专利名称：一株氧化葡糖酸杆菌工程菌及其构建方法和在制备木糖醇中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株氧化葡糖酸杆菌工程菌及其构建方法和在制备木糖醇中的应用。
背景技术：
木糖醇由于其甜度与蔗糖相当，可抑制形成龋齿的变形杆菌活力，代谢不依赖胰岛素，并有降低血脂、抗酮体等功能而备受到越来越多的重视。木糖醇是一种优良的功能性甜味剂和重要的平台化合物，在食品、医药、国防和轻工业中具有广泛的应用前景。据预测，国际市场上木糖醇总需求量将达10万吨以上，市场缺口高达40%，可见市场发展空间极大。 目前工业上主要采用化学法生产木糖醇，该工艺以玉米芯为原材料，经过酸水解后分离得到木糖，然后利用化学加氢获得木糖醇。该合成工艺对资源和能源消耗大、环境污染极为严重，不符合当前提倡的绿色环保可持续发展的生产理念。近年来以来源丰富价格低廉的葡萄糖为底物生产木糖醇引起人们的广泛关注，但是到目前为止在自然界中还没有发现直接发酵葡萄糖产木糖醇的微生物。1969年，Onishi等首先报道了通过三步发酵将葡萄糖转化为木糖醇。2000年前后Shunichi等提出通过两步工艺将葡萄糖转化为木糖醇，即首先利用酵母菌将葡萄糖转化为D-阿拉伯糖醇，之后利用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)将D-阿拉伯糖醇氧化还原为木糖醇。葡萄糖发酵生产D-阿拉伯糖醇的工艺已经成熟，转化率可达45%(理论转化率50%)，而由于氧化葡萄糖酸杆菌转化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的低得率限制了该工艺的推广。研究者发现D-阿拉伯糖醇转化生成木糖醇是两个酶催化的过程，第一个为G. oxydans细胞质外膜上的D-阿拉伯糖醇脱氢酶，该酶快速的把D-阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖,转化率接近100% ;第二个为木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase, XDH),该酶负责把前一步生成的木酮糖还原为木糖醇。由于XDH对NADH的专一辅酶依赖性，造成XDH催化木酮糖产木糖醇的效率低下，限制了催化转化流程的高效运转。因此为XDH提供足量的辅酶成为解决这一难题的首选方案。如上说提到的氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)是一种专性好氧的革兰氏阴性菌，属于醋酸杆菌科(Acetobacterceae),其最大的特点是细胞质外膜空间含有众多脱氢酶,能够不完全氧化一系列的醇及糖醇类化合物生成相应的醛、酮或酸，产物不需要通过透膜运输而直接分泌到胞外，从而大大提高了氧化葡萄糖酸杆菌的工业应用价值。氧化葡萄糖酸杆菌不存在糖酵解途径，三羧酸循环途径也不完整，导致了菌体细胞内作为转移磷酸化电子供体的还原力和辅酶NADH的浓度和总量偏低，进而造成催化转化过程中依赖辅酶NADH的XDH活力不高，木糖醇转化率低下。研究发现作为氧化葡糖酸杆菌核心代谢的磷酸戊糖途径可以促进NADH的再生循环和积累，而与之相关的两个关键酶分别由基因gox0145 (亦记做zwf)和goxl705 (或记做gnd)编码，其中zwf合成的葡糖-6-磷酸脱氢酶G6PDH是整个途径的限速酶与代谢阀门。这两个酶都具有对NADP/NAD的双辅酶依赖性，但是在氧化葡糖酸杆菌生理条件下，G6PDH倾向与依赖NADP产生NADPH，6P⑶H倾向于依赖辅酶NAD产生NADH。另有研究表明氧化葡糖酸杆菌胞内存在可以将NADPH转化为NADH由gox0310-0312编码的氢转移酶。以上所述是解决氧化葡糖酸杆菌催化制备木糖醇过程中的辅酶NADH不足的理论基础和实验设计指南。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以利用廉价辅底物产生充足辅酶供给的氧化葡糖酸杆菌工程菌。本发明还要解决的技术问题是提供上述氧化葡糖酸杆菌工程菌的构建方法。本发明最后要解决的技术问题是提供上述氧化葡糖酸杆菌工程菌的应用。 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一株氧化葡糖酸杆菌工程菌，它是导入了葡糖6-磷酸脱氢酶基因gox0145与启动子Ptufe的氧化葡糖酸杆菌，所述的葡糖6-磷酸脱氢酶基因gOX0145位于启动子Ptufe的下游。本发明氧化葡糖酸杆菌工程菌是通过过量表达控制磷酸戊糖途径的关键限制酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6TOH)，提高该途径的代谢通量，进而实现辅酶NADH的循环再生其中，所述的葡糖6-磷酸脱氢酶基因gox0145的核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示。其中，所述的启动子PtufB是tufB基因(the elongation factor EF-Tu)的启动子，核苷酸序列如SEQ IDNo. 2。其中，所述的氧化葡糖酸杆菌为氧化葡糖酸杆菌Gluconobacter oxydans NH_10。该菌株在中国专利CN101948878A中已经公开，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCCNo. 2709，登记日期2008年10月14日。上述氧化葡糖酸杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤(I)设计引物克隆启动子PtufB、葡糖6-磷酸脱氢酶基因gox0145 ；(2)将启动子PtufB序列连接到广宿主型表达载体上，以构建带有启动子的表达载体；(4)将基因gox0145片段连接到启动子的下游构建重组表达载体；(4)将步骤(3)得到的重组表达载体转化氧化葡糖酸杆菌即得重组的辅酶循环途径加强型氧化葡糖酸杆菌菌株Gluconobacter oxydans pnadh_5。步骤(2)中，所述的广宿主型表达载体为pBBRlMCS-5。本发明所述的工程菌的主要代谢途径如图4所示。上述氧化葡糖酸杆菌工程菌在转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇中的应用。具体方法是，将氧化葡糖酸杆菌工程菌经种子培养后接种于摇瓶或发酵罐，发酵后离心收获菌体；将所得菌体加入到D-阿拉伯糖醇转化体系中，利用菌体静息细胞实现转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇。对于摇瓶转化体系，D-阿拉伯糖醇转化体系中，D-阿拉伯糖醇浓度为2(T50g/L，0. IM pH6. O的磷酸钾缓冲液作为反应介质，菌体加入量为5 15(w/v)%，温度25 35°C ;采用两阶段通气法，第一阶段，摇瓶转速20(T240rpm，反应8 14h，第二阶段加入5 20g/L葡萄糖作为辅底物，控制PH在5. 5 6. 5，摇瓶转速降低到4(T80rpm，反应5(T70h。对于发酵罐转化体系，D-阿拉伯糖醇转化体系中，D-阿拉伯糖醇浓度为4(T60g/L，0. IM pH6.0的磷酸钾缓冲液作为反应介质，并全程控制pH在5. 5飞.5，菌体加入量为1(T15(W/V)%，温度25 35°C ;采用两阶段通气法，第一阶段氧化反应，搅拌桨转速40(T600rpm通气量I I. 2vvm时长5 9h ;第二阶段还原反应，补加5 20g/L葡萄糖作为辅底物提供还原力，搅拌桨转速15(T200rpm，停止通入空气或者改通入一定量氮气，该阶段反应4(T60h。氧化葡糖酸杆菌工程菌的发酵培养条件如下摇瓶发酵分别以RSM/YPG培养基，在摇瓶中加入适量培养基，优化调节温度和摇床转速，YPG培养基中加入碳酸钙调控pH。发酵罐发酵YPG培养基，发酵温度28 33° C，ρΗ5· 9 6. I。种子培养基和斜面培养基(g/L):葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨3 ;固体培养基中琼脂添加量I. 5%。YPG培养基(g/L):葡萄糖30，酵母粉10，山梨醇10，硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁微量。培养基调节ρΗ6. (Γ6. 5后，121° C高温灭菌；用来培养重组菌的培养基温度降至5(T60° C时加入相应浓度的庆大霉素50 μ g/L和头孢霉素25 μ g/L。关键酶酶活测定方法酶活单位定义为25° C时，每分钟生成I μ mo I的NADH或者NAD所需的酶量。酶活测定反应体系(Iml) 5mmo 1/L的NAD+溶液，O. lmol/L的底物溶液及lOOmmol/L pH7. O磷酸钠缓冲液。D-阿拉伯糖醇、D-木酮糖、木糖醇的含量测定高效液相色谱法，色谱条件Agilent HPLC,不差折光检测器(Shodex RI-101),色谱柱为 Rezex:RCM_MonosaccharideCa2+ (Phenomenex, USA),柱温 80° C,流动相为纯水，流速 0. 5mL/min。显著效果研究数据显示本发明的工程菌静息细胞制备木糖醇的转化率可以达到60%-90%，而原始菌细胞制备效率不足25%。本发明方法较好地解决了生物转化法制备木糖醇存在的转化率不高，木糖醇浓度低的难题，并且具有操作简便、经济适用、节能环保等诸多优点。
图I重组表达载体构建流程示意图。图中所示的质粒pRtB-zwf所指即构建的表达载体 pBBR-PtufB-gox0145。图2关键酶基因gox0145基因克隆与质粒验证。Lane M 5000bp DNA标准marker ；Lanel: gox0145PCR 片段；Lane2&3 gox0145 连接 pMD_18T 载体克隆验证。图3克隆和双酶切验证表达载体的构建。Lane M : 2000bp和15000bp标准DNAmarker ;克隆验证:Lanel, PtufB ；Lane2, gox0145 ；Lane3, PtufB+gox0145;双酶切验证Lane4, Kpn I 和 BamH I 酶切表达质粒 pBBR-PtutB-gox0145。图4氧化葡糖酸杆菌工程菌的磷酸戊糖途径辅酶循环再生过程与木糖醇转化制备的关系不意图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :表达载体的构建。根据NCBI 数据库 Gluconobacter oxydans621H 基因组注释的 PtufB、gox0145 基因序列设计引物克隆各基因片段，所采用的引物序列见表I ;表I
权利要求
1.一种氧化葡糖酸杆菌工程菌，其特征在于，该菌是导入了启动子ptufB和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因gox0145的氧化葡糖酸杆菌，所述基因gox0145位于启动子Ptufe的下游，受其调控节制。
2.根据权利要求I所述的氧化葡糖酸杆菌工程菌，其特征在于，所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因gox0145的核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示。
3.根据权利要求I所述的氧化葡糖酸杆菌工程菌，其特征在于，所述的启动子PtufB是tufB基因的启动子，核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
4.根据权利要求I所述的氧化葡糖酸杆菌工程菌，其特征在于，所采用的起始受体菌株为氧化葡糖酸杆菌Gluconobacter oxydans NH-10。
5.权利要求I所述的氧化葡糖酸杆菌工程菌的构建方法，其特征在于如下步骤 (1)设计引物克隆启动子PfufB、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因gox0145； (2)将启动子Pt-序列连接到广宿主型质粒上，以构建带有启动子的表达载体； (3)将基因gox0145片段连接到启动子的下游构建重组表达载体； (4)将步骤(3)得到的重组表达载体转化氧化葡糖酸杆菌即得。
6.根据权利要求5所述的氧化葡糖酸杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的广宿主型表达载体为pBBRlMCS-5。
7.权利要求I所述的氧化葡糖酸杆菌工程菌在转化D-阿拉伯糖醇高效制备木糖醇中的应用技术。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将氧化葡糖酸杆菌工程菌经种子培养后接种于摇瓶或发酵罐，发酵后离心收获菌体；将所得菌体加入到D-阿拉伯糖醇转化体系中，利用菌体静息细胞实现转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，对于摇瓶转化体系，D-阿拉伯糖醇转化体系中，D-阿拉伯糖醇浓度为2(T50g/L，0. IM pH6. 0的磷酸钾缓冲液作为反应介质，菌体加入量为5 15(w/v) %，温度25 35°C ;采用两阶段通气法，第一阶段，摇瓶转速20(T240rpm，反应8 14h，第二阶段加入5 20g/L葡萄糖作为辅底物，控制pH在5. 5^6. 5，摇瓶转速降低到40 80rpm，反应50 70h。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，对于发酵罐转化体系，D-阿拉伯糖醇转化体系中，D-阿拉伯糖醇浓度为4(T60g/L，0. IM pH6. 0的磷酸钾缓冲液作为反应介质，并全程控制pH在5. 5飞.5，菌体加入量为1(T15(W/v)%，温度25 35°C ;采用两阶段通气法，第一阶段氧化反应，搅拌桨转速40(T600rpm通气量1 1. 2vvm时长5 9h ;第二阶段还原反应，补加5 20g/L葡萄糖作为辅底物提供还原力，搅拌桨转速15(T200rpm，停止通入空气或者改通入一定量氮气，该阶段反应4(T60h。
全文摘要
本发明公开了一种氧化葡糖酸杆菌工程菌构建方法，该方法是通过过量表达控制磷酸戊糖途径的关键限制酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)，提高该途径的代谢通量，进而实现辅酶NADH的循环再生。本发明还公开了上述工程菌的发酵工艺及其在转化制备木糖醇中的应用。本发明所述的工程菌转化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的效果较出发菌株具有明显优势，木糖醇对D-阿拉伯糖醇的转化率可达60-90%。该技术在一定程度上解决了生物转化法制备木糖醇存在的转化率不高，木糖醇浓度低的难题，并且具有经济适用、操作简便、节能环保的优点。
文档编号C12N15/53GK102978148SQ20121054999
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者徐虹, 张金亮, 李莎, 冯小海 申请人:南京工业大学