人源化抗表皮生长因子受体抗体及其用途
【专利摘要】本发明涉及人源化抗表皮生长因子受体抗体。本发明还涉及编码所述抗体的核酸分子，含有所述核酸分子的载体、宿主细胞和组合物，以及检测试剂和试剂盒。本发明还涉及所述抗体用于制备预防/治疗表皮生长因子或表皮生长因子受体相关疾病的药物中的用途以及用于制备检测试剂或试剂盒中的用途。本发明的抗体分子具有更低的免疫原性和更高的的靶点结合活性，从而有更强的生物学活性和体内外抗肿瘤活性，可以预期临床应用副作用更低，疗效更好。
【专利说明】人源化抗表皮生长因子受体抗体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及人源化抗体，具体涉及人源化抗表皮生长因子受体抗体，本发明还涉及所述抗体在制备预防或治疗与表皮生长因子高活性或高表达相关疾病的药物中的用途。与人鼠嵌合抗体相比，本发明所涉及的人源化抗表皮生长因子抗体进一步降低了抗体的免疫原性，同时增强了其抗原识别活性和体内体外抗瘤功能，有更好的临床应用前景。
【背景技术】
[0002]表皮生长因子受体(EpidermalGrowth Factor Receptor, EGFR,也称为 HERl,c-ErbBl)是表皮生长因子家族的细胞表面受体，是由1186个氨基酸残基构成，分子量为170kD 的一种跨膜糖蛋白(Jorissen RN, Walker F, Pouliot N, et al.Epidermal growthfactor receptor !mechanisms of activation and signaling.Exp Cell Res，2003 ;284:31-53)。EGFR属于I型酪氨酸激酶受体ErbB亚族(ErbB 1-4)，具有酪氨酸激酶的活性。EGFR稳定的表达于许多上皮组织，包括皮肤和毛囊。表皮生长因子受体异常表达或因受体突变而活化会导致癌变。有很多实体瘤发现高表达表皮生长因子受体，如直结肠癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食管癌等(Olayioye MA, Neve RM, Lane HA, etal.The EerbB Signaling network:receptor heterodimerzation in development andcancer.The EMBO J，2000 ; 19:3159-3167)。转化生长因子α和表皮生长因子等生长因子是表皮生长因子受体的内源性配体。这些配体与表皮生长因子受体结合，激活受体胞内酪氨酸蛋白激酶的活性，启动下游多条信号转导途径，从而调节正常细胞的生长和分化，增加肿瘤细胞的侵袭力、促进血管生成、抑制肿瘤细胞的凋亡(Ciardiello F, Tortora G.Anovel approach in the treatment of cancer:targeting the epidermal growth factorreceptor.Clin Cancer Res，2001 ;7:2958-2970)。表皮生长因子受体在肿瘤中的高度表达及其在肿瘤细胞生长、分化中起重要作用的这些特点，使表皮生长因子受体成为具有良好前景的肿瘤治疗靶点。
[0003]抗表皮生长因子受体的治疗性抗体，最早来自由表皮生长因子受体高表达表皮癌A431免疫小鼠而得到的鼠源抗体M2250M225与表皮生长因子受体特异结合，阻断其与配体结合，从而抑制表皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶的活性(Goldstein et al, 1995, Clin.Cancer.Res.1:1311-1318)。鼠源抗体作为外源蛋白，反复刺激人体，可引起超敏反应，被称为人抗鼠抗体反应。鼠源抗体在体内可能被抗抗体中和，进而被快速清除，甚至导致严重的过敏反应而致死。另外，鼠源单克隆抗体缺乏人抗体具有的免疫效应功能，如抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)和补体依赖的细胞毒(CDC)作用，因而疗效不佳。因此人鼠嵌合抗体C225抗体(爱必妥，Erbitux或Cetuximab, ImClone (现在Eli Lilly)公司)采用人IgGlK和鼠抗M225的可变区，降低了鼠源单抗的免疫原性，保留了与表皮生长因子受体的特异亲和性，可阻断EGF和TGFa等配体与表皮生长因子受体的结合，抑制其磷酸化和下游信号传导，从而抑制肿瘤细胞的生长，诱导凋亡，减少基质金属蛋白酶和血管上皮生长因子的产生。2004年美国FDA批准爱必妥治疗结直肠癌，2006批准治疗头颈部癌，目前有更多临床试验用于其它肿瘤适应症。与其他化疗药相比，抗体药物特异性强，副作用小，在临床上取得了较好的疗效。然而，人鼠嵌合爱必妥单抗仍有免疫原性，临床报道其免疫原性为5%，容易产生人抗抗体反应而导致免疫复合物介导的抗体清除，和皮肤及粘膜的副作用(An Z，et al.,2009, Therapeutic Monoclonal Antibody,p313)。
[0004]帕尼单抗(panitumumab, Amgen公司)是采用转基因小鼠技术制备的全人化单克隆抗体，无鼠源蛋白序列，靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)，2006年9月被FDA批准上市，与氟嘧啶、奥沙利钼和伊立替康合用或在化疗后用于治疗EGFR阳性的转移性直结肠癌。2006年FDA批准其单药治疗化疗耐受的转移性结直肠癌(mCRC)。然而帕尼单抗是IgG2亚型抗体，与IgGl相比，IgG2的⑶C活性及ADCC等生物学活性明显减低；另外，IgG2亚型抗体稳定性较差，这可能是临床效果上全人抗体帕尼单抗与嵌合抗体爱必妥相比没有明显优势的主要原因。
[0005]因此，本领域亟需具有更低免疫原性和更高生物学活性的人源化抗表皮生长因子受体抗体，以进一步提高疗效，降低副作用。
【发明内容】
[0006]本发明人在鼠源抗体的基础上，利用抗体人源化技术，令人惊奇地获得了一种具有更低免疫原性和更高生物学活性的人源化抗表皮生长因子受体抗体，本发明基于以上发现而完成。具体包括以下几个方面:
[0007]本发明第一方面涉及抗表皮生长因子受体抗体或其抗原结合部分，其重链CDRl的序列选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:39所示序列或其衍生序列，CDR3的序列选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:40所示序列或其衍生序列；和/或
[0008]其轻链CDR3 的序列选自 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:41 所示序列或其衍生序列。`
[0009]根据本发明第一方面的抗体或其抗原结合部分，其重链⑶R2和轻链⑶R1XDR2的序列可以为鼠源或人源或人鼠嵌合的抗表皮生长因子受体抗体的相应部分。
[0010]根据本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分，其重链和轻链FR的序列可以为鼠源或人源或人鼠嵌合的抗表皮生长因子受体抗体的相应部分。
[0011]在本发明的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分的重链可变区CDR的序列选自以下(I)~(4)所示序列或其衍生序列:
[0012](I) CDRl的序列为SEQ ID NO:1所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:4所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:2所不序列；
[0013](2)CDRl的序列为SEQ ID NO:1所示序列,CDR2的序列为SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:40所不序列；
[0014](3)CDR1的序列为SEQ ID NO:39所示序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:3所不序列；
[0015](4)CDR1的序列为SEQ ID NO:39所示序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:40所不序列；和/或
[0016]其轻链可变区⑶R的序列选自以下(5)~⑶所示序列或其衍生序列:
[0017](5) CDRl的序列为SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:9所不序列；
[0018](6) CDRl的序列为SEQ ID NO:11所示序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:12所示序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:41所不序列；
[0019](7) CDRl的序列为SEQ ID NO:11所示序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:12所示序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:41所不序列；
[0020](8) CDRl的序列为SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO: 10所不序列。
[0021]根据本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分，其重链FRl的序列选自SEQ ID NO:19~SEQ ID NO:22所示序列或其衍生序列，FR2的序列选自SEQ ID NO:23~SEQ ID NO:25所示序列或其衍生序列，FR3的序列选自SEQ ID NO:26~SEQ ID N0:29所示序列或其衍生序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所示序列或其衍生序列；和/或
[0022]其轻链FRl的序列选自SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:32所示序列或其衍生序列，FR2的序列选自SEQ ID NO:33~SEQ ID NO:34所示序列或其衍生序列，FR3的序列选自SEQ ID NO:35~SEQ ID NO:36所示序列或其衍生序列，FR4的序列选自SEQ ID NO:37~SEQ ID NO:38所示序列或其衍生序列。
[0023]在本发明的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分的重链可变区FR的序列选自以下(9)~(12)所示序列或其衍生序列:
[0024](9)FRl的序列为SEQ ID NO: 19所不序列，FR2的序列为SEQ ID NO:23所不的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:26所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所不的序列；
[0025](IO)FRl的序列为SEQ ID NO:20所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:24所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:27所示的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所示的序列；
[0026](Il)FRl的序列为SEQ ID NO:21所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:23所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:28所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所不的序列；
[0027](12)FRl的序列为SEQ ID NO:22所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:25所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:29所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所不的序列；和/或
[0028]其轻链可变区FR的序列选自以下(13)~(16)所示序列或其衍生序列:
[0029](13)FRl的序列为SEQ ID NO:31所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:33所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:35所示的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:37所示的序列；
[0030](14)FRl的序列为SEQ ID NO:31所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:33所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:35所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:38所不的序列；
[0031](15) FRl的序列为SEQ ID NO:32所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:34所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:36所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:38所不的序列；
[0032](16)FRl的序列为SEQ ID NO:31所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:33所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:35所示的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:37所示的序列。
[0033]在本发明的具体实 施方案中，所述抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列为SEQ ID NO:5所示的序列，轻链可变区序列为SEQ ID N0:13所示的序列。
[0034]在本发明的另一个具体实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列为SEQ ID NO:6所示的序列，轻链可变区序列为SEQ ID N0:14所示的序列。[0035]在本发明的另一个具体实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列为SEQ ID NO:7所示的序列，轻链可变区序列为SEQ ID NO:15所示的序列。
[0036]在本发明的另一个具体实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列为SEQ ID NO:8所示的序列，轻链可变区序列为SEQ ID N0:16所示的序列。
[0037]根据本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分，其还包含人IgGl重链恒定区和人K轻链恒定区。
[0038]在本发明中，所述IgGl重链恒定区包括各种同种异型，如Glm(f)、Glm(z)、Glm(z，a)或Glm(z,a, x)。在本发明的实施方案中，所述IgGl重链恒定区为Glm(z)型。
[0039]在本发明中，所述K轻链恒定区包括各种同种异型，如Kml、Kml，2或Km3，在本发明的的实施方案中，所述K轻链恒定区为Km3型。
[0040]根据本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合部分包括单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、scFv-Fc 二价分子、dAb和互补决定区(CTR)片段、Fab片段、Fd片段、Fab'片段、Fv和F (ab' )2片段。
[0041]本发明第二方面涉及分离的核酸分子，其编码本发明第一方面任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
[0042]本发明第三方面涉及载体，其含有本发明第二方面任一项的核酸分子。
[0043]在本发明中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述表达载体例如为原核表达载体，真核表达载体，噬菌体载体或病毒载体，均为本领域常用的载体。其中所述原核表达载体例如为PET28a、pGEM ExU pGEM7ZF(+)或pBAD24等，所述真核表达载体例如为pBudCE4.1、pcDNA3.1、pC`MV_Tag2B或pGL3 basic等,在本发明的实施方案中，所述真核表达载体为PCDNA3.1，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。在本发明的实施方案中，所述病毒载体为腺病毒载体。
[0044]本发明第四方面涉及宿主细胞，其含有本发明第二方面的核酸分子或第三方面的载体。
[0045]在本发明中，所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述真核细胞例如为哺乳动物细胞。所述宿主细胞可以通过向原核细胞或真核细胞中引入/转染上述的核酸分子或载体而得到。
[0046]在本发明中，所述原核细胞例如可以为大肠杆菌，所述真核细胞例如可以为酵母细胞、昆虫细胞(如Sf21)、哺乳动物细胞，所述哺乳动物例如可以为NSO细胞、CHO细胞。在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞。在本发明的一个实施方案中，所述真核细胞为CHO-S细胞。
[0047]在本发明中，可以利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染有特定核酸或载体的宿主细胞。例如，可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中。或者，可使用脂转染试剂如FuGENE6、X-tremeGENE和LipofectAmine。或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的适当病毒载体将核酸引入细胞中。
[0048]本发明第五方面涉及组合物，其含有本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分，以及任选的一种或多种药学可接受的辅料；优选地，所述辅料选自蛋白水解酶抑制剂、药用载体、稀释剂和佐剂。
[0049]本发明第六方面涉及本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分、或第二方面的核酸分子、或第三方面的载体、或第四方面的宿主细胞在制备预防/治疗表皮生长因子或表皮生长因子受体相关疾病的药物中的用途。
[0050]在本发明中，所述表皮生长因子或表皮生长因子受体相关疾病是指由于表皮生长因子高表达或表皮生长因子受体高表达而引起的疾病。在本发明的实施方案中，所述表皮生长因子或表皮生长因子受体相关疾病是指恶性肿瘤，其主要是指发生于上皮组织的恶性肿瘤，其包括但不限于直结肠癌、肝癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、阴道癌、膀胱癌、食管癌、口腔癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等。
[0051]本发明第七方面涉及检测试剂或试剂盒，其含有本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分；
[0052]优选地，所述抗体或其抗原结合部分还可包含可检测的标记；或者
[0053]优选地，所述检测试剂或试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分；或者
[0054]优选地， 所述第二抗体还可包含可检测的标记。
[0055]本发明第八方面涉及本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分在制备检测试剂或试剂盒中的用途，其中所述检测试剂或试剂盒用于检测表皮生长因子或表皮生长因子受体，或者用于诊断表皮生长因子或表皮生长因子受体相关疾病。
[0056]以下对本发明做进一步描述。
[0057]本发明的目的是针对已有的抗表皮生长因子受体抗体，利用去免疫原性的抗体人源化技术改变抗体的CDR区和/或框架区，以获得具有更低免疫原性和更高生物学活性的抗表皮生长因子受体抗体。
[0058]在本发明的一个实施方案中，首先分析鼠抗M225的重链可变区的序列，根据其重链可变区FRl，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库进行比较，找出与鼠抗M225重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体(比成熟抗体免疫原性更低)可变区相对应序列。然后经过insilicon方法,分析相似序列与HLA-DR分子结合的亲和性，选出亲和性最低的框架序列，从而最终确立重链可变区的FR1，FR2，FR3和FR4的人源化序列。在此框架结构的基础上，应用计算机分子模型分析鼠M225抗体的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠M225抗体对应框架氨基酸残基。对HLA-DR分子结合的亲和性较高的CDRl和CDR3的去免疫原化，则应用分子对接，分析表皮生长因子受体抗原鼠M225抗体靶位及其周边氨基酸残基与人源化重链可变区的立体空间结合方式，通过计算静电力，溶液媒合(salvation)，范德华引力和熵值，选择CDRl和CDR3序列中可以优化的氨基酸，以降低于HLA-DR分子结合的亲和性，并改善抗体CDR3区域与表皮生长因子受体抗原表位的结合。
[0059]在本发明的另一个实施方案中，分析鼠抗M225抗体的轻链可变区的序列，根据其轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库(NCBI Ig BLAST)进行比较，找出与鼠抗M225轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应序列，然后经过in silicon分析相似序列与HLA-DR分子结合的亲和性,选出亲和性最低的框架序列，从而最终确立轻链可变区的FRl，FR2，FR3和FR4的人源化序列。在此框架结构的基础上，应用计算机分子模型分析鼠225抗体的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠M225抗体对应框架氨基酸残基。对HLA-DR分子结合的亲和性较高的CDRl和CDR3的去免疫原化，则应用分子对接，分析表皮生长因子受体抗原鼠M225抗体靶位及其周边氨基酸残基与人源化重链可变区的立体空间结合方式，通过计算静电力，溶液媒合(salvation)，范德华引力和熵值，选择CDRl和CDR3序列中可以优化的氨基酸，以 口 ?
[0060]在本发明的实施方案中，从正常人B细胞中分别获得人IgGl重链恒定区Fe片段和轻链恒定区K片段，并分别和上述重链可变区和轻链可变区连接，构建抗体重链和轻链表达载体。将所述表达载体共转染哺乳动物细胞进行表达、纯化，得到人源化抗表皮生长因子受体抗体 BA03、BB03、BC03 和 BD03。
[0061]在本发明的实施方案中，所述抗体在与细胞表面表皮生长因子受体的亲和性、阻断EGF配体与细胞表面表皮生长因子受体结合的活性、抑制细胞表面表皮生长因子受体磷酸化的活性和ADCC作用方面，与爱必妥相比均具有更高的活性，同时具有更低的免疫原性。
[0062]在本发明的实施方案中，所述抗体对多种肿瘤细胞的生长都具有抑制作用，例如表皮癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和乳腺癌，并且在动物水平具有明显的抑制肿瘤生长的作用。
[0063]在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0064]在本发明中，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为K和λ轻链。重链可分类为μ、δ、Y、α或ε ,并`且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(Vh)和重链恒定区(Ch)组成。重链恒定区由3个结构域((^、(^和^^)组成。各轻链由轻链可变区和轻链恒定区(Q)组成。轻链恒定区由一个结构域Q组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。Vh和'区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各Vh和Vl由按下列顺序:FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、⑶R3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个⑶R和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(vn和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda,Md.(1987 and 1991))，或 Chothia& Lesk (1987) J.Mol.Biol.196:901-917 ;Chothia 等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgGl, IgG2，IgG3 或 IgG4 亚型)，IgAl, IgA2，IgD, IgE 或 IgM 抗体。
[0065]在本发明中，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，ERCC1)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7 (Paul,W., ed.,第 2 版,Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
[0066]在本发明中，术语“Fd片段”意指由Vh和ChI结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的 '和Vh结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由Vh结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature341:544-546(1989));术语“Fab片段”意指由\、VH、Q和ChI结构域组成的抗体片段；术语“F(ab' )2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
[0067]在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如，scFv),其中Vlj和Vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和 Huston 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883 (1988))。此类 scFv 分子可具有一般结构=NH2-Vf 接头-Vh-COOH 或 NH2-Vh-接头-'-C00H。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由 Alfthan 等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi 等人(2001)，Eur.J.1mmunol.31:94-106, Hu 等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56 和 Roovers等人(2001), Cancer Tmmunol.描述。
[0068]在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中V1^P \结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448(1993)，和 Poljak R.J.等人，Structure 2:1121-1123(1994))。
[0069]在本发明中，术语“衍生序列”是指与本发明的抗体或抗原结合部分相应片段的序列高度同源且仍保留与本发明的抗体或抗原结合部分相应片段具有相似的EGFR结合活性和免疫原性的序列。
[0070]可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体2E12)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
[0071]在本发明中，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-ASynthesis (第 2 版，E.S.Golub^PD.R.Gren,Eds., Sinauer Associates, Sunderland,Mass.(1991))，其通过引用合并入本文。
[0072]在本发明中，所述核酸包括DNA和RNA。
[0073]发明的有益效果
[0074]本发明针对已经上市的人鼠嵌合爱必妥单抗，利用去免疫原性的抗体人源化技术改变抗体的框架区和部分引起免疫原性的CDR区，形成全新序列的人源化抗表皮生长因子受体IgGl亚型抗体分子，所得抗体具有比爱必妥单抗更低的免疫原性和更高的的靶点结合活性，从而有更强的生物学活性和体内外抗肿瘤活性，可以预期临床应用副作用更低，疗效更好。
【专利附图】
【附图说明】
[0075]图1所示为抗体与细胞表面表皮生长因子受体亲和力的比较。
[0076]图2所示为抗体阻断EGF配体与细胞表面表皮生长因子受体结合的比较，其中纵坐标为0D450值。
[0077]图3所示为抗体抑制A431细胞表面表皮生长因子受体磷酸化的比较。
[0078]图4所示为抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性测定。
[0079]图5所示为树突状细胞-T细胞激活实验测定抗体体外免疫原性。
[0080]图6所示为抗体对人表皮癌A431小鼠肿瘤模型的生长抑制作用。
【具体实施方式】
[0081]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0082]实施例1、抗表面表皮生长因子受 体人源化单克隆抗体重链可变区序列的设计
[0083]以下为鼠抗M225的重链可变区的序列，下划线部分为FR1，FR2，FR3和FR4框架序列:QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEffLGVIffSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQYFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYffGQGTLYTYSA(SEQ ID NO:17)。
[0084]根据其重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列对人抗体基因序列库进行比较，找出与鼠抗M225重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应序列。然后用NetMHCIIpan软件或自编软件,经过in silicon方法,分析相似序列与HLA-DR分子结合的亲和性，选出亲和性最低的框架序列，从而最终确立人源化重链可变区的FR1，FR2，FR3和FR4的序列。在此框架结构的基础上，应用计算机分子模型分析鼠225抗体的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠225抗体对应框架氨基酸残基L29，L48和L67。对HLA-DR分子结合的亲和性较高的⑶Rl和⑶R3的去免疫原化，则应用分子对接，分析表皮生长因子受体鼠源M225抗体靶位及其周边氨基酸残基与人源化重链可变区的立体空间结合方式，通过计算静电力，溶液媒合(salvation)，范德华引力和熵值(Sircar et al, SnugDock:paratope structural optimization duringantibody-antigen docking compensates for errors in antibody homology models,PLoS Comput Biol.2010 Jan 22 ;6)，选择CDRl和CDR3序列中可以优化的氨基酸，将CDRl中的33位点GLy优化为氨基酸Asp，将⑶R3中的100位点Thr优化为氨基酸Asp，以降低与HLA-DR分子结合的亲和性，并改善抗体CDR3区域与表皮生长因子受体抗原表位的结合。新设计的重链⑶Rl为:N Y D V H (SEQ ID NO:1);新设计的重链⑶R3序列为A LDYYDYEFA Y (SEQ ID NO:2)和 A L T Y Y D Y D F A Y (SEQ ID NO:3)，由于 CDR2 对 HLA-DR分子结合的亲和性较低，保留原鼠抗M225的⑶R2序列(其序列为VIWSGGNTDYNTPFTS，SEQID NO:4) 0因此，整合优化的框架序列和⑶R序列，得到的4个新型抗表皮生长因子受体人源化单克隆抗体重链可变区序列为:
[0085]
【权利要求】
1.抗表皮生长因子受体抗体或其抗原结合部分，其重链⑶Rl的序列选自SEQID NO:1和SEQ ID NO:39所示序列或其衍生序列，CDR3的序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:40所示序列或其衍生序列；和/或 其轻链CDR3的序列选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:41所示序列或其衍生序列。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其重链可变区CDR的序列选自以下(I)~(4)所示序列或其衍生序列: (1)CDRl的序列为SEQID NO:1所示序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:2所不序列； (2)CDRl的序列为SEQ ID NO:1所示序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:40所不序列； (3)CDRl的序列为SEQID NO:39所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:4所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:3所不序列； (4)CDRl的序列为SEQ ID NO:39所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO:4所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:40所不序列；和/或 其轻链可变区CDR的序列选自以下(5)~(8)所示序列或其衍生序列: (5)CDRl的序列为SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:9所不序列； (6)CDRl的序列为SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:41所不序列； (7)CDRl的序列为SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO:41所不序列； (8)CDRl的序列为SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列为SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列为SEQ ID NO: 10所不序列。
3.权利要求1或2的抗体或其抗原结合部分，其重链FRl的序列选自SEQID NO: 19~SEQ ID NO:22所示序列或其衍生序列，FR2的序列选自SEQ ID NO:23~SEQ ID NO:25所示序列或其衍生序列，FR3的序列选自SEQ ID NO:26~SEQ ID NO:29所示序列或其衍生序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所示序列或其衍生序列；和/或 其轻链FRl的序列选自SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:32所示序列或其衍生序列，FR2的序列选自SEQ ID NO:33~SEQ ID NO:34所示序列或其衍生序列，FR3的序列选自SEQID NO:35~SEQ ID NO:36所示序列或其衍生序列，FR4的序列选自SEQ ID NO:37~SEQID NO:38所示序列或其衍生序列。
4.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其重链可变区FR的序列选自以下(9)~(12)所示序列或其衍生序列: (9)FRl的序列为SEQID NO: 19所不序列，FR2的序列为SEQ ID NO:23所不的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:26所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所不的序列； (10)FRl的序列为SEQID NO:20所不序列，FR2的序列为SEQ ID NO:24所不的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:27所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所不的序列； (11)FRl的序列为SEQID NO:21所不序列，FR2的序列为SEQ ID NO:23所不的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:28所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所不的序列； (12)FRl的序列为SEQID NO:22所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:25所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:29所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:30所不的序列；和/或 其轻链可变区FR的序列选自以下(13)~(16)所示序列或其衍生序列: (13)FRl的序列为SEQID NO:31所不序列，FR2的序列为SEQ ID NO:33所不的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:35所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:37所不的序列； (14)FRl的序列为SEQID NO:31所不序列，FR2的序列为SEQ ID NO:33所不的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:35所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:38所不的序列； (15)FRl的序列为SEQID NO:32所示序列，FR2的序列为SEQ ID NO:34所示的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:36所不的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:38所不的序列； (16)FRl的序列为SEQID NO:31所不序列，FR2的序列为SEQ ID NO:33所不的序列，FR3的序列为SEQ ID NO:35所示的序列，FR4的序列为SEQ ID NO:37所示的序列。
5.权利要求1-4任一项的抗体或其抗原结合部分，其还包含人IgGl重链恒定区和人K轻链恒定区。
6.权利要求1-4任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合部分为单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、scFv-Fc 二价分子、dAb和互补决定区(CTR)片段、Fab片段、Fab'片段、Fv或F(ab' )2片段。
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
8.载体,其含有权利要求7的核`酸分子。
9.宿主细胞,其含有权利要求7的核酸分子或权利要求8的载体。
10.组合物，其含有权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合部分，以及任选的一种或多种药学可接受的辅料；优选地，所述辅料选自蛋白水解酶抑制剂、药用载体、稀释剂和佐剂。
11.权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合部分、或权利要求7的核酸分子、或权利要求8的载体、或权利要求9的宿主细胞在制备预防/治疗表皮生长因子或表皮生长因子受体相关疾病的药物中的用途；优选地，所述表皮生长因子或表皮生长因子受体相关疾病是指由于表皮生长因子高表达或表皮生长因子受体高表达而引起的疾病；更优选地，所述由于表皮生长因子高表达或表皮生长因子受体高表达而引起的疾病是指恶性肿瘤。
12.检测试剂或试剂盒，其含有权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合部分； 优选地，所述抗体或其抗原结合部分还可包含可检测的标记；或者 优选地，所述检测试剂或试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分；或者 优选地，所述第二抗体还可包含可检测的标记。
13.权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合部分在制备检测试剂或试剂盒中的用途，其中所述检测试剂或试剂盒用于检测表皮生长因子或表皮生长因子受体，或者用于诊断表皮生长因子或表皮生长因子受体相关疾病。
【文档编号】C12N15/13GK103772504SQ201210406288
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月17日 优先权日:2012年10月17日
【发明者】刘劼 申请人:上海津曼特生物科技有限公司