一种感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株的制作方法

一种感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。本发明人首次成功地直接从丙肝患者血清中构建包含丙型肝炎病毒1b型结构基因的嵌合重组病毒。本发明为针对特定丙型肝炎病毒株的侵入、装配、中和抗体、药物和疫苗的研究提供了非常有用的工具和方法。
【专利说明】一种感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术以及病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种感染能力增强 的重组嵌合型丙型肝炎病毒株及其制备方法。

【背景技术】
[0002] 全球丙型肝炎病毒（HCV)感染率约3%，慢性HCV感染会导致终末期肝病，包括肝硬 化，肝衰竭及肝癌。至今尚无疫苗。目前标准的治疗方案包括聚乙二醇化干扰素 α和利巴 韦林联用，一些针对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的小分子抑制剂也被开发出来。疗效与多因 素有关，包括病毒及宿主因子，如病毒基因型，病毒载量及宿主在IL28B基因附近的单核苷 酸多态性。
[0003] HCV属于黄病毒科，是有包膜的单股正链RNA病毒。其基因组长9. 6kb，包括一个 5'非翻译区（5'UTR)，开放读码框及3'非翻译区（3'UTR)。其开放读码框编码一个多聚蛋 白，经剪切后得到结构蛋白（core，El，E2)、p7及非结构蛋白（NS2, NS3, NS4A，NS4B，NS5A， NS5B)(Bartenschlager，R·等，2004.Advances in virus research63:71_180)。由于 HCV 病 毒复制速率很快，它的依赖于RNA的RNA聚合酶保真度也不高，HCV的基因及抗原异质性很 高，可分为6个主要的基因型及很多亚型。基因型之间在核酸水平的序列差异超过30%，亚 型之间的差异约20-25%。而且，同一亚型的不同临床分离株之间的序列差异也有约5-8%。 在中国，日本和欧洲，基因型lb是最常见的。由于不同基因型在核酸和蛋白水平有很多差 异，它们在临床治疗上的差异也不足为奇：基因型lb对干扰素治疗最不敏感，持续病毒学 应答仅50%。同时，HCV在体内又以准种形式存在，所谓准种，即许多在序列上高度同源但又 有差异的HCV变异株病毒群体，对丙型肝炎病程进展及治疗效果也有影响。
[0004] HCV领域的发展曾经因为缺乏体外培养模型而受到很大的阻碍。在基于2a基因型 的JFH-1的感染细胞培养模型建立后，研究人员利用JFH-1作为骨架，建立了一些含有来自 同一或不同基因型的HCV结构蛋白（Core，El，E2)、p7和NS2的重组病毒，这些重组病毒在 放入适应性突变后能够产生高滴度的病毒，为对不同基因型的病毒进行疫苗开发和抑制 剂研究打下了基础。然而，这些研究几乎全部是基于实验室的已优化过的原型株。虽然这 些原型病毒株的建立大大推进了新的体外研究系统以及抗病毒治疗策略的发展，但是它们 未必能够真实地反映来自HCV感染病人的异质病毒种群（准种）。
[0005] 目前，直接来自于临床病毒株的全长或者嵌合的HCV细胞培养模型还没有报道。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种制备感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株及 其制备方法。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种氨基酸序列，其包括来自丙型肝炎病毒lb基因型 的结构蛋白Core、El、E2、p7和非结构蛋白NS2的第一个跨膜区，所述氨基酸序列具有与SEQ ID N0:1-4中任何一条具有90%以上同源性的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列具有选自 以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第38位氨基酸为S ;第180 位氨基酸为T ;第183位氨基酸为P ;第184位氨基酸为R ;第217位氨基酸为T ;第253位 氨基酸为F ;第290位氨基酸为P ;第364位氨基酸为T ;第365位氨基酸为A ;第397位氨 基酸为R、第398位氨基酸为D ;第405位氨基酸为L ;第415位氨基酸为S ;第416位氨基 酸为A ;第476位氨基酸为T ;第531位氨基酸为G ;第532位氨基酸为S ;第785位氨基酸 为E ;第827位氨基酸为V ;第835位氨基酸为C ;第837位氨基酸为L。
[0008] 在一个优选例中，所述的氨基酸序列，存在选自以下的至少一项条件：
[0009] (i)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第364位氨基酸为 T、第476位氨基酸为T、第531位氨基酸为G (对应26C3);或
[0010] (ii)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第290位氨基酸为 P、第476位氨基酸为T、第531位氨基酸为G (对应26C6);或
[0011] (iii)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第180位氨基酸为 T、第837位氨基酸为L (对应52B6);或
[0012] (iv)从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第38位氨基酸为 S、第183位氨基酸为P、第184位氨基酸为R、第217位氨基酸为T、第365位氨基酸为A ;第 405位氨基酸为L、第415位氨基酸为S、第532位氨基酸为S、第785位氨基酸为E，第827 位氨基酸为V (对应79L9)
[0013] 在另一优选例中，（i)中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第253位氨基酸为F(对应26C3mt);或
[0014] (ii)中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第835 位氨基酸为C (对应26C6mt);或
[0015] (iii)中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第397 位氨基酸为R、第398位氨基酸为D、第416位氨基酸为A (对应52B6mt)。
[0016] 在另一优选例中，所述的氨基酸序列具有SEQ ID N0:5-ll(分别对应于26C3， 26C6, 52B6, 79L9, 26C3mt，26C6mt，52B6mt 的 Core-NS2lstTMD 段氨基酸序列）中任一氨基酸 序列。
[0017] 在本发明的另一方面，提供编码前面任一项所述的氨基酸序列的多核苷酸，所述 的多核苷酸为DNA或RNA。
[0018] 在本发明的另一方面，提供所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重 组丙型肝炎病毒株，尤其是感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种用于制备重组丙型肝炎病毒株的重组病毒质粒， 该重组病毒质粒包含所述的多核苷酸。
[0020] 在一个优选例中，所述的重组病毒质粒还包括来丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译 区、NS2第一跨膜区以外片段编码基因、NS3编码基因、NS4A编码基因、NS4B编码基因、NS5A 编码基因、NS5B编码基因和3'非翻译区。较佳地，所述的丙型肝炎病毒为与前面所述的丙 型肝炎病毒蛋白或核酸来源不同的另一株丙型肝炎病毒；较佳地，所述的另一株丙型肝炎 病毒是株。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种制备具有体外复制感染能力的重组嵌合型丙型肝 炎病毒的方法，所述方法包括：(a)提供所述的重组病毒质粒；(b)将步骤（a)的重组病毒 质粒在体外转录合成RNA后，转染病毒包装细胞，培养经转染的病毒包装细胞，获得重组嵌 合型丙型肝炎病毒株。
[0022] 在一个优选例中，所述的病毒包装细胞是人肝癌细胞系；较佳地，所述的病毒包装 细胞包括但不限于：Huh7. 5. 1细胞、Huh7细胞，!fepG2、MY-N9 ;较佳地所述的病毒包装细胞 为Huh7. 5. 1细胞。
[0023] 在本发明的另一方面，提供分离的突变型的丙型肝炎病毒E1蛋白，该蛋白的氨基 酸序列具有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第192-383位所示的氨基酸序列具有90%以上同 源性的氨基酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点：从SEQ ID N0:1-4任何 一条的N末端的氨基酸残基起算，第217位氨基酸为T，第253位氨基酸为F，第290位氨基 酸为P，第364位氨基酸为T，第365位氨基酸为A。
[0024] 在本发明的另一方面，提供分离的突变型的丙型肝炎病毒E2蛋白，该蛋白的氨基 酸序列具有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第384-746位所示的氨基酸序列具有90%以上同 源性的氨基酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点：从SEQ ID N0:1-4任何一 条的N末端的氨基酸残基起算，第397位氨基酸为R，第398位氨基酸为D，第405位氨基酸 为L，第415位氨基酸为S，第416位氨基酸为A，第476位氨基酸为T，第531位氨基酸为G， 第532位氨基酸为S。
[0025] 在本发明的另一方面，提供分离的突变型的丙型肝炎病毒p7蛋白，该蛋白的氨基 酸序列具有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第747-809位所示的氨基酸序列具有90%以上同 源性的氨基酸序列，但其中具有以下突变位点：从SEQ ID N0:1-4任何一条的N末端的氨基 酸残基起算，第785位氨基酸为E。
[0026] 在本发明的另一方面，提供分离的突变型的丙型肝炎病毒NS2蛋白，该蛋白的第 一跨膜结构域的氨基酸序列具有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第810-842位所示的氨基酸 序列具有90%以上同源性的氨基酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点：从 SEQ ID N0:1-4任何一条的N末端的氨基酸残基起算，第827位氨基酸为V，第835位氨基 酸为C,第837位氨基酸为L。
[0027] 在本发明的另一方面，提供分离的突变型的丙型肝炎病毒核心蛋白，该蛋白的氨 基酸序列具有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第1-191位所示的氨基酸序列具有90%以上同 源性的氨基酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点：从SEQ ID N0:1-4任何一 条的N末端的氨基酸残基起算，第38位氨基酸为S，第180位氨基酸为T，第183位氨基酸 为P,第184位氨基酸为R。
[0028] 在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一项所述的蛋白。
[0029] 在本发明的另一方面，提供所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重 组丙型肝炎病毒株，尤其是感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。
[0030] 在本发明的另一方面，提供筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括：
[0031] (S1)利用前述方法制备的重组嵌合型丙型肝炎病毒，将所述细胞感染病毒包装细 胞；
[0032] (S2)在被检物质的存在下培养下述（S1)的细胞，之后检测所得培养物中的重组 嵌合型丙型肝炎病毒的感染能力；
[0033] 若病毒的感染能力发生统计学上的降低，则证明所述的被检物质是潜在的抗丙型 肝炎病毒的物质。
[0034] 在一个优选例中，所述的被检物质包括：抗体、小分子化合物、针对丙型肝炎病毒 基因组涉及的干扰分子等。
[0035] 在本发明的另一方面，提供抗丙型肝炎病毒抗体，该抗体将前述方法制备的重组 嵌合型丙型肝炎病毒作为抗原识别；更佳地，该抗体将特异性识别利要求12-16任一所述 的突变型蛋白上的表位。
[0036] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。

【专利附图】

【附图说明】
[0037] 图l、lb/JFH_l嵌合病毒构建过程。（A) lb/JFHl嵌合病毒不意图。白色方框表不 JFH-1骨架，灰色方块表示来自于基因型lb的c〇re-NS2ast TMD)区域。基因型间的连接 位点位于核苷酸2866/2867处（对应coni参考序列[AJ239799] 2866/2867处），即氨基酸 残基842/843处，图中C表示Core。（B)构建感染性lb/JFHl嵌合cDNA克隆的过程。
[0038] 图2、适应性突变可促进病毒产生。（A)将野生型克隆（26C3wt，26C6wt，52B6wt和 79L9wt)及带有适应性突变的克隆（26C3mt，26C6mt，52B6mt)分别体外转录，得到的RNA电 转Huh7. 5. 1细胞。电转后第2天由HCV NS3蛋白免疫荧光显示转染效率在野生型及突变 型RNA间类似。NS3染色为绿色，核用Hoechst染色为蓝色。分别收集电转后第2天⑶及 第7天（C)的细胞培养上清，用于测定病毒滴度。（D)病毒的感染动力学曲线。Huh7. 5.1 细胞以?0. 02的感染复数感染病毒，在各时间点分别收集细胞培养上清测定滴度。10FFU/ ml是检测下限。
[0039] 图3、PR26, PR52, PR79病毒与Coni病毒的部分序列的同源性比较。
[0040] 图4、lb/JFH-l对E2单克隆抗体的中和敏感性。（A)与AR3A抗体结合的E2蛋白 的表位序列分析。HCV残基396-424,436-447和523-540对E2与AR3A的结合相关（20)。 26C3mt，26C6mt，52B6mt和79L9在这几个表位处与H77参考序列（GenBank AF009606)的同 源性比较。（B)?250FFU HCV病毒与5倍梯度稀释（1:20-1:2500)的E2单克隆抗体孵育 1小时后感染Huh7. 5. 1细胞。3天后抽提胞内RNA，HCV RNA由实时荧光定量PCR测定，单 克隆抗体对病毒的中和程度以未加抗体的细胞培养液作对照。结果来自于两次独立实验的 代表性结果。
[0041] 图5、PR26, PR52, PR79病人血清及对照血清对各病毒的中和能力。（A) JFH-1病 毒；（B) 26C3mt 病毒；（C) 26C6mt 病毒；（D) 52B6mt 病毒及（E) 79L9 病毒。?250FFU 病毒与 5倍梯度稀释（1:100-1:12500)的血清孵育1小时后感染Huh7. 5. 1细胞。3天后收集胞内 RNA，由实时荧光定量PCR测定HCV RNA，血清对病毒的中和程度以同样稀释度的对照血清 作对照。结果来自于两次独立实验的代表性结果。
[0042] 图6、26C3,26C6,52B6,79L9与coni中相应序列的同源性比较结果。

【具体实施方式】
[0043] 本发明人从lb型的HCV的临床分离株中克隆HCV的结构基因（核衣壳蛋白core， 包膜蛋白El和E2)及p7和NS2的第一个跨膜区，构建了 lb型和JFH-1的嵌合重组病毒。 通过克隆筛选策略，本发明人获得了能在Huh7. 5. 1细胞中产生感染性病毒；进一步传代得 到的病毒经测序后发现在lb型来源的区域发生的适应性突变能有效地增强病毒感染力， 可良好地应用于病毒感染研究或疫苗研究。
[0044] 如本文所用，所述的"感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株"是指相对于相 应的野生型病毒株，感染能力显著增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株；也包括相对于体外 无感染能力的野生型病毒株，产生了感染能力的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。本领域技术 人员公知，天然分离得到的野生型的HCV病毒株，难以通过体外培养方式获得感染能力。
[0045] 病毒蛋白及编码基因
[0046] 本发明涉及贡献了 HCV在哺乳动物细胞中的生长适应性的突变型病毒蛋白，即突 变型核心蛋白，突变型E1蛋白，突变型E2蛋白，突变型p7蛋白，突变型NS2蛋白。较佳地， 上述突变型蛋白是在来源于PR26病毒、PR52病毒、PR79病毒的野生型蛋白基础上进行突 变的，所述的PR26病毒、PR52病毒、PR79病毒的野生型蛋白及其核苷酸的序列分别参见 GenBank 登录号：HQ912956 (PR26)，HQ912958 (PR52)和 HQ912959 (PR79)。
[0047] 作为本发明的优选方式，所述的突变型的丙型肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列具 有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第1-191位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基 酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点：从SEQ ID N0:l-4任何一条的N末端 的氨基酸残基起算，第38位氨基酸为S，第180位氨基酸为T，第183位氨基酸为P，第184 位氨基酸为R。
[0048] 作为本发明的优选方式，所述的突变型的丙型肝炎病毒E1蛋白的氨基酸序列具 有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第192-383位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨 基酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点：从SEQ ID N0:1-4任何一条的N末 端的氨基酸残基起算，第217位氨基酸为T，第253位氨基酸为F，第290位氨基酸为P，第 364位氨基酸为T，第365位氨基酸为A。
[0049] 作为本发明的优选方式，所述的突变型的丙型肝炎病毒E2蛋白的氨基酸序列具 有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第384-746位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨 基酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点：从SEQ ID N0:l-4任何一条的N末 端的氨基酸残基起算，第397位氨基酸为R，第398位氨基酸为D，第405位氨基酸为L，第 415位氨基酸为S，第416位氨基酸为A，第476位氨基酸为T，第531位氨基酸为G，第532 位氨基酸为S。。
[0050] 作为本发明的优选方式，所述的突变型的丙型肝炎病毒p7蛋白的氨基酸序列具 有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第747-809位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨 基酸序列，但其中具有以下突变位点：从SEQ ID N0:1-4任何一条的N末端的氨基酸残基起 算，第785位氨基酸为E。
[0051] 作为本发明的优选方式，所述的突变型NS2蛋白的第一跨膜结构域的氨基酸序列 具有与SEQ ID N0:1-4任何一条中第810-842位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的 氨基酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点：从SEQ ID N0:l-4任何一条的N 末端的氨基酸残基起算，第827位氨基酸为V，第835位氨基酸为C，第837位氨基酸为L。
[0052] 本发明还包括上述各突变型病毒蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语 "片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的突变型病毒蛋白相同的生物学功能 或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保 守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可 以是也可以不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的 多肽，或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序 列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根据本文的定义这些片段、衍生 物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。但是，所述的蛋白片段、衍生物和类似物 中，对应于上述任一优选方式中所限定的氨基酸位点是保守的。
[0053] 在本发明中，术语"突变型病毒蛋白"还包括具有与上述突变型核心蛋白，突变型 E1蛋白，突变型E2蛋白，突变型p7蛋白，突变型NS2蛋白相同功能的变异形式。这些变异 形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5 个、1-3个、或1-2个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或 缺失一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例 如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。但 是，这些变异形式中，对应于上述任一优选方式中所限定的氨基酸位点是保守的。
[0054] 此外，为了获得具有感染能力的病毒，还需要其它多种蛋白编码基因或非翻译区， 包括5'非翻译区、NS3编码基因、NS4A编码基因、NS4B编码基因、NS5A编码基因、NS5B编 码基因和3'非翻译区。这些蛋白对于病毒的感染能力没有太大的影响，它们可以是野生型 蛋白，或是突变型蛋白；可以是来自JFH-1病毒、PR26病毒、PR52病毒或PR79病毒的或其 它丙型肝炎病毒。较佳地，它们来自JFH-1病毒。这些病毒蛋白的片段、衍生物和类似物也 包括在本发明中，所述的非翻译区的同功能突变体形式或片段也包括在本发明中。所述的 多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保 守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密 码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或（iii)附加的氨基 酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序 列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟 练技术人员公知的范围。
[0055] 本发明还提供了编码本发明突变型核心蛋白，突变型E1蛋白，突变型E2蛋白，突 变型P7蛋白，突变型NS2蛋白的多核苷酸序列。
[0056] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语 "编码多肽（蛋白）的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加 编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0057] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0058] 本发明的编码突变型核心蛋白，突变型E1蛋白，突变型E2蛋白，突变型p7蛋白， 突变型NS2蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人 工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放 阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备 的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩 增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0059] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，通常，通过先合成多个小片段，然 后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0060] 重组的病毒质粒
[0061] 本发明还涉及重组病毒质粒，其包含了可以实现HCV获得感染性的所有的元 件（含病毒蛋白编码序列以及非编码序列），在转染细胞后可获得病毒蛋白相应的mRNA 以及病毒RNA(vRNA)，从而获得重组病毒。目前，已经有一些已知的病毒骨架质粒，例如 pUC-vJFH-Ι质粒。尽管本发明优选pUC-vJFH-Ι质粒，但其它与具有类似元件及类似功能的 质粒也可应用于本发明中。
[0062] 作为本发明的优选方式，重组病毒质粒包含有：来源于丙型肝炎病毒株JFH-15' 非翻译区、NS2(不含第一跨膜区吗）编码基因、NS3编码基因、NS4A编码基因、NS4B编码基 因、NS5A编码基因、NS5B编码基因和3'非翻译区，以及来源于丙型肝炎病毒株lb的核心蛋 白（Core)编码基因、E1编码基因、E2编码基因、p7编码基因和NS2的第一个跨膜区编码基 因。
[0063] 当本发明所述的重组病毒质粒转染病毒包装细胞，培养经转染的病毒包装细胞， 可获得具有感染能力的重组HCV病毒株。
[0064] 试剂盒
[0065] 本发明还包括用于制备重组HCV病毒株的试剂盒，所述试剂盒中包括：重组病毒 质粒，其含有：来源于丙型肝炎病毒株JFH-15'非翻译区、NS2(不含第一跨膜区）编码基因、 NS3编码基因、NS4A编码基因、NS4B编码基因、NS5A编码基因、NS5B编码基因和3'非翻译 区，以及来源于丙型肝炎病毒株lb的核心蛋白（Core)编码基因、E1编码基因、E2编码基 因、P7编码基因和NS2的第一个跨膜区编码基因。
[0066] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中，重组病毒质粒是的骨架质粒是 pUC-vJFH-l〇
[0067] 本领域技术人员在获得了所述的试剂盒后，可方便地来制备获得重组HCV病毒 株，该重组HCV病毒株是哺乳动物细胞适应性的。
[0068] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还包括：病毒包装细胞，作为所述的重组 病毒质粒的受体细胞。较佳地，所述的病毒包装细胞是人源肝癌细胞系，例如但不限于 Huh7. 5. 1 和 Huh7 细胞。
[0069] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还包括其它应用于进行病毒制备的试剂以 及周边试剂，例如但不限于基因转染试剂，PCR扩增试剂，质粒抽提试剂，病毒包装细胞的培 养基等。更佳地，所述的试剂盒中还可包括说明使用方法和说明注意点的使用说明书。
[0070] 本发明的主要优点在于：
[0071] 丙型肝炎病毒（HCV)的基因型是决定临床疗效的主要因素，lb型的HCV是最难以 治疗的，也是东亚和欧洲最常见的基因型。而本发明人经过广泛且深入的研究，获得了 lb 型病毒的适应性突变株。反向遗传学证实了这些突变可以极大地促进病毒的感染性。这些 嵌合病毒对HCV E2蛋白的单克隆抗体和病人的血清呈现出了不同的中和敏感性。
[0072] 本发明人的研究提供了一种新的策略用于构建临床病毒株的细胞培养模型，而且 为针对特定病毒株的病毒装配、中和抗体和疫苗的研究提供了一种非常有用的方法。
[0073] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0074] I.材料与方法
[0075] 丙型肝炎病人血清来源
[0076] lb临床分离株PR26、PR52和PR79来自于2007年7月到2008年7月期间在上 海交通大学瑞金医院感染科进行Peg-IFN-α联合利巴韦林治疗的三例丙型肝炎患者（上 海交通大学医学院附属瑞金医院）。这项研究取得了瑞金医院伦理委员会的批准，符合赫 尔辛基宣言精神，并获得了所有患者签署的知情同意书。HCV RNA定量使用了一步法HCV RT-PCR试剂盒（PG Biotech，深圳）。HCV基因型是按HCV分型基因芯片试剂盒（Realchip Biotech，宁波）的说明书操作进行的。三例HCV病例的RNA滴度见表1。
[0077] 表1、lb分离株基本信息及其与coni参考株在蛋白水平上的相似性比较
[0078]

【权利要求】
1. 一种氨基酸序列，其包括来自丙型肝炎病毒lb基因型的结构蛋白Core、El、E2、p7 和非结构蛋白NS2的第一个跨膜区，其特征在于，所述氨基酸序列具有与SEQ ID NO: 1-4中 任何一条具有90%以上同源性的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列具有选自以下至少一项 条件或其任意组合： 从N末端的氨基酸残基起算，第38位氨基酸为S ;第180位氨基酸为T ;第183位氨基 酸为P ;第184位氨基酸为R ;第217位氨基酸为T ;第253位氨基酸为F ;第290位氨基酸 为P ;第364位氨基酸为T ;第365位氨基酸为A ;第397位氨基酸为R、第398位氨基酸为 D ;第405位氨基酸为L ;第415位氨基酸为S ;第416位氨基酸为A ;第476位氨基酸为T ; 第531位氨基酸为G ;第532位氨基酸为S ;第785位氨基酸为E ;第827位氨基酸为V ;第 835位氨基酸为C ;第837位氨基酸为L。
2. 如权利要求1所述的氨基酸序列，存在选自以下的至少一项条件： (i) 从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第364位氨基酸为T、第 476位氨基酸为T、第531位氨基酸为G ;或 (ii) 从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第290位氨基酸为P、第 476位氨基酸为T、第531位氨基酸为G ;或 (iii) 从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID N0:1序列的第180位氨基酸为T、 第837位氨基酸为L ;或 (iv) 从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第38位氨基酸为S、第 183位氨基酸为P、第184位氨基酸为R、第217位氨基酸为T、第365位氨基酸为A ;第405 位氨基酸为L、第415位氨基酸为S、第532位氨基酸为S、第785位氨基酸为E，第827位氨 基酸为V。
3. 如权利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于，（i)中，还包括：从N末端的氨基酸残 基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第253位氨基酸为F ;或 (ii) 中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID NO: 1序列的第835位氨 基酸为C ;或 (iii) 中，还包括：从N末端的氨基酸残基起算，相应于SEQ ID N0:1序列的第397位 氨基酸为R、第398位氨基酸为D、第416位氨基酸为A。
4. 如权利要求1-3所述的氨基酸序列，其特征在于，具有SEQ ID N0:5-ll中任一氨基 酸序列。
5. 编码如权利要求1-4任一项所述的氨基酸序列的多核苷酸，所述的多核苷酸为DNA 或 RNA。
6. 权利要求1-5任一所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重组丙型肝炎 病毒株，尤其是感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。
7. -种用于制备重组丙型肝炎病毒株的重组病毒质粒，该重组病毒质粒包含权利要求 5所述的多核苷酸。
8. 如权利要求7所述的重组病毒质粒，其特征在于，还包括丙型肝炎病毒基因组的5' 非翻译区、NS2第一跨膜区以外片段编码基因、NS3编码基因、NS4A编码基因、NS4B编码基 因、NS5A编码基因、NS5B编码基因和3'非翻译区。
9. 如权利要求8所述的重组病毒质粒，其特征在于，所述的丙型肝炎病毒基因组来自 与权利要求1-5所述的丙型肝炎病毒蛋白或核酸来源不同的另一株丙型肝炎病毒；较佳 地，所述的另一株丙型肝炎病毒是JFH-1株。
10. -种制备具有体外复制感染能力的重组嵌合型丙型肝炎病毒的方法，其特征在于， 所述方法包括： (a) 提供如权利要求7-9任一项所述的重组病毒质粒； (b) 将步骤（a)的重组病毒质粒在体外转录合成RNA后，转染病毒包装细胞，培养经转 染的病毒包装细胞，获得重组嵌合型丙型肝炎病毒株。
11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的病毒包装细胞是人肝癌细胞系；较 佳地，所述的病毒包装细胞包括但不限于：Huh7. 5. 1细胞、Huh7细胞，!fepG2、MY-N9 ;较佳 地所述的病毒包装细胞为Huh7. 5. 1细胞。
12. 分离的突变型的丙型肝炎病毒E1蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列具有与 SEQ ID NO: 1-4任何一条中第192-383位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸 序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点： 从SEQ ID NO: 1-4任何一条的N末端的氨基酸残基起算，第217位氨基酸为T，第253 位氨基酸为F，第290位氨基酸为P，第364位氨基酸为T，第365位氨基酸为A。
13. 分离的突变型的丙型肝炎病毒E2蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列具有与 SEQ ID NO: 1-4任何一条中第384-746位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸 序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点： 从SEQ ID NO: 1-4任何一条的N末端的氨基酸残基起算，第397位氨基酸为R，第398 位氨基酸为D，第405位氨基酸为L，第415位氨基酸为S，第416位氨基酸为A，第476位氨 基酸为T，第531位氨基酸为G，第532位氨基酸为S。
14. 分离的突变型的丙型肝炎病毒p7蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列具有与 SEQ ID NO: 1-4任何一条中第747-809位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸 序列，但其中具有以下突变位点： 从SEQ ID NO: 1-4任何一条的N末端的氨基酸残基起算，第785位氨基酸为E。
15. 分离的突变型的丙型肝炎病毒NS2蛋白，其特征在于，该蛋白的第一跨膜结构域的 氨基酸序列具有与SEQ ID NO: 1-4任何一条中第810-842位所示的氨基酸序列具有90%以 上同源性的氨基酸序列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点： 从SEQ ID NO: 1-4任何一条的N末端的氨基酸残基起算，第827位氨基酸为V，第835 位氨基酸为C，第837位氨基酸为L。
16. 分离的突变型的丙型肝炎病毒核心蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列具有与 SEQ ID NO: 1-4任何一条中第1-191位所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序 列，但其中具有选自以下的一个或多个突变位点： 从SEQ ID NO: 1-4任何一条的N末端的氨基酸残基起算，第38位氨基酸为S，第180位 氨基酸为T，第183位氨基酸为P，第184位氨基酸为R。
17. -种分离的多核苷酸，其编码权利要求12-16任一项所述的蛋白。
18. 权利要求12-16任一所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重组丙型 肝炎病毒株，尤其是感染能力增强的重组嵌合型丙型肝炎病毒株。
19. 筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括： (51) 利用权利要求10或11的方法制备的重组嵌合型丙型肝炎病毒，将所述细胞感染 病毒包装细胞； (52) 在被检物质的存在下培养下述（S1)的细胞，之后检测所得培养物中的重组嵌合 型丙型肝炎病毒的感染能力； 若病毒的感染能力发生统计学上的降低，则证明所述的被检物质是潜在的抗丙型肝炎 病毒的物质。
20.抗丙型肝炎病毒抗体，该抗体将权利要求10或11的方法制备的重组嵌合型丙型肝 炎病毒作为抗原识别；更佳地，该抗体将特异性识别利要求12-16任一所述的突变型蛋白 上的表位。
【文档编号】C12Q1/02GK104140459SQ201310172776
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2013年5月10日
【发明者】钟劲, 卢捷, 陶万银, 李 瑞, 向禹 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所