用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌的制作方法【专利摘要】本发明公开了一种用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。本发明提供的DNA分子，包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因，由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达。本发明提供了一个能稳定、大量地表达D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的DNA分子、以及基于该DNA分子的重组载体和重组菌。同时本发明还提供了应用所述重组菌或该重组菌的发酵物将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的方法，只生成D-对羟基苯甘氨酸，无需拆分分离对映体，转化率高，整个生产过程具有条件温和、操作简单、对环境友好的优点。【专利说明】用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌【
技术领域：
】[0001]本发明涉及用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。【
背景技术：
】[0002]D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的医药中间体，用于生产内酰胺类半合成抗生素。内酰胺类半合成抗生素包括羟氨苄青霉素(阿莫西林)、头孢羟氨苄(欧意)等。与传统的青霉素G类抗生素相比，β-内酰胺类半合成抗生素具有抗菌谱广、毒性低、口服效果好等优点，临床应用广泛，市场非常巨大。据统计，2009年全球抗生素药物市场销售额为280亿美元，其中β-内酰胺类半合成抗生素约占65%，为182亿美元。从2000到2009年，仅阿莫西林和头孢羟氨苄产量就分别增长了614%和762%。这些药物的大规模生产使得D-对羟基苯甘氨酸的需求大幅增加。据悉，目前全球D-对羟基苯甘氨酸的需求量近3万吨，国内也接近2万吨。数据显示，每年全球D-对羟基苯甘氨酸的供应缺口约为6000吨，国内约3000吨，且供需矛盾随着需求量的逐年增加而越发严重。因此，开发高效的D-对羟基苯甘氨酸的生产方法非常重要。[0003]目前，D-对羟基苯甘氨酸的生产方法主要有化学法和生物法。[0004]化学法通过先合成DL-对羟基苯甘氨酸，然后再拆分得到D-对羟基苯甘氨酸。合成DL-对羟基苯甘氨酸主要有苯甲醛法和乙醛酸法。苯甲醛法通过使用对羟基苯甲醛与氰化钠作用生成对羟基-α-羟基苯乙腈，然后酸水解生成DL-对羟基苯甘氨酸，该法原料价格较高，且使用剧毒的氰化物，生产中存在HCN气体及含CN-废水的处理问题。乙醛酸法通过使用乙醛酸、苯酚等生成DL-对羟基苯甘氨酸，反应过程中需要大量酸碱，且需要高压。将DL-对羟基苯甘氨酸拆分成D-对羟基苯甘氨酸的常用方法有化学拆分法和诱导结晶法。化学拆分法是先将DL-对羟基苯甘氨酸在甲醇中以硫酸为催化剂制成甲醛，加入拆分剂制成DL-对羟基苯甘氨酸甲酯，再将其与拆分试剂作用生成盐，利用盐的溶解度不同分离。该法反应周期长，单程转化率低。诱导结晶法是将DL-对羟基苯海因与拆分剂在含有水醇溶液中加热制成饱和溶液，然后通过降温分离，操作繁琐，且产物不纯。综上所述，化学法在生产D-对羟基苯甘氨酸方面存在步骤繁琐、副反应多、收率较低的问题，给后续产物纯化带来困难。另外，化学法生产普遍需要高温高压，且经常使用大量酸碱，对环境污染较为严重。[0005]生物法是以DL-对羟基苯海因作为底物，利用微生物中特定的酶或者利用其完整细胞将其转化为D-对羟基苯甘氨酸。单酶法主要是通过表达海因酶将DL-对羟基苯海因转变成N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸，然后再经过化学法水解获得D-对羟基苯甘氨酸。由于D-海因酶可以特异性地生产D-对羟基苯甘氨酸，因此该法专一性强，收率较高，但缺点是反应过程仍然需要添加大量酸，对后续处理带来问题。【
发明内容】[0006]本发明的目的是提供用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。[0007]本发明提供的DNA分子，包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因，由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达；[0008]所述D-海因酶是如下(a)或(b):[0009](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0010](b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将DL-对羟基苯海因转化为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的功能的由序列I衍生的蛋白质；[0011]所述述N-氨甲酰水解酶是如下(C)或(d):[0012](c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0013](d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白质。[0014]所述PL启动子为如下I)或2)或3)的DNA分子:[0015]I)序列表中序列5所示的DNA分子；[0016]2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；[0017]3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。[0018]所述D-海因酶基因为如下4)或5)或6)的DNA分子:[0019]4)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；[0020]5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述D-海因酶的DNA分子；[0021]6)与4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述D-海因酶的DNA分子；[0022]所述N-氨甲酰水解酶基因为如下7)或8)或9)的DNA分子:[0023]7)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；[0024]8)在严格条件下与7)限定的DNA序列杂交且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子;[0025]9)与7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子。[0026]上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和IXSSC,0.1%SDS各洗膜一次。[0027]所述DNA分子可依次包括如下元件:所述PL启动子、所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因。具体来说，所述DNA分子依次由如下元件组成:所述PL启动子、限制性内切酶SalI的酶切识别序列、所述D-海因酶基因、限制性内切酶XbaI的酶切识别序列和所述N-氨甲酰水解酶基因。[0028]含有所述DNA分子的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。[0029]所述重组载体可为在载体pUC18的多克隆位点(如HindIII和KpnI酶切位点之间)插入所述DNA分子得到的重组质粒。[0030]所述重组菌可为所述重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DH5α。[0031]以上任一所述DNA分子，以上任一所述重组载体，或以上任一所述重组菌，均可用于生产D-对羟基苯甘氨酸。所述应用中，用于生产D-对羟基苯甘氨酸的底物为DL-对羟基苯海因。[0032]本发明还保护所述重组菌的发酵物。所述发酵物的制备方法可包括如下步骤:将所述重组菌进行发酵，然后收集菌体并进行超声破碎，离心收集上清液。所述发酵的条件具体可为:将所述重组菌接种至含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C、200rpm、振荡培养12小时。所述超声破碎的条件具体可为:超声功率为200w，处理时间为4min，每超声3s停3s。所述离心的条件具体可为:1000Orpm离心lmin。[0033]本发明还保护一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物，加入所述发酵物，反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。[0034]本发明还保护另一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物，加入所述重组菌，反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。[0035]本发明提供了一个能稳定、大量地表达D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的DNA分子、以及基于该DNA分子的重组载体和重组菌。该重组菌或该重组菌的发酵物可以高效转化DL-对羟基苯海因生产D-对羟基苯甘氨酸，无需添加任何诱导剂。同时本发明还提供了应用所述重组菌或该重组菌的发酵物将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的方法，只生成D-对羟基苯甘氨酸，无需拆分分离对映体，转化率高，整个生产过程具有条件温和、操作简单、对环境友好的优点。【专利附图】【附图说明】[0036]图1为不同重组菌生产D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的能力-电泳图；I对应重组菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car,2对应重组菌DH5a/pUC-pT7Al-hyd-car,3对应重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car。[0037]图2为重组菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car得到的上清液的HPLC图谱。[0038]图3为三种重组菌的D-海因酶酶活和N-氨甲酰水解酶酶活的比较。[0039]图4为实施例4的结果。【具体实施方式】[0040]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。[0041]来源为苜猜中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的D-海因酶如序列表的序列I所示，其编码基因如序列表的序列2所示。来源为假单胞菌(Pseudomonassp.)的N-氨甲酰水解酶如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。PL启动子(又称pPL)如序列表的序列5所示。PAND启动子(又称pPAND)如序列表的序列6所示。T7A1启动子(又称ρΤ7Α1)如序列表的序列7所不。[0042]载体pUC18:宝生物工程(大连)有限公司。大肠杆菌DH5c1:天根生化科技(北京)有限公司。DL-对羟基苯海因(DL-对羟基苯海因标准品):梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编号H0806。D-对羟基苯甘氨酸标准品:梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编号H0758。N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品:用D-海因酶水解DL-对羟基苯海因获得(参考文献:Dong-CheolLee,Hak-SungKim.0ptimizationofaheterogeneousreactionsystemfortheproductionofopticallyactiveD—aminoacidsusingthermostableD-hydantoinase.BiotechnologyBioengineering.1998，60(6)，729-738.)O[0043]实施例1、重组质粒的构建[0044]一、重组质粒pUC-hyd-car的构建[0045]1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。[0046]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板,用hyd-for和hyd_rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0047]hyd-for:5，-TGCTTGTCGACATGAGCACTGTCATCAAGGG-3>；[0048]hyd-rev:5，-ACGAACTCTAGATCAGACGCCGCTTGCGGGAAT-3，。[0049]3、用限制性内切酶SalI和XbaI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。[0050]4、用限制性内切酶SalI和XbaI双酶切载体pUC18，回收载体骨架(约2680bp)。[0051]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pUC-hyd。[0052]6、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。。[0053]7、以步骤6合成的双链DNA分子为模板,用car-for和car_rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0054]car-for:5，~TGCTTTCTAGAATGACACGCATCGTCAATGCAGCCG~3，；[0055]car-rev:5，~TGCTTGGTACCTCACTGCGGCGGCGGCACA~3，。[0056]8、用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切步骤7的PCR扩增产物，回收酶切产物。[0057]9、用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切重组质粒pUC_hyd，回收载体骨架(约4135bp)。[0058]10、将步骤8的酶切产物和步骤9的载体骨架连接，得到重组质粒pUC-hyd-car。[0059]根据测序结果，对重组质粒pUC-hyd-car进行结构描述如下:以载体pUC18为骨架载体，在SalI和XbaI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的D-海因酶基因，在XbaI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的N-氨甲酰水解酶基因。[0060]二、重组质粒pUC-pPL-hyd-car的构建[0061]1、合成序列表的序列5所示的双链DNA分子。[0062]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用pPL_F0R和pPL-REV组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0063]pPL-F0R:5’~TGCTTAAGCTTCATACAGATAACCATCTGCG~3J；[0064]pPL-REV:5，~TGCTTGTCGACGTGGTCAGTGCGTCCTGCTG~3，。[0065]3、用限制性内切酶HindIII和SalI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。[0066]4、用限制性内切酶HindIII和SalI双酶切重组质粒pUC-hyd-car，回收载体骨架(约5056bp)。[0067]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pUC-pPL-hyd-car。[0068]根据测序结果，对重组质粒pUC-pPL-hyd-car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的HindIII和SalI酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的PL启动子。[0069]三、重组质粒pUC-pPAND-hyd-car的构建[0070]1、合成序列表的序列6所不的双链DNA分子。[0071]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用pPAND_F0R和pPAND-REV组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0072]pPAND-F0R:5’~TGCTTAAGCTTAATATTCCTTTCCTTGTC~3J；[0073]pPAND-REV:5，~TGCTTGTCGACCTGTGGTGTCCTTATGGGGG~3，。[0074]3、用限制性内切酶HindIII和SalI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。[0075]4、用限制性内切酶HindIII和SalI双酶切重组质粒pUC-hyd-car，回收载体骨架(约5056bp)。[0076]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pUC-pPAND-hyd-car?[0077]根据测序结果，对重组质粒pUC-pPAND-hyd-car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的HindIII和SalI酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的PAND启动子。[0078]四、重组质粒pUC-pT7Al-hyd_car的构建[0079]1、合成序列表的序列7所示的双链DNA分子。[0080]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用pT7Al_F0R和pT7Al_REV组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0081]pT7Al-F0R:5’~GCTTAAGCTTTCTTTATTAATACAACTCAC~3J；[0082]pT7A1-REV:5，~TGCTTGTCGACCTATTCGCCGTGTCCCTCTC~3，。[0083]3、用限制性内切酶HindIII和SalI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。[0084]4、用限制性内切酶HindIII和SalI双酶切重组质粒pUC-hyd-car，回收载体骨架(约5056bp)。[0085]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pUC-pT7Al-hyd-car。[0086]根据测序结果，对重组质粒pUC-pT7Al-hyd_car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的HindIII和SalI酶切位点之间插入了序列表的序列7所示的T7A1启动子。[0087]实施例2、重组菌的制备[0088]将重组质粒pUC-pPL-hyd-car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car。[0089]将重组质粒pUC-pPAND-hyd-car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car。[0090]将重组质粒pUC-pT7Al-hyd_car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组菌DH5a/pUC-pT7Al-hyd_car。[0091]实施例3、不同重组菌表达目的蛋白水平的比较[0092]分别将实施例2制备的各个重组菌进行如下操作:[0093]1、挑取重组菌单菌落接种于15ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C、200rpm振荡培养，得到OD.?=〗.8的菌液。[0094]2、取IOml步骤I得到的菌液，转接至100mL含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，得到0D6(l(lnm=3.0的初始发酵体系，37°C、200rpm、振荡培养12小时，得到终止发酵体系O[0095]3、取2mL终止发酵体系，1000Orpm离心lmin，收集菌体沉淀，超声破碎(超声功率为200w,处理时间为4min,每超声3s停3s),然后1000Orpm离心lmin,收集上清液。[0096]4、取步骤3得到的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，见图1。[0097]D-海因酶的预期分子量为53KD，N-氨甲酰水解酶的预期分子量为35KD。三种重组菌均显示有对应D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的预期分子量的条带，且重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car发酵产生的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶最多，显著高于重组菌DH5α/pUC-pT7Al-hyd-car和重组菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car。[0098]5、取800μL步骤3得到的上清液，加入0.02gDL-对羟基苯海因，37°C静置反应30min,然后12000rpm离心lmin，取上清液，用双蒸水稀释至50倍体积后进行HPLC检测。[0099]HPLC检测采用Agilent色谱柱(EclipseXDB-C18,5μm,4.6X150mm),流动相为0.041g/L的乙酸钠水溶液(pH2.7)，流速lml/min，紫外检测波长为270nm。重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car步骤3得到的上清液的HPLC图谱见图2，DL-对羟基苯海因、N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸、D-对羟基苯甘氨酸的出峰位置分别为5.600min、3.863min、l.655min,均与DL-对羟基苯海因标准品、N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品和D-对羟基苯甘氨酸标准品的出峰位置相同。重组菌DH5a/pUC-pT7Al-hyd-car步骤3得到的上清液和重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car步骤3得到的上清液的HPLC图谱与重组菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car得到的上清液的HPLC图谱一致。[0100]用DL-对羟基苯海因标准品制作的标准曲线方程为:y=554x，y代表峰面积，x代表DL-对羟基苯海因浓度(单位mM)。[0101]用N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程为:y=520.68x，y代表峰面积，X代表N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度(单位mM)。[0102]用D-对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程为:y=577.96x,y代表峰面积，X代表D-对羟基苯甘氨酸浓度(单位mM)。[0103]每分钟生成IμmoI产物所需要的酶量定义为一个酶活单位。计算D-海因酶酶活时，底物为DL-对羟基苯海因，产物为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸。计算N-氨甲酰水解酶酶活时，底物为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸，产物为D-对羟基苯甘氨酸。[0104]重组菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.6±0.02U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活为0.8±0.02U/ml。重组菌DH5α/pUC-pT7Al-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.5±0.04U/ml，N_氨甲酰水解酶酶活为0.67±0.07U/ml。重组菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.31±0.05U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活为0.54±0.04U/ml。[0105]三种重组菌的D-海因酶酶活和N-氨甲酰水解酶酶活的比较见图3。结果表明，重组菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car发酵产生的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶最多，因此其步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活和和N-氨甲酰水解酶的酶活也最高。[0106]实施例4、采用重组菌全细胞生产D-对羟基苯甘氨酸[0107]分别将实施例2制备的各个重组菌进行如下操作:[0108]1、挑取重组菌单菌落接种于30ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C、200rpm振荡培养，得到OD.?=〗.6的菌液。[0109]2、取30ml步骤I得到的菌液，转接至300ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，得到0D6(l(lnm=2.8的初始发酵体系，37°C、200rpm振荡培养12小时，得到终止发酵体系O[0110]重组菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car得到的终止发酵体系的0D6(l(lnm=2.8。重组菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car得到的终止发酵体系的0D6(l(lnm=2.9。重组菌DH5α/pUC-pT7Al-hyd-car得到的终止发酵体系的0D6(l(lmi=2.78。[0111]3、取整个终止发酵体系，1000Orpm离心3min,收集菌体沉淀,加入300ml30g/L的DL-对羟基苯海因水溶液，37°C、350rpm振荡反应10小时，从加入DL-对羟基苯海因水溶液的时刻开始计时(初始时刻为O时刻)，每隔两小时取样，采用HPLC检测D-对羟基苯甘氨酸的浓度(HPLC检测方法见实施例3，将对应D-对羟基苯甘氨酸的峰面积代入实施例3中的用D-对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程)。[0112]结果见图4。采用重组菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后，体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为14.73g/L，生产速率为1.4g/L/h。采用重组菌DH5a/pUC-pT7Al-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后，体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为12.29g/L。采用重组菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后，体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为7.59g/L。【权利要求】1.一种DNA分子，包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因，由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达；所述D-海因酶是如下(a)或(b):Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将DL-对羟基苯海因转化为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的功能的由序列I衍生的蛋白质；所述述N-氨甲酰水解酶是如下(c)或(d):(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；Cd)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白质。2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于:所述PL启动子为如下I)或2)或3)的DNA分子:1)序列表中序列5所不的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。3.如权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于:所述D-海因酶基因为如下4)或5)或6)的DNA分子:4)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述D-海因酶的DNA分子；6)与4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述D-海因酶的DNA分子；所述N-氨甲酰水解酶基因为如下7)或8)或9)的DNA分子:7)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；8)在严格条件下与7)限定的DNA序列杂交且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子；9)与7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子。4.含有权利要求1至3中任一所述DNA分子的重组载体或重组菌。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为在载体PUC18的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒。6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于:所述重组菌是将权利要求5所述重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌。7.权利要求1至3中任一所述的DNA分子，或权利要求4所述的重组载体，或权利要求5所述的重组载体，或权利要求4所述的重组菌，或权利要求6所述的重组菌，在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。8.权利要求4或6所述重组菌的发酵物。9.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物，加入权利要求8所述发酵物，反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。10.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物，加入权利要求4或6所述重组菌，反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。【文档编号】C12N15/63GK103993010SQ201310054139【公开日】2014年8月20日申请日期:2013年2月20日优先权日:2013年2月20日【发明者】蔡真,张君丽申请人:中国科学院微生物研究所