专利名称：火鸡组织滴虫lamp检测试剂盒的制作方法
火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技术快速检测火鸡组织滴虫的试剂盒,并涉及一种使用该种试剂盒快速检测火鸡组织滴虫的方法。
背景技术：
组织滴虫病又称“黑头病”和“盲肠肝炎”，是由火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis)寄生于禽类引起的一种原虫病，以肝脏坏死、盲肠肿大和排硫磺样粪便为主要特征。目前，本病在中国和欧美等很多国家和地区流行严重，部分养殖场由于禽舍严重污染，常导致该病暴发，死亡率达到20-30%，再加上化学药物的治疗费用，造成的经济损失非常严重。
早发现和早治疗对于本病的控制十分重要。为了更好的控制组织滴虫病的传播和发病，并及时采取措施将其造成的经济损失控制在最小的范围，我们必须根据组织滴虫病的特点采取快速检测方案。
组织滴虫病的初步诊断主要依赖于临床症状的观察和剖检，由于肝脏和盲肠的病变有时容易与弧菌性肝炎、肿瘤、球虫病等禽病相混淆，因此建立一种敏感、可靠、实用的实验室诊断方法显得尤为紧迫和重要。目前，已报道的组织滴虫实验室诊断方法有显微镜检查、组织病理学检查、虫体分离培养、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)、 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)等，几种方法均可以直接检测出病料中的组织滴虫病病原，但显微镜检查时病原的形态与四毛滴虫、芽囊原虫等类似易混淆，组织病理学检查费时费力，虫体的分离培养又十分繁琐、耗时等，PCR、ELISA必须配备专用仪器，操作较为繁琐，常有非特异性出现，检测时间至少需要3个小时。与上述几种实验室诊断方法相比，LAMP技术对仪器设备要求不高，操作简单，临床上容易做到，检测时间也较短，不超过3小时，为快速、准确诊断鸡组织滴虫病病原提供了一种新方法。发明内容
本发明的目的就在于克服其他检测方法的缺陷，研制一种火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒及其检测方法。
本发明的技术方案是一种火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒，包括以下成分
( I)反应液 A
含有IOX 等温反应缓冲液、Bst DNA 聚合酶 8000U/mL、IOmM dNTP、25mM MgCl2, 200 μ M内引物、200 μ M内引物2、100 μ M外引物I、100 μ M外引物2、5M甜菜碱和去离子水，其中
10Χ等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(ρΗ8. 8)、IOOmM氯化钾、IOOmM 硫酸铵、20mM 硫酸镁和 1% (m/V)曲拉通 X-100 (pH8. 8,25°C)；
内引物 I 为GAGCCCATGAACTATTGATTTCTCTAGTTCCTACCTTAAACTATGCC (SEQ IDNO. I)
内引物 2 为CTACGACCGCAAGGCTGAAATTAAGCCACAAGCTCCAC(SQE ID NO. 2)
外引物I 为GTATCCAACCGGATCAGAG(SEQ ID NO. 3)
外引物2 为:AAGTTTCCCCGTGTTGAT (SEQ ID NO. 4)
(2)反应液 B :1000X 的荧光染料 SYBR Green I。
本发明的另一技术方案是
一种火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒检测火鸡组织滴虫的方法，其主要技术步骤包括
(I)火鸡组织滴虫的环介导等温扩增
在装有24 μ L反应液A的PCR反应管中加入I μ L待检样品处理液，混匀离心，将 I μ L的反应液B滴在PCR管盖内侧中间,轻轻盖紧管盖(小心操作，以防显色液坠入反应混合液中)，于60-65 °C恒温水浴箱中放置60min。
(2)扩增产物的显色检测
反应结束后颠倒PCR管数次，使反应混合液与反应液B充分混合，肉眼观察反应液颜色，根据反应液的颜色变化判断检测结果。如颜色变为绿色，表明样品中含有火鸡组织滴虫，如颜色为黄色，说明待检样品不含有火鸡组织滴虫。
本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在本发明建立了火鸡组织滴虫 LAMP检测试剂盒及其检测方法，本试剂盒根据火鸡组织滴虫的18SrRNA基因保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为火鸡组织滴虫所共有。本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR 仪，只需普通的金属浴或水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于火鸡组织滴虫的检测，特别适合于基层现场应用。
LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6 个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异，另外，由于实行的是等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于现场快速检测。
本发明解决了现有技术中检测火鸡组织滴虫的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，提供的火鸡组织滴虫的检测试剂盒及其检测方法，对火鸡组织滴虫进行LAMP检测，快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便，可广泛应用于兽医、食品、 出入境检疫领域。
图I是样品检测结果图。I.阳性样品2.阴性样品3.空白对照。
具体实施方式
下列实例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。
实施例I :
按下列配方制作火鸡组织滴虫的环介导等温扩增检测试剂盒
( I)反应液 A
含有IOX 等温反应缓冲液、Bst DNA 聚合酶 8000U/mL、IOmM dNTP、25mM MgCl2, 200 μ M内引物、200 μ M内引物2、100 μ M外引物I、100 μ M外引物2、5M甜菜碱和去离子水，其中
IOX等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(ρΗ8. 8)、IOOmM氯化钾、IOOmM 硫酸铵、20mM 硫酸镁和 1% (m/V)曲拉通 X-100 (pH8. 8,25°C)；
内引物I为
内引物2为
外引物I为
外引物2为GAGCCCATGAACTATTGATTTCTCTAGTTCCTACCTTAAACTATGCC CTACGACCGCAAGGCTGAAATTAAGCCACAAGCTCCAC GTATCCAACCGGATCAGAG AAGTTTCCCCGTGTTGAT
(2)反应液 B =IOOOX 的荧光染料 SYBR Green I。
LAMP反应液A以每管24 μ L计,为2. 5 μ L 10 X等温反应缓冲液、I. O μ L 8U/μ L Bst DNA 聚合酶、2.5yL IOmM dNTP、2yl 25mM MgCl2、I μ L 四种引物混合液、3· O μ L 5Μ 甜菜碱、12 μ L去离子水。
四种引物混合液含有17. 5μ L 200μΜ内引物1、17. 5μ L 200 μ M内引物2、70 μ L 100 μ M外引物l、70yL 100 μ M外引物2、175 μ L去离子水。
实施例2 :利用火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒检测火鸡组织滴虫
待测样本处理液制备以样本取自鸡肝脏为例，发病鸡肝脏作为阳性样品，正常鸡肝脏作为阴性样品，同时设立不含样品的去离子水作为空白对照。
A.取肝脏组织O. 5g，加入ImL的细胞裂解缓冲液(IOOmM pH8. OTris, 500mM pH 8. OEDTA, 20mM NaCL，10%SDS)，于玻璃匀浆器匀浆至浑浊，将浊液置于1.5mL离心管中；
B.加入蛋白酶K (20mg/mL) 20 μ L混勻，于65°C恒温水浴锅中水浴30min ；
C. 12000 Xg离心5min，取上清液入另一离心管中；
D.加入等量的酚氯仿:异戊醇(25:24:1)振荡混匀，12000Xg离心5min，取上层液入另一离心管中；
E.加入十分之一体积的3M醋酸钠和2倍体积的预冷无水乙醇混匀，室温沉淀 2min, 12000 X g 离心 IOmin,去上清；
F.沉淀用800 μ L预冷的75%乙醇洗漆一次后12000 X g,离心5min ；
G.小心倒掉上清液，离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥 2_3min ；
H.将干燥后的沉淀分别加入20 μ L去离水重新溶解，然后置于_20°C保存备用。
检测
(I)鸡组织滴虫病病原的环介导等温扩增
在装有24 μ L反应液A的PCR反应管中分别加入I μ L上述制得的待检阳性样品处理液、正常肝脏组织处理液以及灭菌去离子水，作为阳性对照、阴性对照以及空白对照， 混匀离心，将IyL的反应液B分别滴在PCR管盖内侧中间，盖紧管盖(小心操作，以防显色液坠入反应混合液中)，于60-65°C恒温水浴箱中放置60min ；
(2)扩增产物的显色检测
颠倒PCR管数次，使反应混合液与反应液B充分混合，观察反应液颜色，根据反应液的颜色变化肉眼判断检测结果。阳性对照颜色变为绿色，表明样品中含有火鸡组织滴虫。阴性对照以及空白对照颜色为黄色，说明不含有火鸡组织滴虫。检测试验结果如图I。
实施例3 火鸡组织滴虫LAMP检测方法灵敏度试验
取含有火鸡组织滴虫特异基因的质粒DNA，按10倍比稀释作为LAMP检测试验模板，使每μ L稀释液中含有模板基因拷贝数分别为108，107，106，105，104，103，102，10，1 ;
在装有24 μ L反应液A的PCR反应管中分别加入I μ L上述基因组稀释液，同时设置不加质粒DNA的空白对照,混匀离心,将I μ L的反应液B滴在PCR管盖内侧中间,盖紧管盖于60-65 °C恒温水浴箱中放置60min ；
颠倒PCR管数次，使反应混合液与反应液B充分混合，肉眼观察反应液颜色，结果显示加有质粒DNA的反应管变为绿色，对照管颜色为黄色，说明该试剂盒的检测灵敏度至少为I个基因拷贝。
权利要求
1.一种鸡组织滴虫病LAMP检测试剂盒，包括以下成分 (1)反应液A以每管24PL计，为2.5PL 10 X等温反应缓冲液、I. Ομ 8U/^L Bst DNA聚合酶、2. 5μ IOmM (1ΝΤΡ、2μ1 25mM MgCl2、 μ 四种引物混合液、3. Ομ 5Μ甜菜碱、12μ 去离子水； 其中，IOX等温反应缓冲液含有200mM pH 8. 8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐，IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1% pH8. 8曲拉通X-100 ； 四种引物混合液含有17. 5μ 200μΜ内引物1、17. 5μ 200μΜ内引物2、70μ ΙΟΟμΜ外引物1、70μ ΙΟΟμΜ外引物2、175μ 去离子水； 内引物 I 为GAGCCCATGAACTATTGATTTCTCTAGTTCCTACCTTAAACTATGCC内引物 2 为CTACGACCGCAAGGCTGAAATTAAGCCACAAGCTCCAC外引物 I 为GTATCCAACCGGATCAGAG外引物 2 为AAGTTTCCCCGTGTTGAT (2)反应液B:1000X的荧光染料SYBR Green I。
全文摘要
本发明涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测火鸡组织滴虫的试剂盒。本发明含有10×等温反应缓冲液、BstDNA聚合酶8000U/mL、l0mMdNTP、25mMMgCl2、200μM内引物、200μM内引物2、l00μM外引物1、100μM外引物2、5M甜菜碱和去离子水的反应液A、反应液B(1000X的荧光染料SYBRGreenⅠ)。通过对鸡肝脏组织样品中DNA提取、火鸡组织滴虫的环介导等温扩增、扩增产物的显色检测，从而检测出火鸡组织滴虫。解决了现有技术时间长、工作量大、操作复杂等缺陷。本发明具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于现场快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102925584SQ20121049483
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者许金俊, 曲昌宝, 陶建平, 刘聪, 刘丹丹, 曹李琴, 侯照峰, 宿世杰, 郭平, 李聪, 张祖航 申请人:扬州大学