专利名称：一种cyp2c19基因多态性检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及多重基因检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
细胞色素P450 (CYP)酶系在药物代谢中占有极其重要地位。CYP2C19 (S-美芬妥英羟化酶)是CYP酶系中占主导地位的酶之一，其遗传多态性影响着许多临床药物的代谢，其活性存在明显的个体差异，对不同个体的药物治疗作用和不良反应及药物的毒性产生重要影响。FDA已将17种药物列入医生需要参考病人的CYP2C19的基因多态性信息用药。临床上CYP2C19基因多态性检测可以为个体化用药提供依据。目前，国内外已有多个CYP2C19基因型检测试剂盒，其主导方法为DNA微阵列芯片法。基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。DNA芯片:由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测。其优点是I)高通量并行检测；2)操作简便快速:整个检测只需4-8小时基本可以出结果。但也存在如下缺点:1)不同SNP位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制；2)技术成本昂贵、复杂:每个样品需要一个芯片，成本大于Y1000/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3)重复性差，准确性低，易出现假阳性、假阴性结果；4)灵敏度较低:芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5)由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。Gen0meLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记,在同一个EP管中同时分析多个基因的的等位基因型,能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下优点:1、高通量:本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测30种腹泻病毒，30个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。2、准确性强=GeXP系统采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；3、敏感性高，结果重复性好:GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目 的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超闻灵敏度；
4、方法简便，使用经济=GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；5、精确定量、灵活性强:可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。6、易于实现自动化:就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的CYP2C19基因多态性检测试剂盒及其检测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的CYP2C19基因多态性检测试剂盒及其检测方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括超纯水、X溶液、10XPCR缓冲液，PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的PCR引物包括以下CYP2C19基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如下表I所示:表I
权利要求
1.一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括超纯水、X溶液、IOXPCR缓冲液，PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的PCR引物包括以下CYP2C19基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如下表所示:
2.根据权利要求1所述的一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于:包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增弓I物序列为AGGTGACACTATAGAATA ；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增弓I物带荧光标记。
3.根据权利要求1所述的一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照品为克隆到载体PMD18-T上的7个DNA片段和I个质粒pcDNA3.1 (+)，所述的7个DNA片段分别为包含有SNP位点上rs4244285的G型基因和A型基因、rs4986893的G型基因和A型基因、rsl2248560的C型基因和T型基因及人类基因beta-globin的片段。
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的CYP2C19基因多态性检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤: (1)DNA样品的收集和提取 将刮取到口腔上皮细胞的口腔拭子放入300y L DNA裂解缓冲液中，在恒温混匀仪中于95° C，IOOOrpm的条件下，处理5分钟后取出，室温放置至冷却，然后在样品中加入30 y L提取缓冲液，混匀，12000g离心5分钟，得到的上清液即为PCR的DNA样品模板； (2)以提取的核酸为模板进行PCR反应 取DNA样品9.3 ii L，10 X PCR缓冲液2 y L，25mM的氯化镁4 y L，PCR弓丨物溶液2 y L，DNA聚合酶0.7 ii L，X溶液2 ii L混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件:94° Cl分钟；94° C30秒钟，60° C30秒钟，70° Cl分钟，循环35次；70° Cl分钟；4° C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA ;反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记，PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM ;所述的PCR引物包括以下CYP2C19基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如序列表中SEQ IDN0.1 N0.13 所示； (4)GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品 取PCR产物0.1-1 u L，，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液30 u L，DNA标准品0.2 y L，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得CYP2C19基因的SNP位点的等位基因型。
全文摘要
本发明公开了一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括超纯水、X溶液、10×PCR缓冲液，PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，特点是PCR引物包括CYP2C19基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如SEQ IDNO.1～NO.13所示，其检测包括采集样本并提取核酸的步骤；以患者核酸为模板进行PCR反应的步骤；最后GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品的步骤，优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。
文档编号C12Q1/68GK103074434SQ20131003321
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者南丽, 孙婷婷, 吴勇 申请人:海尔施生物医药股份有限公司