专利名称：一种培养重组禽流感病毒h5n1亚型的方法
技术领域：
本发明涉及生物制品技术领域，具体地涉及一种高密度细胞培养技术培养重组禽流感病毒H5N1亚型的方法。
背景技术：
目前，我国重组·禽流感病毒H5N1亚型的培养方式主要是9 11日龄健康鸡胚培养，该培养方法是通过将病毒接种到鸡胚尿囊腔中进行病毒繁殖，虽然其操作技术简单且技术成熟稳定，但与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现为:(1)生产周期长，难以在短时间内实现大规模的疫苗抗原生产；(2)受鸡胚等原辅材料的限制；(3)生产工艺落后，劳动力密集，生产成本高。我国也有报道采用MDCK细胞培养技术培养重组禽流感病毒H5N1亚型的方法，但绝大多数为转瓶培养，生产效率低下，不能满足实际生产的需求。专利CN 101979517A公开了一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法。包括I)将MDCK细胞接种到潮汐式生物反应器载体罐内的载体上，进行细胞的吸附培养；2)进行细胞的扩增培养；3)将H5N3亚型流感病毒接种到扩增培养的细胞上，进行病毒的吸附培养；4)进行病毒的增殖培养；5)在病毒含量达到峰值后,收获含有流感病毒的培养液。而对于重组禽流感病毒H5N1亚型，现有的生产技术均为鸡胚培养，不适合未来发展的需要。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的是提供重组禽流感病毒H5N1亚型大规模培养的方法。为实现上述目的，本发明利用朝夕式高密度细胞培养系统进行重组禽流感病毒H5N1亚型的大规模培养，该方法包括如下步骤:(I)将MDCK细胞接种潮汐式高密度细胞培养系统，并加入细胞生长液进行培养。(2)将所述步骤(I)所得到的细胞接种含重组禽流感病毒H5N1亚型的病毒生长液，进行病毒的培养。(3)接毒后2 4天收获所述步骤(2)得到的病毒生长液。其中，上述方法使用的潮汐式高密度细胞培养系统已含细胞培养载体。所述重组禽流感病毒H5N1亚型包括重组禽流感病毒H5N1亚型Re-1株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re_5株和重组禽流感病毒H5N1亚型Re~6 株。优选的，所述步骤(I)中的潮汐式高密度细胞培养系统为TideCelP潮汐式高密度细胞培养系统。包括TideCell-OlO系统、TideCell-020系统和TideCell-1OO系统等。该高密度细胞培养系统设计简单，占用空间小，生产效率高，细胞培养密度可达107Cell/ml。优选的，所述步骤(I)中将所述的潮汐式高密度细胞培养系统和细胞培养载体经消毒灭菌后(或为含细胞培养载体的一次性灭菌反应瓶)接种所述MDCK细胞，并加入细胞生长液进行培养。优选的，所述步骤(I)中的培养温度为37°C，含CO2量为5%。优选的，所述步骤(I)中的细胞生长液含95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清，所述细胞生长液的PH值为7.0 7.4。优选的，所述步骤(2)中的培养温度为34°C，含CO2量为5%。优选的，所述步骤(2)中接种时的病毒接种量为含禽流感病毒MOI是1(Γ4 1(Γ6的病毒生长液。优选的，所述步骤(2)中的病毒生长液含5 μ g/ml质量体积比的TPCK处理胰酶、
0.2%体积百分比的牛血清白蛋白组分V的DMEM液，所述病毒生长液的PH值为7.0 7.4。本发明中的重组禽流感病毒H5N1亚型为以流感病毒PR/8的6个内部基因为供体重新构建的一系列的H5N1亚型禽流感病毒。包括重组禽流感病毒H5N1亚型Re-1株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re_5株和重组禽流感病毒H5N1亚型Re-6株。H5N3亚型为禽流感病毒的另外一种亚型，其在MDCK细胞中的培养条件与重组禽流感病毒H5N1亚型具有明显的区别，在现有的H5N3亚型培养基础上培养重组禽流感病毒H5N1亚型不能达到生产的要求。本发明经过优化病毒接种条件、接种病毒浓度、病毒培养温度等培养条件后，能够符合重组禽流感病毒H5N1亚型的生产需求。本发明的有益效果:本发明提供了利用细胞大规模培养技术生产重组禽流感病毒H5N1亚型的方法，为我国H5亚型禽流感的防控提供了新的技术。重组禽流感病毒H5N1亚型包括Re-1株，Re-4株、Re-5 株以及Re-6株，采用这些毒株生产的疫苗均在不同时期为我国H5亚型禽流感疫病的防控起到了重要的作用，保护了人民的人身及财产安全。利用潮汐式高密度细胞培养系统进行重组禽流感病毒H5N1亚型的大规模培养，极大的提高了禽流感病毒的生产技术工艺，在生产中具有潜在的优势和巨大的应用价值。具体表现为缩短了禽流感疫苗研发和生产周期；减少了对鸡胚等原辅材料的限制；提高生产效率，降低生产成本。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1重组禽流感病毒H5N1亚型Re-1株的大规模培养(I)选择MDCK细胞作为病毒悬浮培养用细胞。(2)选择潮汐式高密度细胞培养系统:TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统。(3)利用TideCell-ΟΙΟ潮汐式高密度细胞培养系统进行MDCK细胞灌注式悬浮培养:TideCell-OlO潮汐式高密度细胞培养系统接种10000ml适宜浓度的细胞(I 4X106Cells/ml)。将细胞培养瓶连接含40000ml细胞生长液的培养袋(液体罐)进行培养。细胞生长液培养为95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清，PH值为7.2 7.4。通过调节细胞培养系统中各培养条件:溶氧量为50% 100%、C02浓度为5%、葡萄糖含量为500 4500mg/L和PH值为7.2 7.4，细胞培养温度37°C，培养高密度的MDCK细胞。培养至第2天，以每天灌注I个工作体积的速率进行灌注式培养，共培养4 6天。(4)重组禽流感病毒H5N1亚型Re-1株的大规模培养:将潮汐式高密度细胞培养系统的细胞生长液弃去，用PBS清洗3遍后，接种含适量病毒的病毒生长液(含重组禽流感病毒H5N1亚型Re-1株MOI为10_6，5 μ g/ml质量体积比的TPCK处理胰酶、0.2%体积百分比的牛血清白蛋白组分V的DMEM液，PH值为7.2 7.4，病毒培养温度为34°C，继续培养。(5)接种后2 4天一次性无菌收获病毒生长液。实施例2重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株的大规模培养(I)选择MDCK细胞作为病毒悬浮培养用细胞。(2)选择潮汐式高密度细胞培养系统:TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统。(3)利用TideCell-ΟΙΟ潮汐式高密度细胞培养系统进行MDCK细胞灌注式悬浮培养:TideCell-OlO潮汐式高密度细胞培养系统接种10000ml适宜浓度的细胞(I 4X106Cells/ml)。将细胞培养瓶连接含40000ml细胞生长液的培养袋(液体罐)进行培养。细胞生长液培养为95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清，PH值为7.2 7.4。通过调节细胞培养系统中各培养条件:溶氧量为50% 100%、C02浓度为5%、葡萄糖含量为500 4500mg/L和PH值为7.2 7.4，细胞培养温度37°C，培养高密度的MDCK细胞。培养至第2天，以每天灌注I个 工作体积的速率进行灌注式培养，共培养4 6天。(4)重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株的大规模培养:将潮汐式高密度细胞培养系统的细胞生长液弃去，用PBS清洗3遍后，接种含适量病毒的病毒生长液(含重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株MOI为10_4，5 μ g/ml质量体积比的TPCK处理胰酶、0.2%体积百分比的牛血清白蛋白组分V的DMEM液，PH值为7.2 7.4，病毒培养温度为34°C，继续培养。(5)接种后2 4天一次性无菌收获病毒生长液。 实施例3重组禽流感病毒H5N1亚型Re_5株的大规模培养(I)选择MDCK细胞作为病毒悬浮培养用细胞。(2)选择潮汐式高密度细胞培养系统:TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统。(3)利用TideCell-ΟΙΟ潮汐式高密度细胞培养系统进行MDCK细胞灌注式悬浮培养:TideCell-OlO潮汐式高密度细胞培养系统接种10000ml适宜浓度的细胞(I 4X106Cells/ml)。将细胞培养瓶连接含40000ml细胞生长液的培养袋(液体罐)进行培养。细胞生长液培养为95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清，PH值为7.2 7.4。通过调节细胞培养系统中各培养条件:溶氧量为50% 100%、C02浓度为5%、葡萄糖含量为500 4500mg/L和PH值为7.2 7.4，细胞培养温度37°C，培养高密度的MDCK细胞。培养至第2天，以每天灌注I个工作体积的速率进行灌注式培养，共培养4 6天。
(4)重组禽流感病毒H5N1亚型Re_5株的大规模培养:将潮汐式高密度细胞培养系统的细胞生长液弃去，用PBS清洗3遍后，接种含适量病毒的病毒生长液(含重组禽流感病毒H5N1亚型Re-5株MOI为10_5，5 μ g/ml质量体积比的TPCK处理胰酶、0.2%体积百分比的牛血清白蛋白组分V的DMEM液，PH值为7.2 7.4，病毒培养温度为34°C，继续培养。(5)接种后2 4天一次性无菌收获病毒生长液。实施例4重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株的大规模培养(I)选择MDCK细胞作为病毒悬浮培养用细胞。(2)选择潮汐式高密度细胞培养系统:TideCell-010潮汐式高密度细胞培养系统。(3)利用TideCell-ΟΙΟ潮汐式高密度细胞培养系统进行MDCK细胞灌注式悬浮培养:TideCell-OlO潮汐式高密度细胞培养系统接种10000ml适宜浓度的细胞(I 4X106Cells/ml)。将细·胞培养瓶连接含40000ml细胞生长液的培养袋(液体罐)进行培养。细胞生长液培养为95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清，PH值为7.2 7.4。通过调节细胞培养系统中各培养条件:溶氧量为50% 100%、C02浓度为5%、葡萄糖含量为500 4500mg/L和PH值为7.2 7.4，细胞培养温度37°C，培养高密度的MDCK细胞。培养至第2天，以每天灌注I个工作体积的速率进行灌注式培养，共培养4 6天。(4)重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株的大规模培养:将潮汐式高密度细胞培养系统的细胞生长液弃去，用PBS清洗3遍后，接种含适量病毒的病毒生长液(含重组禽流感病毒H5N1亚型Re-6株MOI为10_6，5 μ g/ml质量体积比的TPCK处理胰酶、0.2%体积百分比的牛血清白蛋白组分V的DMEM液，PH值为7.2 7.4，病毒培养温度为34°C，继续培养。(5)接种后2 4天一次性无菌收获病毒生长液。实施例5重组禽流感病毒H5N1亚型的效果检测(I)病毒血凝素(HA)效价的检测:将病毒液作2倍系列稀释，按微量法进行HA效价测定。(2)细胞半数感染量(TCID5tl)的测定:将毒种用含有5μ g/mlTPCK处理胰酶的维持液作10倍系列稀释，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ,δ个稀释度，每个稀释度接种生长成良好MDCK细胞单层的96孔培养板6孔，每孔接种100 μ 1，置34°C培养观察，同时设正常细胞对照。至96小时逐孔分别测定HA效价，HA ^ 41og2判为感染。结果如表I所示。表I病毒血凝素效价和细胞半数感染量的检测结果
权利要求
1.一种重组禽流感病毒H5N1亚型的大规模培养的方法，包括如下步骤: (1)将MDCK细胞接种潮汐式高密度细胞培养系统，并加入细胞生长液进行培养。
(2)将所述步骤(I)所得到的细胞接种含重组禽流感病毒H5N1亚型的病毒生长液，进行病毒的培养。
(3)接毒后2 4天收获所述步骤(2)得到的病毒生长液。
其中，上述方法使用的潮汐式高密度细胞培养系统已含细胞培养载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中的潮汐式高密度细胞培养系统为TideCe丨广潮汐式高密度细胞培养系统，包括TideCell-ΟΙΟ系统、TideCell-020系统或TideCell-1OO 系统。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的重组禽流感病毒H5N1亚型为以流感病毒PR/8的6个内部基因为供体重新构建的一系列的H5N1亚型禽流感病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组禽流感病毒H5N1亚型包括重组禽流感病毒H5N1亚型Re-1株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re_4株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re-5株和重组禽流感病毒H5N1亚型Re_6株。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中的培养温度为37°C，CO2含量为5% ο
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中的细胞生长液为95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清。
7.根据权利要求1所述的方`法，其特征在于，步骤(2)中的培养温度为34°C，CO2含量为5% ο
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中接种时的病毒接种量为含禽流感病毒M0I10 4 10 6的病毒生长液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的病毒生长液为5μg/ml质量体积比的TPCK处理胰酶、0.2%体积百分比的牛血清白蛋白组分V的DMEM液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的细胞生长液和步骤(2)中的病毒生长液的PH值为7.0 7.4。
全文摘要
本发明涉及一种高密度细胞培养技术培养重组禽流感病毒H5N1亚型的方法。包括如下步骤(1)将MDCK细胞接种潮汐式高密度细胞培养系统，并加入细胞生长液进行培养。(2)将所述步骤(1)所得到的细胞接种含重组禽流感病毒H5N1亚型的病毒生长液，进行病毒的培养。(3)接毒后2～4天收获所述步骤(2)得到的病毒生长液。利用潮汐式高密度细胞培养系统进行重组禽流感病毒H5N1亚型的大规模培养，极大的提高了禽流感病毒的生产技术工艺，在生产中具有潜在的优势和巨大的应用价值。
文档编号C12N7/01GK103103164SQ201310027108
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者王贺民, 黄文强, 丁献红, 万桂青, 周蕾蕾, 严石, 陈秋阁, 李爱君, 李浩鹏, 张翼 申请人:乾元浩生物股份有限公司, 中国牧工商(集团)总公司