一种制备转gapdh基因棉花的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备转GAPDH基因棉花的方法。GAPDH蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）将SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明首次获得了转GAPDH基因棉花，为培育耐盐碱棉花品种及提高棉花的耐盐碱能力奠定了基础，具有一定的经济和社会效益。
【专利说明】—种制备转GAPDH基因棉花的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备转GAPDH基因棉花的方法。
【背景技术】
[0002]土壤盐溃化是一个全球性生态问题，是当今世界土地荒漠化和耕地退化的主要因素之一，土地的盐溃化对农业生产和生态环境带来的影响巨大。如何开发利用盐碱地成为日益关注的焦点。土壤中高浓度的盐分会造成植物体内离子失衡、氧化伤害、水分亏缺和营养缺乏并导致生物大分子破坏、生长迟缓、甚至植株死亡，严重影响着植物的生长发育，从而导致作物的减产或绝收，制约农业生产和发展。具体盐胁迫对植物的影响表现在:对种子萌发的影响，对植物光合作用、呼吸作用、蛋白质合成及新陈代谢等的影响，对植物形态的影响等。目前，利用转基因技术培育耐旱、耐盐碱的作物新种质已成为作物育种家的研究重点。
[0003]植物耐盐是一个多基因参与控制的数量性状、多途径诱导的过程。植物适应盐胁迫的对策中较为普遍的是代谢调整。在胁迫条件下，植物本身能够感知和传导逆境胁迫信号，进而启动相关基因的表达，激活相应的保护代谢途径，如抗氧化酶系与活性氧的清除，离子、代谢物的积累与渗透调节，胁迫诱导蛋白的合成及其防御功能，胁迫诱导基因的调控与表达。此外，植物还会通过泌盐作用、稀盐作用、拒盐作用等过程来抵抗盐胁迫。随着生物科技技术的不断发展，以及生理学，遗传学，分子生物学对抗逆性复杂机制的阐述，对植物耐盐研究已经取得了一些重大成果，已经发现了很多耐盐相关基因，但是由于其机制复杂性还有很多与抗盐相关的基因未被发现。
[0004]自然界中存在着许多天然的耐盐植物，它们在漫长的进化过程中积累了很多丰富的耐盐基因。杜氏盐藻、红树、滨黎、海带、圣柳、蒺藜苜蓿、碱蓬、大米草等耐盐植物自身具有一套完善的耐盐机制。目前国内外许多实验室在植物耐盐基因研究方面做了大量工作，发现在盐胁迫条件下，植物会特异地表达一些基因，在一定程度上提高了植物的抗逆能力。利用基因工程手段和分子生物学的方法克隆耐盐相关基因，转化棉花，大豆，小麦和玉米等重要经济作物，获得能在盐碱地上种植和栽培的农作物品种是未来研究的重点课题。通过研究这些被盐胁迫所表达的基因，可能找到植物对盐胁迫的适应及抵御机理，也为研究转基因方面提供很好的理论依据。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种制备转GAPDH基因棉花的方法。
[0006]本发明所提供的GAPDH蛋白，为如下(I)或(2)所示:
[0007](I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0008](2)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0009]上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。[0010]上述编码基因为如下中至少一种:
[0011]I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0012]2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白质的DNA分子；
[0013]3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码上述蛋白质的DNA分子。
[0014]含有上述任一所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0015]一种制备转GAPDH基因棉花的方法也属于本发明的保护范围，该方法包括如下步骤:将上述任一所述的编码基因导入出发棉花中，得到转基因棉花；与出发棉花相比，转基因棉花的耐盐性增强。
[0016]上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体PBI121的多克隆位点得到的。
[0017]上述任一所述的方法中，所述编码基因通过基因枪活体转化的方法导入；
[0018]和/或，所述转基因棉花的耐盐性增强是指转基因棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率高于出发棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率。
[0019]上述蛋白、上述任一所述的编码基因在提高棉花耐盐性中的应用也属于本发明的保护范围；
[0020]所述的耐盐性为耐0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液的性质；
[0021]所述提高棉花耐盐性是指棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率提高。
[0022]本发明首次获得了转GAPDH基因棉花，为培育耐盐碱棉花品种及提高棉花的耐盐碱能力奠定了基础，具有一定的经济和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为杜氏盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)的克隆。
[0024]图2为基因枪大田转化流程图。
[0025]图3为转基因棉花桃。
[0026]图4为GAPDH基因分子检测结果(以Fl和Rl为引物)。
[0027]图5为GAPDH基因分子检测结果(以F2和R2为引物)。
[0028]图6为种子7天后的发牙结果。
【具体实施方式】
[0029]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031]杜氏盐藻在文献“刘建国，吴超元.杜氏盐藻和β_胡萝卜素研究评价[J].海洋与湖泊，1995，26(3):323-330.”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定
课题组实验室获得。
[0032]pGEM-T EasyT4载体购自Promega公司，产品目录号为A1380。[0033]pBI121在文献“香蕉Maasrl基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定.热带作物学报，2009年，30 (3):333-337.”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定课
题组实验室获得。
[0034]基因枪为美国wealtec的基因枪⑶S-80。 [0035]非抗虫棉花材料沪749513在文献“高频体细胞胚胎发生的优异棉花种质材料筛选.分子植物育种，2012,10 (6), 683-688.”中公开过,公众可从中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定课题组实验室获得。
[0036]实施例1、GAPDH超表达载体的构建
[0037]一、设计PCR引物
[0038]引物序列如下:
[0039]GAPDH-F:5，-ATGGCTACATCAATGGCGAAGAC-3，；
[0040]GAPDH-R: 5，-TTAGGCGGCCCACCTCTGGGCG-3，。
[0041]二、PCR 扩增
[0042](一)提取杜氏盐藻的RNA，反转录成cDNA。
[0043](二)以cDNA为模板，用弓丨物对GAPDH-F/GAPDH-R进行GAPDH基因的PCR扩增。
[0044]PCR扩增体系为:
[0045]
Premix Ex Tag25 μ I
模板2.0 μ I
GAPDH-F (10 μ Μ) 2.0μ I
GAPDH-R (10μ Μ) 2.Ομ I
ddH20补足至总体积50 μ I。
[0046]PCR反应程序如下:
[0047]94°C 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 90s, 35 个循环；72°C IOmin ；4°C + ⑴。
[0048]GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0049]GAPDH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0050]三、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增片段并回收。
[0051]琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。
[0052]图1 中，I:PCR 扩增产物；2 =Marker0
[0053]图1表明，PCR扩增得到的GAPDH基因片段与预计大小一致。
[0054]四、将GAPDH基因片段与pGEM-T EasyT4载体连接，得到重组质粒。
[0055]五、将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α，挑单克隆进行测序，测序证明重组质粒正确。
[0056]六、提取重组质粒。以质粒为模板，以A和B为引物进行PCR扩增。
[0057]引物序列如下:
[0058]A:5，-CACGGGGGACTCTAGAATGGCTACATCAATGGCGAA-3，；
[0059]B:5’-AGGGACTGACCACCCGGGGGCGGCCCACCTCTGGGC-3’。
[0060](下划线所示序列为酶切识别位点)
[0061]七、用Xba I和Sma I双酶切PCR扩增产物，得到GAPDH基因片段；用Xba I和Sma I双酶切受体载体PBI121，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒 PBI121-GAPDH。
[0062]八、将重组质粒PBI121-GAPDH转化大肠杆菌DH5 α，挑单克隆进行测序，测序证明
重组质粒正确。
[0063]实施例2、基因枪活体转化棉花
[0064]一、提取 pBI 121-GAPDH 质粒。
[0065]二、转化受体材料为:非抗虫棉花材料沪749513。转化时间定在棉花的盛花期7月中旬到8月中旬，沪749513进行自交。
[0066]三、在转化的第一天下午采集各受体材料的花朵，然后将花朵室温放置实验台上(每个材料的花朵要做好标记)，同时已经去掉雄蕊的花一定用蜡管套住柱头。
[0067]四、第二天早上9:00-10:00左右开始收集花粉，收集好的花粉放于干净的培养皿内，并做好标记。
[0068]五、取10 μ I金粉和质粒的悬浮液加入到基因枪⑶S-80孔内，用手轻轻拍打枪的加样孔附近两下，使所加的样品完全进入枪内。
[0069]六、基因枪轰击采集的各受体材料的新鲜花粉1-2次，轰击后的花粉人工涂抹于雌蕊的柱头(11:00左右进行涂抹，此时花粉活力比较强)，用蜡管重新套在涂抹花粉后的柱头上，以免发生杂交，挂牌做好标记。
[0070]七、待种子成熟，将收获的各材料的种子做好标记，晒干后脱绒保存。
[0071]图2是实验中基因枪 大田转化的流程图片。
[0072]图2中，A:大田棉花；Β:去雄蕊，套蜡管，做标记；C:收集的花朵；D:收集的花粉；E:基因枪轰击；F:授粉。
[0073]非抗虫棉花材料沪749513T0代植株的棉花桃如图3所示。
[0074]图3表明，经大田观察大部分转基因棉花桃比非转基因棉花桃稍小、有点畸形。转基因棉花吐絮晚。
[0075]实施例3、转基因棉花TO代种子的分子检测
[0076]一、提取转基因非抗虫棉花材料沪749513T0代植株的发芽材料的DNA。
[0077]二、以各植株的DNA为模板，分别用GAPDH基因的两对引物进行扩增检测。检测引物如表1所示。
[0078]表1检测引物
[0079]
引物名称_引物序列(5，-3，)_扩增理论值
GAPDH-FlGCCGTGAAGATGGAGGTCGT992bp
GAPDH-RlTAGCCCCACTCGTTGTCGTA
GAPDH-F2 GGGCAAGTTCTCCGCCGATG 556bpGAPDH-R2_(tGG(；A(；A(；(t(:A(tA(t(；(；A(:A(；_
[0080]其中GAPDH-Fl 和 GAPDH-Rl 为一对引物，GAPDH-F2 和 GAPDH-R2 为一对引物。
[0081 ] 三、1%琼脂糖凝胶电泳检测。[0082]结果如图4和图5所示。
[0083]图4为GAPDH基因分子检测结果(以GAPDH-Fl和GAPDH-Rl为引物)。
[0084]图 4 中，M =Marker DL2000 ;1_6 为沪 749513T0 代植株。
[0085]图4表明，以GAPDH-Fl和GAPDH-Rl为引物扩增，图A中编号为1、2、3、4、5和图B中编号为6的植株扩增出992bp的特异性条带，其中编号为3和6的植株的特异性条带最清晰。
[0086]图5为GAPDH基因分子检测结果(以GAPDH-F2和GAPDH-R2为引物)。
[0087]图5 中，M =Marker DL2000 ;1_20 为沪 749513T0 代植株。
[0088]图5表明，以F2和R2为引物扩增，图A中编号为1_7和图B中编号为8_20的植株扩增出556bp的特异性条带，但条带不亮。
[0089]因此，通过两对引物扩增共检测出有特异性条带的植株(即转GAPDH基因非抗虫棉花材料沪749513植株)26株。
[0090]四、用图4中编号为3和6的沪749513转基因植株的PCR产物直接测序，结果正确，表明杜氏盐藻GAPDH基因成功转入了非抗虫棉花材料沪749513中。
[0091 ] 实施例4、TO代种子的耐盐性检测
[0092]采用双夹层滤纸法，具体步骤如下:
[0093]先在培养皿内放 置一张滤纸，摆上种子，再在种子上放置一张滤纸，用0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液浇之，溶液量以上层滤纸湿润、倾斜时皿底无溶液聚合为度，在24°C保湿培养。7天后观察发芽情况。
[0094]实验组所用种子为实施例3中的TO代转GAPDH基因非抗虫棉花材料沪749513的种子40粒，对照组为未转任何基因的非抗虫棉花沪749513的种子40粒。
[0095]结果如图6所示。
[0096]图6中，A:7天后TO代转GAPDH基因非抗虫棉花材料沪749513的种子发芽情况；
[0097]B:7天后非抗虫棉花材料沪749513的种子发芽情况。
[0098]图6表明，TO代转GAPDH基因非抗虫棉花材料沪749513的种子中部分种子有较强的耐盐性，发芽很好，发芽率达16.3%，而对照组非抗虫棉花材料沪749513的种子耐盐性明显较差，发芽率为0.08%，对照组中有一个种子发芽，但是其根部发黑已死亡。转空载体PBI121的非抗虫棉花材料沪749513的结果与对照组一致。
【权利要求】
1.GAPDH蛋白，为如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.2所示的蛋白； (2)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为如下中至少一种: 1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种制备转GAPDH基因棉花的方法，包括如下步骤:将权利要求2或3所述编码基因导入出发棉花中，得到转基因棉花；与出发棉花相比，转基因棉花的耐盐性增强。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体PBI121的多克隆位点得到的。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述编码基因通过基因枪活体转化的方法导入； 和/或，所述转基因棉花的耐盐性增强是指转基因棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率高于出发棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率。
8.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述编码基因在提高棉花耐盐性中的应用； 所述的耐盐性为耐0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液的性质； 所述提高棉花耐盐性是指棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率提高。
【文档编号】C12N15/70GK103468655SQ201310396389
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】叶武威, 阴祖军, 孔静静, 王德龙, 王俊娟, 樊伟莉, 王帅 申请人:中国农业科学院棉花研究所