专利名称：一种变形链球菌的双重pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及一种变形链球菌的双重PCR快速检测方法。
背景技术：
龋病是人类最普遍的疾病之一，发病率高，WHO将其与癌症和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。世界卫生组织最新发布的《全球口腔健康报告》中，估计全球63亿人口有50亿人患过龋齿，在发达国家中60% 90%的学龄儿童和大部分成人患过龋齿，在我国成人发病率为50 %，儿童则高达70 % 90 %，它已然成为威胁人类口腔健康的全球性问题。龋病是含糖食物(特别是蔗糖)进入口腔后，在牙菌斑内经致龋菌的作用，发酵产酸，这些酸(主要是乳酸)从牙面结构薄弱的地方侵入，溶解破坏牙的无机物而产生的。变形链球菌(S. Mutans)是人类主要的致龋微生物，它在口腔中的定植与龋病的发生密切相关(张志愿.《口腔科学》，人民卫生出版社，第七版，2008年，48;岳松龄.《现代龋病学》，科学技术文献出版社，2009年，53-54.)。因此，鉴定口腔S. Mutans的感染，对龋病的早期诊断及防治都具有重要意义。目前已发现定植于口腔的细菌有700余种，要从众多的细菌中找到一种既简单又准确的方法鉴别s. Mutans显得尤为重要。目前检测S. Mutans方法主要有微生物学方法、免疫学方法、生物芯片技术和分子生物学方法等。①微生物学检测方法，均需分离养基S. Mutans, 口腔细菌种类繁多，通常需要用选择性培养基才能分离培养，目前最常用的轻唾杆菌肽培养基(MSB)也不能有效的将S. Mutans与口腔链球菌群中的许多细菌(如远缘链球菌、血链球菌、唾液链球菌、缓症链球菌、非解乳链球菌、多动链球菌、变异库克菌等)分开。②免疫学方法，有多克隆抗 体技术和单克隆抗体技术，由于前者所使用的抗体来自多个克隆，难以分离提纯，目前已被单克隆抗体技术所取代。后者准确度虽于PCR相似，但抗体的制备过程十分不易，耗时很长。③生物芯片技术将大量的基因探针、基因片段或抗原(抗体)按特定方式固定的排列在特制的载体(如玻片)上，在特定条件下与待检样品进行作用，通过精密的扫描仪器进行记录、检测和分析的一种技术，该技术灵敏度高但仪器和探针价格昂贵，而且操作复杂。④分子生物学方法，常用的有DNA杂交技术和PCR。DNA杂交技术是通过不同细菌DNA碱基顺序同源性对细菌种属间的亲缘关系作出分类鉴定，尤其对一个新菌，或对表型性状差别小，难以识别菌株的分类鉴定更有价值。因此根据血清特异性基因序列设计特异性PCR引物鉴别S. Mutans的不同血清型，与传统方法相比，具有简单、快速、可靠、特异性好的优点。PCR基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成，DNA模板一引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的DNA。2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。研究表明，S. Mutans spaP基因表达的Agl/II可以促进其定植能力，在S. Mutans株的c和f 两个血清型中可克隆出spaP基因。虽然从其它链球菌也发现相似的抗原，但spaP基因仍然最有可能是变形链球菌属的特异性基因(LaPolla RJ，Haron JA, KellyCGetal. Sequence and structural analysis of surface protein antigenl/11 (SpaA)of Streptococcus sobrinus.1nfect Immunl991; 59 :2677-2685),而且用 spaP 特异性结合的探针检测S. Mutans比用通常的gtfB和ftf基因探针检测更敏感(Smorawinska M,Kuramitsu HK. DNA probes for detection of cariogenic Streptococcus mutans. OralMicrobiol Immunol1992;7 177-181.)。S. Mutans dex基因的产物是葡聚糖酶，葡聚糖酶通过切断a_l，6_键使葡聚糖中a-l，3_键与a-1，6-键的比例增加，以增加葡聚糖的非水溶性及粘附性，是龋病发生的重要因素之一。S. Mutans的葡聚糖酶dex基因和其他能够产生葡聚糖酶的口细菌的dex基因差异较大° Igarashi 等(Igarashi T, Yamamoto A, Goto N. Microbiol Immunol, 2001, 45
(5):341-348.)比较了变形链球菌群 S. mutans、S. sobrinus、S. downe1、S. salivarius 的dex分子结构发现4种菌的dex均含有I个N-末端信号肽、2个可变区和I个保守区，保守区同源性高，可变区同源性低。S. Mutans的dex基因具有特征性的原核生物核糖体结合位点和启动子序列，核糖体结合位点与起始密码子之间的距离要远大于已知的变形链球菌群的其他基因。这些均表明S.Mutans dex基因适合用于设计特异性的PCR引物，用以鉴别变形链球菌群的其他菌种(胡晓燕.变形链球菌分子生物学鉴定技术新进展[J].国际口腔医学杂志，2006, 33 (5) : 346-348. )。Igarashi 等(Igarashi T, Asaga E, MuraiC, etal. Lett Appl Microbiol, 2004, 38 (2):125-129.)针对 S. Mutans (S. mutans)、表兄链球菌(S. sobrinus)、汗毛链球菌(S. downei)的dex基因设计菌种特异性引物,直接对临床分离株进行PCR检测，不同菌种特异性引物的混合扩增性片段，成功鉴别S. mutans、
S.sobrinus、S. downei,显示出根据dex基因设计特异性引物的良好鉴别力。
所以dex和spaP基因都是S. mutans鉴定的良好祀点，选择dex和spaP基因的特异性片段设计引物，通过PCR来鉴别S. Mutans,可以使检测更敏感，准确性更高，而且操作简单。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种S.Mutans的双重PCR快速检测方法，可快速、准确检测口腔标本或培养物中的S.Mutans，为研究龋齿及牙周病的发病机制、临床监测龋齿及牙周病的病情变化、确定治疗方案提供重要依据。本发明还提供根据上述检测方法设计的试剂盒。一种变形链球菌(S. Mutans)的双重PCR快速检测方法，其特征在于，采用双重PCR扩增口腔标本或培养物中的S. Mutans特异性基因片段，所述双重PCR扩增反应体系中含有如下引物dex F :5，-TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC-3，，dex R :5’ -TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT-3’，spaP F:5， -AACGACCGCTCTTCAGCAGATA-3，，
spaP R :5’ -AGAAAGAACATCTCTAATTTCT-3’。所述双重PCR扩增反应体系为总体积为50 iil，各组分及含量如下5iU的10XPCR Buffer，3 浓度为25mM的MgCl2,共4 ill浓度各为2. 5mM的dNTP混合物，各2 的引物，0. 25 浓度为5U/ U I的DNA聚合酶，5 u I模板，24. 75 U I的灭菌蒸馏水。双重PCR扩增反应的循环参数为94°C预变性5min ;94°C变性15s，50°C退火15s，72°C延伸30s，30个循环；72°C完全延伸5min。所述口腔标本或培养物中的S. Mutans特异性基因片段的获得通过下述方法采集牙菌斑或挑取牙菌斑培养物，用试剂盒提取DNA作为模板。一种检测变形链球菌(S. Mutans)的试剂盒，含有如下引物dex F :5，-TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC-3，，dex R :5’ -TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT-3’，spaP F:5’ -AACGACCGCTCTTCAGCAGATA-3’，spaP R:5， -AGAAAGAACATCTCTAATTTCT-3，。所述的试剂盒，含有如下组分及其含量5 ill 的 10XPCR Buffer, 3 U I 浓度为 25mM 的 MgCl2,共 4 浓度各为 2. 5mM 的dNTP混合物，各2 u I的引物，0. 25 U I浓度为5U/ U I的DNA聚合酶，24. 75 U I的灭菌蒸馏水。本发明的双重PCR扩增口腔标本或培养物中的S. Mutans特异性基因片段，具体包括如下步骤I) DNA模板制备，具体步骤如下采集牙菌斑或挑取牙菌斑培养物，用试剂盒或其他方法提取DNA作为模板。2)双重PCR扩增伴S. Mutans特异性基因片段，具体步骤如下反应体系总体积为50 U I
权利要求
1.一种变形链球菌(S. Mutans)的双重PCR快速检测方法，其特征在于，采用双重PCR扩增口腔标本或培养物中的S. Mutans特异性基因片段，所述双重PCR扩增反应体系中含有如下引物dex F :5，-TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC-3，，dex R:5’ -TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT-3’，spaP F :5’ -AACGACCGCTCTTCAGCAGATA-3’，spaP R:5’ -AGAAAGAACATCTCTAATTTCT-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，所述双重PCR扩增反应体系为 总体积为50 iil，各组分及含量如下5iil的10XPCR Buffer，3 ill浓度为25mM的MgCl2,共4 ill浓度各为2. 5mM的dNTP混合物，各2 的引物，0. 25 浓度为5U/ U I的DNA聚合酶，5 u I模板，24. 75 U I的灭菌蒸馏水。
3.根据权利要求2所述的方法，双重PCR扩增反应的循环参数为94°C预变性5min；94°C变性15s，50。。退火15s，72。。延伸30s, 30个循环；72°C完全延伸5min。
4.根据权利要求1所述的方法，所述口腔标本或培养物中的S.Mutans特异性基因片段的获得通过下述方法采集牙菌斑或挑取牙菌斑培养物，用试剂盒提取DNA作为模板。
5.一种检测变形链球菌(S. Mutans)的试剂盒，含有如下引物 dex F :5，-TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC-3，，dex R:5’ -TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT-3’，spaP F :5’ -AACGACCGCTCTTCAGCAGATA-3’，spaP R:5’ -AGAAAGAACATCTCTAATTTCT-3’。
全文摘要
本发明公开了一种变形链球菌的双重PCR快速检测方法，属于分子生物学技术领域。利用PCR方法扩增变形链球菌的特异基因片段，通过核酸电泳观察扩增结果。本发明通过针对变形链球菌spaP和dex两个基因的特异片段设计引物spaP F和spaP R、dex F和dex R，使得双重PCR快速检测中反应条件稳定，敏感性及特异性都强，能准确判断变形链球菌的感染。
文档编号C12Q1/68GK103060442SQ201210558739
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年11月21日
发明者刘开云, 邹全明, 郭刚, 张卫军, 孙红武, 付启欢, 付强, 程子洋, 樊绍文, 卢陆 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学