专利名称：糖基化酰基血红蛋白发色剂的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品领域，特别涉及亚硝酸盐发色剂的替代品。
背景技术：
在肉制品生产中，亚硝酸盐不仅是传统的发色剂和防腐剂，还是一种风味剂，其能使肉制品产生特有的风味和组织结构。但如果加入量过多、搅拌不均匀或者加工工艺不合理，就非常容易导致成品中亚硝酸盐残留量过高，人食用后就会引起中毒，此外，肉制品中残留的亚硝酸盐与人体内蛋白质代谢的中间产物反应会生成致癌物质，正是由于亚硝酸盐对人体的这些危害作用，多年来各国科学家一直在寻找它的有效替代品，因此部分或全部替代亚硝酸盐的研究受到了广泛的关注。 由于亚硝酸盐的发色原理是亚硝基与肌红蛋白亚铁离子形成六配位复合物亚硝基肌红蛋白，因此一般都是将血红蛋白进行亚硝基化得到樱桃红色的亚硝基血红蛋白作为发色剂添加到肉制品中。不少研究工作者已相继开展了亚硝基血红蛋白替代亚硝酸盐的研究，也取得了一定的研究结果(如Shahidi等，1985，1991 ;杨锡洪等，2005 ;黄群等，2007)，但依然存在亚硝酸盐残留问题，同时亚硝基血红蛋白类色素的稳定性较差，限制了血红蛋白类色素的使用，因此生产具有稳定性和分散性更好的无硝血红蛋白将是未来发展的方向。中国的生猪产量接近世界总量的1/2，猪血除少部分用于生产血豆腐和血粉外，大部分直接排放，造成环境污染。基于猪血的其它再利用技术还鲜有人研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供糖基化酰基血红蛋白配方，该配方可以制备性质稳定，成本低廉的糖基化酰基血红蛋白。为实现上述目的，本发明的技术方案为糖基化酰基血红蛋白配方，由酰基化血红蛋白液与壳聚糖液组成。进一步，酰基化血红蛋白液与壳聚糖液的体积比为I : 1-3，所述壳聚糖液的质量浓度为0. 3-2%。进一步，所述酰基化血红蛋白液与壳聚糖也的体积比为I : 1，所述壳聚糖也的质量浓度为0. 5%，所述壳聚糖液中的壳聚糖为水溶性壳聚糖，所述糖基化酰基血红蛋白液的pH 值为 6. 8-7. 2。进一步，所述酰基化血红蛋白液的制备方法为在血红蛋白溶液中加入烟硝酸使烟硝酸的最终质量浓度为0. 8-2%,再加入D-异抗坏血酸钠，使D-异抗坏血酸钠最终质量浓度为0. 8-2%，搅拌均匀后调pH值为7. 3-7. 5。血红蛋白溶液的制备是按照常规方法实现的，如采血后抗凝，自然沉降分离红细胞，加入蒸馏水(例如I : I的体积比)使红细胞破膜，得血红蛋白溶液进一步,所述血红蛋白液为猪血制备的血红蛋白溶液。
进一步，所述血红蛋白液中含有终浓度为10mg/mL的甘油。本发明的目的之二在于提供基于上述配方制备糖基化酰基血红蛋白的方法，该方法操作简单，适用于大规模生产。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的糖基化酰基血红蛋白配方制备糖基化酰基血红蛋白的方法，将酰基化血红蛋白液与壳聚糖混合均匀后，调节PH到6. 8-7. 2值，在40-60°C加热5_10分钟，得糖基化酰基血红蛋白。优选的，糖基化酰基血红蛋白过滤，取滤液。本发明的目的之三在于提供糖基化酰基血红蛋白及其应用，该产品及其应用为肉制品中亚硝酸盐的使用提供了替代品。
为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的方法制备的糖基化酰基血红蛋白。所述的糖基化酸基血红蛋白在制备肉制品发色剂中的应用。本发明的有益效果在于糖基化酰基血红蛋白选用猪血为原料，提取细胞内血红蛋白，经发色和抗氧化处理，制成酰基血红蛋白，在此基础上再进行糖基化处理，制成新型发色剂糖基化酰基血红蛋白，提高其对光、热、离子的稳定性和分散性，从而替代或部分替代肉制品中亚硝酸盐的使用，糖基化酰基的使用不仅可以降低肉制品中亚硝酸盐的残留量，还可以低猪血对环境的污染，提高畜产品的综合利用价值，产生较好的社会效益和经济效益。本发明以猪血血红蛋白制备的糖基化酰基血红蛋白为研究对象，其在温度、光照、金属离子及PH值等因素影响下稳定性。
图I为温度对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响的分析图，其横坐标为温度，纵坐标为吸光度值。图2为室内自然光对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响的分析图，其横坐标为时间，纵坐标为吸光度值。图3为室内黑暗条件下对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响的分析图，其横坐标为时间，纵坐标为吸光度值。图4为不同金属离子对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响分析图，其纵坐标为吸光度值。图5为pH值对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响分析图，其横坐标为pH值，纵坐标为吸光度值。说明书附图和摘要附图中提及的糖基化无硝血红蛋白为糖基化酰基血红蛋白的另一名称。
具体实施例方式本发明涉及的实验材料包括猪血；柠檬酸三钠(分析纯AR);烟酰胺(食品添加齐U) ;D_异抗坏血酸钠(食品添加剂)；水溶性壳聚糖(食品添加剂)；亚硝酸钠(食品添加剂)。
实施例中主要仪器包括FA2004A电子天平，由上海精天电子仪器厂；METTLERTOLEDO FE20实验室pH计，由梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH系列恒温水浴锅，由江苏金坛中大仪器厂；Anke TDL-50B低速台式大容量离心机，由上海安亭科学仪器厂；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，由北京普析通用仪器有限责任公司；FD-1B_50型冷冻干燥机上海比朗仪器有限公司。实施例I血红蛋白液提取采集猪血；本实施例中以猪血为原料,也可采用其它畜牧动物的血作为原料。常规抗凝处理如事先在容器内加入质量体积分数为5%柠檬酸三钠，使血液中柠檬酸三钠终质量体积分数浓度为0. 5% )。抗凝处理后，用纱布过滤抗凝后的血液，除去杂质颗粒，装入透明容器，于4°C条件 下静置4-8小时，目的在于使血浆和血细胞发生自然沉降分离；也可采用其它方法分离血浆和血细胞，如离心。分离后，除去血浆层，杂血细胞层中然后加入相当于血细胞层等体积的蒸馏水，充分搅拌使血细胞破壁(溶胀法)，释放出血红蛋白。实施例2酰基化血红蛋白液的制备以烟酰胺、D-异抗坏血酸钠为保护剂，制备酰基血红蛋白。制备方法如下在血红蛋白液中加入(质量分数计，终浓度)I %烟酰胺和(质量分数计，终浓度)I % D-异抗坏血酸钠，搅拌均匀后调PH值为7. 3 7. 5，于4°C避光反应24小时。酰基化血红蛋白的发色原理是酰基与血红蛋白亚铁原子形成六配位复合物酰基血红蛋白，从而增加亚铁离子的稳定性，防止其氧化为3价铁离子,丧失鲜红的颜色。实施例3糖基化酰基血红蛋白的制备将以上制备的酰基化血红蛋白液与初始质量分数为0. 5%的水溶性壳聚糖液按体积比为I : I混合，再调pH值为7. 0左右，在50°C条件下加热5分钟，再将反应液过滤，去除未反应、变性的蛋白质，取滤液，后续实施例备用。通过平行试验，酰基化血红蛋白液与壳聚糖液的体积比为I : 1-3，所述壳聚糖液的质量浓度为0. 3-2%的范围内，均可实现糖基化酰基血红蛋白的制备。实施例4色素制品将上述方法得到的糖基化酰基血红蛋白溶液进行冷冻干燥，得到粉末状色素产品。同时制备亚硝基血红蛋白溶液，也同样冷冻干燥作为对照样。亚硝基血红蛋白的制备方法参照“杨锡洪，解万翠，王维民，等.稳定性色素-糖基化亚硝基血红蛋白的研制[J].食品科学，2007，(10) :204-207”的方法，制备方法如下于IOOOmL体积分数为10%的血红蛋白液中加入0. 8g亚硝酸钠和3. 6gD-异抗坏血酸钠，搅拌均匀后调pH值为6. 1，于4°C避光反应24小时。实施例5温度对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响将0. 5g实施例4方法制备的血红蛋白冻干样品配成质量分数为5%的水溶液(IOml)，于恒温水浴锅中加热10分钟，设40°C、60°C、80°C 3个水平组，冷却后离心，取上清稀释20倍过滤，观察颜色并于540nm处测吸光度A。由图I可见，温度对血红蛋白的稳定性有一定影响，在不同的温度条件下，糖基化酰基血红蛋白的吸光度均高于亚硝基血红蛋白，表明糖基化酰基血红蛋白对热的稳定性要由于亚硝基血红蛋白。但随着温度的升高，二者的吸光度均呈下降趋势，在80°C条件下加热10分钟，二者的吸光度均明显下降，表明糖基化酰基血红蛋白及亚硝基血红蛋白均不耐长时间高温加热。判断其稳定性主要体现在吸光值的变化上，吸光值变化越小，稳定性越好。实施例6光照对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响取实施例4方法制备血红蛋白冻干样品(2g左右)于试管中并密封，分别设为室内自然光组和室内黑暗组，即将两组分别置于室内自然光及室内黑暗自条件下观察色泽变化情况，每隔I周各取0. 100g， 溶解于50ml蒸馏水中，然后过滤，观察颜色并于波长540nm处测吸光度A。由图2可见，室内自然光组在室内自然光条件下，随着贮藏时间的增加，糖基化酰基血红蛋白和亚硝基血红蛋白的吸光度均呈下降趋势，但在各个时间阶段，糖基化酰基血红蛋白的吸光度均高于亚硝基血红蛋白，表明糖基化酰基血红蛋白对光的稳定性要优于实施例五制备的对照样(亚硝基血红蛋白)。由图3可见,室内黑暗组在室内黑暗条件下,糖基化酸基血红蛋白和亚硝基血红蛋白随着贮藏时间的延长，吸光度呈下降趋势，但各储藏阶段糖基化酰基血红蛋白的吸光值均高于亚硝基血红蛋白，且各阶段的二者吸光值均高于自然光照组，表明在黑暗条件下的储藏条件要优于自然光照条件。实施例7金属离子对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响分别取实施例4方法制备的0. 5g血红蛋白冻干样品加入IOmL浓度为0. lmol/L的五水硫酸铜、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、氢氧化镁、氯化钾、氯化钙溶液混匀，黑暗处放置一定时间后(颜色发生变化时)，离心，取上清稀释20倍过滤，观察颜色并于540nm处测吸光度A。由图4可见，Cu2+、Fe2+、Zn2+对糖基化酰基血红蛋白及亚硝基血红蛋白的影响均较大，加入Cu2+、Fe2+、Zn2+后吸光度非常低，而Mg2+、K+、Ca2+对糖基化酰基血红蛋白及亚硝基血红蛋白的影响较小，在相同条件下，糖基化酰基血红蛋白的对金属离子的稳定性总体上要优于亚硝基血红蛋白。实施例8pH值对糖基化酰基血红蛋白稳定性的影响用lmol/L HCl 和 0. 5moI/LNaOH调节不同 pH值(5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0)的缓冲液10mL，分别加入实施例4方法制备的0. 5g血红蛋白冻干样品，室内光照放置一定时间后(颜色发生变化时)，离心，取上清稀释20倍过滤，观察颜色并于540nm处测吸光度A0由图5可见，糖基化酰基血红蛋白及亚硝基血红蛋白经不同pH值缓冲液处理后，其吸光度均无明显变化，但总的趋势是糖基化酰基血红蛋白吸光度高于亚硝基血红蛋白。表明两者均耐酸碱，在PH值5-8范围内均较稳定。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.糖基化酰基血红蛋白配方，其特征在于，由酰基化血红蛋白液与壳聚糖液组成。
2.根据权利要求I所述的糖基化酰基血红蛋白配方，其特征在于，酰基化血红蛋白液与壳聚糖液的体积比为I : 1-3，所述壳聚糖液的质量浓度为0.3-2%。
3.根据权利要求I所述的糖基化酰基血红蛋白配方，其特征在于，所述酰基化血红蛋白液与壳聚糖也的体积比为I : 1，所述壳聚糖也的质量浓度为0.5%，所述壳聚糖液中的壳聚糖为水溶性壳聚糖，所述糖基化酰基血红蛋白液的PH值为6. 8-7. 2。
4.根据权利要求I所述的糖基化酰基血红蛋白配方，其特征在于，所述酰基化血红蛋白液的制备方法为在血红蛋白溶液中加入烟硝酸使烟硝酸的最终质量浓度为0. 8-2%,再加入D-异抗坏血酸钠，使D-异抗坏血酸钠最终质量浓度为0. 8-2 %，搅拌均匀后调pH值为 7. 3-7. 5。
5.根据权利要求4所述的糖基化酰基血红蛋白配方，其特征在于，所述血红蛋白液为猪血制备的血红蛋白溶液。
6.根据权利要求5所述的糖基化酰基血红蛋白配方，其特征在于，所述血红蛋白液中含有终浓度为lOmg/mL的甘油。
7.权利要求1-6任一项所述的糖基化酰基血红蛋白配方制备糖基化酰基血红蛋白的方法，其特征在于，将酰基化血红蛋白液与壳聚糖混合均匀后，调节PH值到6. 8-7. 2，在40-60°C加热5-10分钟，得糖基化酰基血红蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所得糖基化酰基血红蛋白过滤，取滤液。
9.权利要求7所述的方法制备的糖基化酰基血红蛋白。
10.权利要求9所述的糖基化酰基血红蛋白在制备肉制品发色剂中的应用。
全文摘要
本发明属于食品领域，特别涉及亚硝酸盐发色剂的替代品，具体为糖基化酰基血红蛋白配方，由酰基化血红蛋白液与壳聚糖液组成；其制备方法为将血红蛋白液与烟酰胺和D-异抗坏血酸钠混合后进行血红蛋白的酰基化改性，得酰基化血红蛋白，再将酰基化血红蛋白与壳聚糖混合均匀后，调节pH值，在变性温度以下加热进行蛋白质和糖的化学反应，得糖基化酰基血红蛋白；糖基化酰基血红蛋白优选猪血作原料，制成的新型发色剂糖基化酰基血红蛋白，其对光、热、离子的稳定性和分散性显著提高，从而可替代肉制品中亚硝酸盐的使用，不仅可以降低肉制品中亚硝酸盐的残留量，还可降低猪血对环境的污染，提高畜产品的综合利用价值，产生较好的社会效益和经济效益。
文档编号A23L1/314GK102796194SQ20121028726
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月14日 优先权日2012年8月14日
发明者葛良鹏, 欧秀琼, 景绍红, 黄萍, 宋凡, 张晓春 申请人:重庆市畜牧科学院