTCGTGTTTCGGTGAGTGTGgcggagatggagagccgggatcccgccgagccgatgtcgccTGGAGAAGCGACGCAGAGTggcgCccgGcSeq2 gCacacGtgtTTCGTGTTTCGGTGAGTGTGgcggagatggagagccgggatcccgcccagccgatgtcgccTGGAGAAGCGACGCAGAGTggcgCccgGcSeq3 tCcagaGggaAGCTGAATCAGGGCCTGTTGtactttcttaaggaaaactgagggagggcacgccccacctCCCTCCAGAGAGGAAACTGAatcagAtgcgSeq4 tCcagaGggaAGCTGAATCAGGGCCTGTTGtactttcttaaggaaaattgagggagggcacgccccacctCCCTCCAGAGAGGAAACTGAatcagAtgcg。
6.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标准阴性对照品包含的序列为含有拟南芥基因片断100个核苷酸构成的Pgem-T重组质粒，序列如下 Seq5 ATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTG。
7.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述Pgem-T重组质粒是通过转化大肠杆菌DH5a増殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释到109cOpy/ul，-20°C保存。贮存液为109cOpy/ul，使用浓度为105cOpy/ul。
8.根据权利要求I 6所述的试剂盒对结核病基因的检测方法，其特征在于，包括步骤如下 (1)用DNA抽提试剂提取待测样本； (2)将上述待测样本和标准阴性、阳性对照品分别加入装有预混PCR反应液的反应管中，混匀，低速离心数秒，立即进行PCR扩增反应； (3)上述PCR反应程序结束后，在上述PCR反应管中加入SAP反应液，放入PCR仪中进行反应； (4)上述反应结束后，在PCR反应管中加入iPlex反应液，再次放入PCR仪中进行反应 (5)将反应产物点在基因芯片上后，放入质谱仪进行检测； (6)对检测结果进行分析和判断。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应条件如下
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应条件如下37°C，40min ；85°C，5min ；4°C，forever。
11.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中反应条件如下
全文摘要
本发明公开一种中国汉族人结核病基因检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括探针、DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品、SAP反应液、iPlex反应液。本发明使用时，是以被测中国人的DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，使用试剂盒在PCR仪上进行基因扩增，再用延伸引物进行PCR扩增产物的再延伸，纯化后的延伸反应产物点在基因芯片上，采用MALDI-TOF质谱仪进行检测，结合反应结果进行诊断。
文档编号C12Q1/68GK102732623SQ20121020399
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者蔡雷 申请人:上海交通大学