专利名称：一种用于制备生物柴油的固载脂肪酶催化剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于制备生物柴油的固载脂肪酶催化剂、其制备方法及利用其制备生物柴油的方法，具体涉及一种固载在海泡石上的脂肪酶催化剂、其制备方法及利用所述催化剂制备生物柴油的方法，属于生物柴油制备领域。
背景技术：
根据1992年美国生物柴油协会(National Biodiesel Borad, NBB)给出的定义，生物柴油(Biodiesel)是指以植物、动物油脂等可再生生物资源生产的可用于压燃式发动机的清洁替代燃油。随着石油资源逐渐枯竭与环境的恶化，生物柴油作为石油燃料的替代物，具有基本不含硫和芳烃、能量密度高、十六烷值高、润滑性能好、储运安全、抗爆性好、燃烧充分、能生物降解、无毒等优良性能，是一种具有很大发展潜力的环境友好的大宗生物基液体燃料。 生物柴油的制备方法有物理法和化学法。物理法操作简单,但物理法得到的产品在使用过程中会发生不同程度的烧结(如发动机喷嘴)、活塞环卡死和积碳等问题。化学法主要包括热裂解法和酯交换法。其中，热裂解法得到的产品质量较好，但是制备工艺条件苛亥Ij (如高温)，反应难以控制，产物组分复杂，设备和操作成本高，因而没有得到广泛的应用。而酯交换法是动植物油脂与短链醇进行酯交换反应，生成相对分子质量小的脂肪酸酯(即生物柴油)。而酯交换法制备生物柴油的方法又可分为化学催化法、酶催化法和超临界法。化学催化法主要有酸催化和碱催化，其中酸催化对原料的适应性广，但传统酸催化工艺对设备腐蚀严重，反应速率慢、能耗大、收率低；而新技术中的固体酸催化反应虽然解决了对设备的腐蚀问题，但活性偏低，反应速率较慢。而碱催化虽然较酸催化活性高、反应速率高、且不腐蚀设备，但对于原料的要求高，只能使用脂肪酸和水含量低的原料。超临界法制备生物柴油的反应速率非常高、对原料的适应性强、环境友好、反应速率快、转化率高，但是其反应条件苛刻，需要高温高压下进行，对设备的要求比较高。酶催化法制备生物柴油是指用脂肪酶为催化剂，将醇与植物油进行酯交换反应生成脂肪酸酯的过程。酶催化法具有油脂原料适用性广、反应条件温和(30-40°C)、醇用量小、脂肪酸酯收率较高、产品易于收集和无污染等优点。但由于很多酶对水的依赖性强，且生物柴油酯交换过程的醇体系对酶的活性也有一定的影响，导致酶的催化寿命较短，限制了酶法制备生物柴油的发展。为了解决酶的流失，降低酶的催化成本，固载化酶受到了关注，如用高岭土负载月旨肪酶(Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol usingimmobilized lipase. Iso M，Chen B，Eguchi M，et al. Journal of Molecular CatalysisB:Enzymatic, 2001, 16:53-58);邓利等成功地从假丝酵母发酵液中提取出了假丝酵母脂肪酶，将其固定到纺织品上，应用到废弃油脂及食用油的酯交换反应中，在有机溶剂存在的情况下，成功地制取出了性能合格的生物柴油产品(脂肪酶催化合成生物柴油的研究，邓利等，生物工程学报，2003，19 (I) :97-101) ;Shah 等将 Chromobacterium viscosum 固载在Delite-545 上，在 40°C反应 8h 得到 71% 的得率(Shan S，Sharma S，Gupta M N. Biodieselpreparation by Lipase-Catalyzed transesterification of Jatropha oil. Energy andFuels, 2004, 18 (I) : 154-159);用硅基MCF材料固载脂肪酶(硅基MCF材料固载脂肪酶转化餐饮废油产生物柴油，申渝，化工学报，2012，63 (6))等。酶法制备生物柴油的反应条件温和，但是由于酶的价格昂贵，造成成本较高；而且酶的反应条件苛刻、容易失活，重复利用次数低。因此，如何开发一种能够多次重复利用、成本较低、活性较稳定的用于制备生物柴油的脂肪酶催化剂，是本领域亟待解决的一个技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种能够多次重复利用、成本较低、活性较稳定的用于制备生物柴油的脂肪酶催化剂，尤其是一种制备生物柴油的固载脂肪酶催化剂，具体为将脂肪酶固载在海泡石上。 海泡石是一种天然纤维状含水的镁硅酸盐粘土矿物，在其结构单元中，硅氧四面体与镁氧八面体相互交替，具有层状和链状结构的过渡型特征，其理想结构式可表示为Si12O30Mg8 · (OH)4(H2O)4 · 8H20。海泡石的特殊结构决定了它具有良好的物化性能(即吸附性、流变性及催化性能)及价格低廉等优点，因而应用前景十分广泛。海泡石作为一种多孔型无机高分子物质，由于其具有巨大的比表面自由能，可以吸附或覆盖各类催化剂单质或化合物。这些单质和化合物可以进入海泡石通道内部，这一点是SiO2和Al2O3无法比拟的。其次，海泡石由于自身存在许多碱性中心[MgO6]和酸性中心[SiO4],反应物分子被吸附后，易极化变形为活化络合物，从而可促进反应的发生。因此，海泡石本身拥有一定的催化作用。在实际应用中，海泡石可以和催化剂一起产生协同催化作用，提高催化效果。再次，可以采取特殊的改性方法，如采用酸改性后的方法，可以使海泡石孔径或纤维长度与具体的催化剂相适应。在制备特定类型催化剂方面，传统载体所不具备的这一优越性，为我们探索新的制备方法提供了更大的空间。另外，海泡石载体催化剂以其活性高、选择性好并有一定的耐热性和抗毒性而表现出优越的实用性能。本发明将脂肪酶催化剂固载在海泡石上，结合了海泡石良好的吸附性、流变性和催化性能，与脂肪酶结合后起到了协同增效的作用，使得固载在海泡石上的脂肪酶活性稳定，且能够重复利用。优选地，本发明所述海泡石为酸改性处理的海泡石，即本发明所述固载脂肪酶催化剂为固载在酸改性处理的海泡石上的脂肪酶催化剂。其中，所述酸改性处理的海泡石中的酸优选自盐酸、硫酸或硝酸中的任意I种或至少2种的组合，所述组合例如盐酸/硫酸、硝酸/盐酸、盐酸/硫酸/硝酸等，进一步优选自盐酸和/或硫酸，进一步优选盐酸。天然海泡石自身酸性极弱，对海泡石进行酸改性为用不同的阳离子取代海泡石骨架中的镁离子。由于Mg2+是一弱碱，遇弱酸会生成沉淀而沉积于海泡石的微孔结构中，故目前处理酸均为强酸(如HN03、H2SO4及HCl等)。不同强酸对海泡石的处理机理相同，均为H+取代骨架中的Mg2+。海泡石经酸处理其Si-O-Mg-O-Si键变成了两个Si-O-H键，即出现了“撇开”状态的结构，此时内部通道被连通，故比表面积增大。曾用盐酸对海泡石进行处理，以考察酸对海泡石结构的影响，结果表明，酸处理使海泡石比表面积得到极大的提高，孔径由微孔(<2nm)发展为2-5nm的中孔(海泡石的酸性和性能研究I.改性历程和改性产物的结构，蒋文斌等，石油学报，1994，10(1) :29-35)。由于海泡石经过酸化，其比表面积增大，本发明进一步将脂肪酶固载在酸改性的海泡石上，能够使固载脂肪酶催化剂获得更加稳定的活性，耐酸、耐碱、耐高温性能均得到了提高，且可以重复利用，灵活修饰，从而降低了成本。本发明的目的之二是提供一种前述固载在海泡石上的脂肪酶催化剂的制备方法，所述方法包括如下步骤(I)对海泡石进行酸改性处理；(2)将脂肪酶固载化在步骤(I)得到的酸改性处理后的海泡石上。 优选地，步骤(I)所述的对海泡石进行酸改性处理包括如下步骤(Ia)将海泡石置于酸中浸泡；( lb)将浸泡后的海泡石洗涤，过滤，烘干，粉碎，灼烧。优选地，步骤(Ia)所述酸选自盐酸、硫酸或硝酸中的任意I种或至少2种的组合，优选盐酸和/或硫酸，进一步优选盐酸。本发明将海泡石置于酸中浸泡的目的是用酸中的H+取代骨架中的Mg2+，打开Si-O-Mg-O-Si键变成了两个Si-O-H键，连通海泡石内部通道，增大比表面积。优选地，所述酸的浓度优选为O. l_6mol/L,例如 O. 2mol/L、0. 45mol/L、l. 2mol/L、
2.6mol/L、3. 61mol/L、4. 52mol/L、5. 68mol/L、5. 84mol/L 等，进一步优选为 0. 4-2. 8mol/L。本发明所述酸的浓度> 6mol/L时，浓度过高，操作不便，且容易与Si发生副反应，影响海泡石的内部结构，不利于后续脂肪酶负载的稳定性；而当酸的浓度< O. lmol/L时，浓度过低，与Mg2+的反应缓慢，且容易造成资源浪费。在一个优选实施方式中，本发明步骤(Ia)所述酸选自浓度为O. l-6mol/L的盐酸，优选浓度为O. 4-2. 8mol/L的盐酸。优选地，步骤(Ia)所述海泡石与酸的比例为每克海泡石加入8_70mL的酸，例如每克海泡石加入的酸的量为 8. 2mL、9. 2mL、15mL、22mL、30. 5mL、39mL、43mL、50. 7mL、55mL、60. 4mL、67mL、69. 2mL等，优选每克海泡石加入10_25mL的酸。当每克海泡石加入的酸的量
<SmL时，H+量较少，不足以全部取代海泡石中的Mg2+，造成海泡石资源的浪费；当每克海泡石加入的酸的量> 70mL时，由于Mg2+已经基本被H+取代，多余的H+造成浪费。优选地，步骤(Ia)所述浸泡温度为30_90°C，例如浸泡温度为31°C、34. 2°C、38°C、45°C、52°C、59. 3°C、64°C、76°C、82°C、86· 8°C、89°C等，优选 35_75°C;浸泡时间为 12_30h，例如浸泡时间为 12. 3h、12. 9h、13. 6h、15. 8h、17. 2h、20. 3h、24h、27h、28. lh、28. 8h、29h、29. 6h等，优选13-25h。优选地，步骤(lb)所述洗涤为用水洗涤，所述水选自去离子水和/或蒸馏水；所述灼烧温度优选为 220-280°C，例如 225°C、238°C、251°C、268°C、274°C、277°C等，进一步优选230-2500C，特别优选 240°C。本发明所述的对海泡石进行酸改性处理的步骤和各步骤的操作条件，并不仅限于上述的条件，上述的各操作只是本发明的优选条件和步骤，能够满足将海泡石酸性处理的实验条件均可用于本发明。作为本发明的一个优选实施方式，本发明步骤(I)所述的对海泡石进行酸改性处理包括如下步骤在30_90°C下，向海泡石中加入浓度为O. 4-2. 8mol/L的盐酸，盐酸加入量为10-25mL/每克海泡石，浸泡12-30h ;然后用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到酸改性后的海泡石。优选地，本发明步骤(2)所述的脂肪酶固载化包括如下步骤(2a)将脂肪酶溶于缓冲溶液，混合，得到脂肪酶溶液；(2b)向脂肪酶溶液中加入步骤(I)得到的酸改性处理的海泡石，混合，进行固载化反应; (2c)将反应产物进行清洗，过滤，干燥，得到固载在海泡石上的固载脂肪酶；所得固载脂肪酶常温保存。步骤(2a)所述缓冲液的目的是为了维持脂肪酶的正常pH值和正常生理环境，起到保证脂肪酶活性的作用，缓冲液的选择是本领域技术人员所熟知的操作。优选地，本发明步骤(2a)所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，优选pH为6. 8-7，浓度为O. 04-0. 05mol/L的磷酸盐缓冲溶液，例如磷酸缓冲液的pH为6. 81,6. 87,6. 90,6. 96等，浓度为O. 041mol/L、
O.044mol/L、0. 046mol/L、0. 048mol/L 等。本发明步骤(2a)所述缓冲溶液特别优选pH为7，浓度为O. 05mol/L的磷酸盐缓冲溶液。优选地，本发明步骤(2a)所述缓冲溶液中脂肪酶的添加比例为每IOOmL缓冲溶液中，添加600-1000mg脂肪酶，例如每IOOmL缓冲溶液中，添加脂肪酶的量为605mg、624mg、654mg、680mg、699mg、715mg、750mg、785mg、830mg、860mg、885mg、914mg、945mg、987mg 等，优选每IOOmL缓冲溶液中，添加800mg脂肪酶。当每IOOmL缓冲溶液中，添加脂肪酶的量
<600mg时，得到的固载脂肪酶催化剂的催化效率低，重复利用性也不好；而当每IOOmL缓冲溶液中，添加脂肪酶的量> IOOOmg时，脂肪酶容易流失，且固载不稳定，造成浪费。优选地，步骤(2a)所述混合自离心混合、震荡混合或搅拌混合中的任意I种或至少2种的组合，优选离心混合，进一步优选在2000-3000r/min的条件下离心混合，例如离心混合的转速为 2100r/min、2500r/min、2700r/min、2900r/min 等，特别优选在 2400r/min 的条件下离心混合。优选地，步骤(2b)所述海泡石的加入量为每IOOmL脂肪酶溶液加入3_7g步骤(I)得到的酸改性处理的海泡石，例如每IOOmL脂肪酶溶液加入步骤(I)得到的酸改性处理的海泡石的质量为3. 2g、4. lg、4. 9g、5. 8g、6. 2g、6. 8g等；优选每IOOmL脂肪酶溶液加入4g步骤(I)得到的酸改性处理的海泡石。优选地，步骤(2b)所述混合选自离心混合、震荡混合或搅拌混合中的任意I种或至少2种的组合，所述组合例如震荡混合/搅拌混合等，优选震荡混合。优选地，步骤(2b)所述固载化反应的时间为5_9h，例如5. 2h、5. 8h、6. 3h、6. 9h、
7.5h、8. lh、8. 8h 等，优选 5_7h，进一步优选 6h。优选地，步骤(2c)所述清洗为用缓冲液清洗，所述缓冲液可以与步骤(2a)中的缓冲液相同，也可以与步骤(2a)中的缓冲液不同，本发明不做限定；优选与步骤(2a)中的缓冲液相同，即用步骤(2a)所述缓冲液进行冲洗。同样的，本发明所述的脂肪酶固载化的步骤和各步骤的操作条件，并不仅限于上述的条件，上述的各操作只是本发明的优选条件和步骤，能够满足将脂肪酶固载化在海泡石或酸改性处理的海泡石上的实验条件均可用于本发明。作为本发明的一个优选实施方式，本发明步骤(2)所述的脂肪酶固载化包括如下步骤将400mg脂肪酶溶于50mL浓度为O. 05mol/L, pH为7的磷酸盐缓冲溶液中，在2400r/min的条件下进行离心；取IOOmL酶液,加入4g已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后于常温下保存。在本优选实施方式中，最后所述的“用大量缓冲液清洗过滤”中的“大量”，虽然不是一个确定的量，但是清洗步骤的目的是将反应后为固载在海泡石上的残余脂肪酶、或者其他杂质清洗下来，是本领域技术人员完全能够明了的操作，对于“大量”也是能够清楚把 握的，此处不做具体的限定，典型但非限制性的实例有所述清洗用的缓冲液的质量为海泡石质量的10-50倍、10-30倍、20-60倍等。本发明的目的之三在于提供一种酶催化法制备生物柴油的方法。酶催化法制备生物柴油的方法，本领域已经做了一定的研究。目前，酶法制备生物柴油一般使用固定化脂肪酶间歇催化油脂合成生物柴油，主要步骤就是将甲醇和植物油混合，在脂肪酶催化剂存在下，进行反应，其中甲醇分三次加入反应中，制备得到生物柴油。本发明提供的酶催化法制备生物柴油的方法的特点在于选用固载在海泡石上的脂肪酶催化剂作为催化剂，对甲醇和植物油的反应进行催化；优选用固载在酸改性的海泡石上的脂肪酶催化剂作为催化剂，对甲醇和植物油的反应进行催化。优选地，所述在酶催化法制备生物柴油的方法中，以植物油的质量为100wt%计算，固载在海泡石上的脂肪酶催化剂的用量为O. 8-10wt%,例如O. 88wt%、O. 95wt%、
I.42wt%> I. 89wt%、2. 03wt%、2. 7wt%、4. 5wt%、6. 8wt%、7. 5wt%、8. 41wt%、9. 24wt%、9. 7wt% 等，优选 l-8wt%。关于本发明所述的酶催化法制备生物柴油的过程中，制备原料是本领域技术人员所熟知的，典型但非限制性的实例有大豆油、菜籽油、蓖麻油、花生油、玉米油或废油脂中的任意I种或至少2种的组合。优选地，本发明所述的酶催化法制备生物柴油的方法包括如下步骤(I)向反应容器中加入植物油、甲醇和权利要求I或2所述的固载脂肪酶催化剂；(II)进行酶催化反应；(III)步骤(II)结束后，抽滤回收脂肪酶；滤液蒸馏，回收甲醇，剩余部分分液滤出甘油，最后剩下的即为生物柴油。其中，优选地，步骤(I)所述植物油和甲醇加入总量的摩尔比为1:2_1:5，例如1:2. 2,1:2. 9,1:3. 1,1:3. 7,1:4,1:4. 5,1:4. 9等，优选1:3 ;所述甲醇优选分三次加入反应容器，加入频率为每22-26h加入I次，例如每22. 5h加入I次，共加入3次；优选每24h加入一次；每23. 2h加入I次，共加入3次；优选每24h加入一次；每24. 5h加入I次，共加入3次；每25. 8h加入I次，共加入3次；优选每24h加入一次。在本发明中，植物油和甲醇加入总量的摩尔比的计算为本领域技术人员所熟知的技能，计算步骤为(植物油的质量/植物油的平均分子量):(甲醇的质量/甲醇的分子量)。其中，甲醇的分子量为32. 04，甲醇的质量可以直接称量；植物油的质量也可以通过直接称量得到，而植物油的平均分子量可由皂化值(SV)和酸值(AV)计算得到，皂化值的测定可参照GB-9104. 2-88，酸值的测定 可参照GB9104. 3_88，平均分子量的计算式为M= (56. I X 1000 X 3) / (SV-AV)；关于植物油的平均分子量的计算，很多现有文献也都有涉及，本领域技术人员可以自行查阅，例如文献“植物油制备生物柴油，邬国英，江苏石油化工学院学报，2002年9月，14 (3)典型但非限制性的实例有对于大豆油，本发明认为平均分子量为880，则IOOg大豆油与IOg甲醇的摩尔比的计算式为(100/880) : (10/32. 04);而对于潲水油，本发明认为潲水油的分子量为920。优选地，本发明步骤(II)所述反应温度30-40°C，例如31°C、33°C、36. 3°C、37°C、39°C>39. 5°C等；总反应时间66-78h，优选72小时。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果I、本发明是采用海泡石固载脂肪酶，尤其是采用酸改性后的海泡石固载脂肪酶作为催化剂，脂肪酶催化剂的用量少；反应结束后固载脂肪酶催化剂可重复利用，重复利用次数高达10次，虽然固载脂肪酶催化剂的活性略有下降，但植物油转化为生物柴油的转化率仍可以达到90%以上。2、经固载化的脂肪酶，耐酸碱性能和耐热性能较原酶明显提高；其最适pH由7. 5变为5. 6，最适温度由30°C变为35°C。3、对于酸处理过的海泡石固载脂肪酶，在水解速率上要比没处理的海泡石固载脂肪酶效果要好。4、本发明提供的生物柴油的制备方法，反应活性高，反应速度快，反应条件相对温和，可以在常压及相对低的温度下进行，从而可以降低反应能耗，降低成本；反应在常压下进行，降低了对反应装置的要求，并且催化剂无腐蚀性，也降低了设备耐腐蚀要求，节省投资费用。5、本发明提供的固载脂肪酶催化剂催化剂稳定性好，用量少，催化剂可以重复循环使用，生产过程环境友好；操作方法简单，易于操作，反应时间短，收率高对设备腐蚀小，既可以减少能源，又可以降低成本。
具体实施例方式本发明给出的区间值，并非数学概念的精确端值，而试验选择有协当区间，适当偏离端值并非不可以。以下结合若干个具体实施例，示例性说明及帮助进一步理解本发明，但实施例具体细节仅是为了说明本发明，并不代表本发明构思下全部技术方案，因此不应理解为对本发明总的技术方案限定，一些在技术人员看来，不偏离发明构思的非实质性改动，例如以具有相同或相似技术效果的技术特征简单改变或替换，均属本发明保护范围。本发明实施例中所述脂肪酶为SUKALIP脂肪酶，购自苏柯汉(潍坊)生物工程有限公司。本发明所述脂肪酶并不限于SUKALIP脂肪酶，任何一种现有的或新技术中的脂肪酶均可用于本发明。实施例I :—种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在30°C温度下，向IOg海泡石中加入IOOmL浓度为O. 4mol/L的盐酸，浸泡12h ；b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化
a、将400mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(O. 05mol/L, pH7)中，离心(2400r/min),取IOOmL酶液；加入4g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固载化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入大豆油和甲醇(摩尔比1:3)，甲醇分三次加入，加入制备得到的酸改性海泡石固载化脂肪酶，加入量为3w%(以大豆油的质量为100 %计)，在35°〇下反应72小时，产物的转化率可以达到96. 1%。实施例2 一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在30°C温度下，向IOg海泡石中加入150mL浓度为O. 4mol/L的盐酸，浸泡12h ；b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化将400mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(O. 05mol/L, pH7)中，离心(2400r/min),取IOOmL酶液,加入4g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入菜籽油和甲醇(摩尔比1:3)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为3w% (以菜籽油的质量为100 %计)，在30°C下反应72小时，产物转化率达到95. 7%。实施例3 一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在50°C温度下，向IOg海泡石中加入200mL浓度为I. 2mol/L的盐酸，浸泡12h ；b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化将400mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(O. 05mol/L, pH7)中，离心(2400r/min),取IOOmL酶液,加入4g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。
利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入蓖麻油和甲醇(摩尔比1:3)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为4w% (以蓖麻油的质量为100 %计)，在40°C下反应72小时，产物转化率达到95. 3%ο实施例4 一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在50°C温度下，向IOg海泡石中加入250mL浓度为I. 2mol/L的盐酸，浸泡18h ；b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化将400mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH7)中，离心(2400r/min),取IOOmL酶液,加入4g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入玉米油和甲醇(摩尔比1:3)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为8w% (以玉米油的质量为100 %计)，在35°C下反应72小时，产物转化率达到96. 5%。实施例5 一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在70°C温度下，向IOg海泡石中加入150mL浓度为2. Omol/L的盐酸，浸泡18h ；b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240 V下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化将400mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH7)中，离心(2400r/min),取IOOmL酶液,加入4g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入花生油和甲醇(摩尔质量比1:3)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为8w% (以花生油的质量为100 %计)，在30°C下反应小72时，产物转化率达到97. 5%。实施例6一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在70°C温度下，向IOg海泡石中加入150mL浓度为2. 8mol/L的盐酸，浸泡18h ；b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化
将400mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH7)中，离心(2400r/min),取IOOmL酶液,加入4g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入精制处理后的潲水油和甲醇(摩尔比1:3)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为6w% (以潲水油的质量为100w%计)，在30°C下反应72小时，产物转化率分别达到97. 2%。实施例7一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石
a、在70°C温度下，向IOg海泡石中加入250mL浓度为2. Omol/L的盐酸，浸泡18h;b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化将400mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH7)中，离心(2400r/min),取IOOmL酶液,加入4g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入菜籽油和甲醇(摩尔比1:3)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为6w% (以菜籽油的质量为100 %计)，在35°C下反应72小时，产物转化率分别为95. 9%。实施例8:一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在90°C温度下，向IOg海泡石中加入250mL浓度为2. 8mol/L的盐酸，浸泡30h;b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化将400mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH7)中，离心(2400r/min),取IOOmL酶液,加入4g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入蓖麻油和甲醇(摩尔比1:3)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为6w% (以蓖麻油的质量为100 %计)，在30°C下反应72小时，产物转化率分别为96. 7%。实施例9:考察酸改性海泡石固载脂肪酶催化剂的重复性实验结果，除以下不同外，其余与上述实例I相同考察催化剂重复性实验结果，催化剂I
步骤(la):30°C下海泡石的质量(g)与盐酸加入量(mL)之比1:10，浓度为O. 4mol/L盐酸改性12h ；将催化剂I重复催化大豆油和甲醇，其产物的转化率依次为95. 2%,94. 3%,94. 4%、
94.3%, 93. 2%, 92. 7%, 92. 8%, 90. 6%, 90. 0%、90· 1% ；催化剂2步骤(la):90°C下海泡石的质量(g)与盐酸加入量(mL)之比1:25，浓度为2. 8mol/L盐酸改性30h ；将催化剂2重复催化大豆油和甲醇，其产物的转化率依次为95. 7%,95. 3%,96. 4%、
95.3%, 94. 6%, 92. 2%, 92. 1%、90· 8%, 90. 1%、90· 0%。
由此可以看出，本发明所提供的固载化脂肪酶经过10次重复性催化大豆油和甲醇，其产物的转化率依然能够达到90%以上。实施例10一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在82°C温度下，向IOg海泡石中加入80mL浓度为6mol/L的硝酸，浸泡21h ;b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在220°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化将300mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(O. 04mol/L, pH6. 8)中，离心(2000r/min),取IOOmL酶液,加入7g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应5h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入蓖麻油和甲醇(摩尔比1:2)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为O. 8w% (以蓖麻油的质量为100 %计)，在40°C下反应66小时，产物转化率分别为97. 1%。实施例11一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)盐酸改性海泡石a、在73 °C温度下，向IOg海泡石中加入700mL浓度为O. lmol/L的硫酸，浸泡
16.5h ；b、用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在280°C下高温灼烧，得到盐酸改性后的海泡
O(2)脂肪酶固载化将500mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(O. 043mol/L,pH6. 9)中，离心(3000r/min),取IOOmL酶液,加入3g步骤(I)中已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应9h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(3)在O. 25L反应器中，加入蓖麻油和甲醇(摩尔比1:5)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为10w% (以蓖麻油的质量为100 %计)，在30°C下反应78小时，产物转化率分别为98. 5%。实施例12一种固载脂肪酶催化剂的制备方法，包括如下步骤(I)脂肪酶固载化将500mg脂肪酶溶于50mL磷酸盐缓冲溶液(O. 043mol/L,pH6. 9)中，离心(3000r/min)，取IOOmL酶液，加入3g海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应9h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后得到固定化脂肪酶。利用制备得到的固载化脂肪酶催化剂制备生物柴油(2)在O. 25L反应器中，加入蓖麻油和甲醇(摩尔比1:5)，甲醇分三次加入，上述固定化脂肪酶加入量为10w% (以蓖麻油的质量为100 %计)，在30°C下反应78小时，产物转 化率分别为72. 5%。申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
权利要求
1.一种制备生物柴油的固载脂肪酶催化剂，其特征在于，所述催化剂为将脂肪酶固载在海泡石上。
2.如权利要求I所述的固载脂肪酶催化剂，其特征在于，所述海泡石为酸改性处理的海泡石；所述酸优选自盐酸、硫酸或硝酸中的任意I种或至少2种的组合，进一步优选自盐酸和/或硫酸，进一步优选盐酸。
3.—种如权利要求I或2所述的固载脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (I)对海泡石进行酸改性处理； (2 )将脂肪酶固载化在步骤(I)得到的酸改性处理后的海泡石上。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述的对海泡石进行酸改性处理包括如下步骤 (Ia)将海泡石置于酸中浸泡； (Ib)将浸泡后的海泡石洗涤，过滤，烘干，粉碎，灼烧。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(Ia)所述酸选自盐酸、硫酸或硝酸中的任意I种或至少2种的组合，优选盐酸和/或硫酸，进一步优选盐酸；所述酸的浓度优选为 O. l_6mol/L，进一步优选为 O. 4-2. 8mol/L ； 进一步优选地，步骤(Ia)所述酸选自浓度为O. l-6mol/L的盐酸，优选浓度为O. 4-2. 8mol/L 的盐酸； 优选地，步骤(Ia)所述海泡石与酸的比例为每克海泡石加入8-70mL的酸,优选每克海泡石加入10-25mL的酸； 优选地，步骤(Ia)所述浸泡温度为30-90°C，优选35-75°C ;浸泡时间为12_30h，优选13-25h ； 优选地，步骤(Ib)所述洗涤为用水洗涤，所述水选自去离子水和/或蒸馏水；所述灼烧温度优选为220-280°C，进一步优选230-250°C，特别优选240°C。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述的对海泡石进行酸改性处理包括如下步骤 在30-90°C下，向海泡石中加入浓度为O. Γ2. 8mol/L的盐酸，盐酸加入量为10_25mL/每克海泡石，浸泡12-30h ;然后用蒸馏水洗涤，过滤，烘干，粉碎，在240°C下高温灼烧，得到酸改性后的海泡石。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的脂肪酶固载化包括如下步骤 (2a)将脂肪酶溶于缓冲溶液，混合，得到脂肪酶溶液； (2b)向脂肪酶溶液中加入步骤(I)得到的酸改性处理的海泡石，混合，进行固载化反应； (2c)将反应产物进行清洗，过滤，干燥，得到固载在海泡石上的固载脂肪酶；所得固载脂肪酶常温保存； 优选地，步骤(2a)所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，优选pH为6. 8-7，浓度为O.04-0. 05mol/L的磷酸盐缓冲溶液，进一步优选pH为7，浓度为O. 05mol/L的磷酸盐缓冲溶液；优选地，步骤(2a)所述缓冲溶液中脂肪酶的添加比例为每IOOmL缓冲溶液中，添加600-1000mg脂肪酶，优选每IOOmL缓冲溶液中，添加800mg脂肪酶； 优选地，步骤(2a)所述混合自离心混合、震荡混合或搅拌混合中的任意I种或至少2种的组合，优选离心混合，进一步优选在2000-3000r/min的条件下离心混合,特别优选在2400r/min的条件下离心混合； 优选地，步骤(2b)所述海泡石的加入量为每IOOmL脂肪酶溶液加入3-7g步骤(I)得到的酸改性处理的海泡石，优选每IOOmL脂肪酶溶液加入4g步骤(I)得到的酸改性处理的海泡石； 优选地，步骤(2b)所述混合选自离心混合、震荡混合或搅拌混合中的任意I种或至少2种的组合，优选震荡混合； 优选地，步骤(2b)所述固载化反应的时间为5-9h，优选5-7h，进一步优选6h ； 优选地，步骤(2c)所述清洗为用缓冲液清洗，优选用步骤(2a)所述缓冲液进行冲洗。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的脂肪酶固载化包括如下步骤 将400mg脂肪酶溶于50mL浓度为O. 05mol/L,pH为7的磷酸盐缓冲溶液中，在2400r/min的条件下进行离心；取IOOmL酶液，加入4g已改性的海泡石载体；在室温下振荡混合物；反应6h后，用大量缓冲液清洗过滤，干燥后于常温下保存。
9.一种酶催化法制备生物柴油的方法，为甲醇和植物油在脂肪酶催化剂存在下进行反应，制备生物柴油，其特征在于，所述脂肪酶催化剂为如权利要求I或2所述的固载在海泡石上的脂肪酶催化剂；优选所述脂肪酶催化剂为如权利要求2所述的固载在酸改性的海泡石上的脂肪酶催化剂； 优选地，所述方法中，以植物油的质量为100wt%计算，固载在海泡石上的脂肪酶催化剂的用量为O. 8-10wt%，优选I 8wt% ； 优选地，所述方法包括如下步骤 (I)向反应容器中加入植物油、甲醇和权利要求I或2所述的固载脂肪酶催化剂； (II)进行酶催化反应； (III)步骤(II)结束后，抽滤回收脂肪酶；滤液蒸馏，回收甲醇，剩余部分分液滤出甘油，最后剩下的即为生物柴油； 其中，优选地，步骤(I)所述植物油和甲醇加入总量的摩尔比为1:2-1:5，优选1:3 ;所述甲醇优选分三次加入反应容器，加入频率为每22-26h加入I次，优选每24h加入一次； 优选地，步骤(II)所述反应温度30-40°C ;总反应时间66-78h，优选72小时。
全文摘要
本发明公开了一种固载在海泡石上的脂肪酶催化剂、其制备方法及利用所述催化剂制备生物柴油的方法，属于生物柴油制备领域。本发明提供的固载脂肪酶催化剂用量少，且可重复利用次数高达10次，且制备生物柴油的反应活性高，反应速度快，反应条件相对温和，可以在常压及相对低的温度下进行，能够降低反应能耗，降低成本，同时，生产过程环境友好，操作过程简单，对设备腐蚀小。
文档编号C12N11/14GK102827825SQ201210309958
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者李为民, 浦国佳, 李建防, 李志鹏, 张湘辉 申请人:连云港正丰生物能源有限公司, 常州大学