肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法
【专利摘要】本发明公开了肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法，其中肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备方法包括肠炎沙门氏菌的液体培养、鸡肉基质前处理、标准物质的制备、标准物质的包装与储存、标准物质的定值；肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备方法包括总gDNA的提取、总gDNA的特征性验证、SE-gDNA标准物质的制备、SE-gDNA标准物质的包装与储存、标准物质的定值。本发明提供的标准物质能够发挥包括鉴定、评价、分析、安全监控等用途，为生物特性标准物质的研制提供参考价值。
【专利说明】肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品检测【技术领域】，具体涉及肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法。
【背景技术】
[0002]肠炎沙门氏菌enteritidis , SE)是引起食物中毒的常见致病菌,在公共卫生学上具有重要意义，家禽、蛋及肉类产品是SE的主要传播媒介，严重影响着养殖业的发展和人类健康，因此对易受SE污染的食品在流入市场前应进行严格的检测。
[0003]动物性食品安全问题被作为一个社会健康问题受到广泛的关注，与之相应的检测能力也正在不断提高，安全检测技术朝准确、快速、便捷的方向研发。检测工具，新的设备和试剂盒层出不穷，尤其是在免疫学、生物化学和分子生物学等方面更是研制出了各种新型的快速检测试剂盒，在提高沙门氏菌的检测速度，简化样品处理的繁杂步骤的同时降低了检测人员的操作要求，使其对试剂盒的利用产生依赖性。然而检测用试剂盒被广泛应用于市场，却没有统一的管理系统和规范的参照标准对其进行评估，造成这些试剂盒在质量上出现参差不齐的状况，表现在灵敏度、特异性和稳定性有所差异，使得各实验室间/各检测人员间检测结果在真实性上得不到保障，难免出现动物性食品中肠炎沙门氏菌的错检或漏检，不仅有可能导致我国进出口在国际贸易中发生重大经济损失，还有可能对人类的健康造成威胁。而目前，我国在动物性食品安全检测试剂盒上的管理基本处于空白，为了在提高肠炎沙门氏菌检测效率的同时保障实验室间以及检测人员间的检测能力，确保检测结果的有效性，必须规范对试剂盒产品的使用，填补管理上的空白，因此，研发可用于试剂盒和日常检测质量控制的标准物质势在必行。
[0004]然而，目前无论国内外对食品安全检测领域中的标准物质研究甚少，对于微生物标准物质的研究制备还是处于起步阶段，我国标准值的研制开始于20世纪80年代，研究至今我国标准物质虽已基本满足经济建设的需要，但随着科学技术的发展和新型材料设备的不断涌现，现有的标准物质品种已不能完全满足需求，尤其是在生物标准物质范围，我国研制的与食品分析有关的有证标准物质约390种，这些标准物质均为生物成分分析标准物质，主要用在食品安全、营养评价、环境卫生评价等方面。虽然我国在标准物质的研究上经过了 20多年的研究，但是依然存在以下问题:种类少、重复研制现象多，在与微生物、畜禽等相关的成分标准物质的研究上还相对空白，研制的标准物质准确度不闻，且很多标准物质不能提供出不确定度的参考信息。
[0005]生物标准物质分为生物成分标准物质和生物特性标准物质。菌种标准物质及菌种核酸标准物质是生物特性标准物质中较为特殊的一类，是生物标准物质研究的重要内容之一。而目前与微生物、畜禽等相关的成分标准物质的研究上还相对空白，研制的标准物质准确度不高，且很多标准物质不能提供出不确定度的参考信息。
[0006]为确保检验人员的检测能力、规范试剂盒的管理，降低食品中SE的检漏和检错率，应加大力度研制相关的生物特性标准物质，以使SE检测结果真实可靠。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是为鉴定、评价、分析、安全监控食品中肠炎沙门氏菌提供标准物质，并为生物成分标准物质、生物特性标准物质的制备及验证提供参考价值。
[0008]本发明的技术方案是:
一种肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备方法，其特征在于:包括肠炎沙门氏菌的液体培养、鸡肉基质前处理、标准物质的制备、标准物质的包装与储存、标准物质的定值。具体步骤如下:
(1)肠炎沙门氏菌的液体培养
挑取单菌落于6mL无菌水中，涡旋振荡器上混匀，吸取ImL菌悬液于盛有IOOmLBPW增菌液的锥形瓶中，36 ± I °C培养22h ；
(2)鸡肉基质前处理
鸡肉切成小块，并用剪刀挑除非肉组织，用高速组织捣碎机搅碎IOmin至肉糜状，收集肉糜500g/袋分装于均质袋,用拍击式均质器匀质3min后保存,选择高压蒸汽121°C,灭菌15min或钴-60灭菌,计量为6KGY ；
(3)标准物质的制备
根据肠炎沙门氏菌液体培养的0D_值，用无菌生理盐水将其稀释至IO3级，将保护剂与稀释至IO3级的新鲜菌悬液按照5:1比例配制混合液，测定其pH值并用0.2M的NaOH调pH至7±0.1,于无菌均质袋中与25g鸡肉基质混合后，于拍击式均质器上拍击IOs,倒入已灭菌的50mLPP瓶，轻轻旋上瓶盖，将制备好的样品于_70°C预冻5h后冻干；
(4)标准物质的包装与储存
冻干后的样品，连PP瓶一同装入铝箔袋中，在真空封口机上封口，制备好的标准物质于_20°C保存；
(5)标准物质的定值
吸取ISmL无菌水对冻干物进行溶解复原，静置后全部倒入无菌带滤膜均质袋中，吸取25mL无菌磷酸盐缓冲液混合，拍击均质lmin，制成1:2的初始菌悬液；用移液管吸取500 μ L的初始悬浮液的滤过部分于沙门氏菌显色培养基，涂布平板，静置，使液体被琼脂吸收后倒置放入培养箱中培养，36土 TC培养18~24h，计数典型菌落数，即为标准值；定值结果表示为:标准值土总不确定度。
[0009]其中，所述的步骤(3)中保护剂配方为20%脱脂奶+10%蔗糖+3%L_谷氨酸钠-水+ 纯水，pH 值=6.7±0.I。
[0010]一种肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备方法，其特征在于:包括总gDNA的提取、总gDNA的特征性验证、SE-gDNA标准物质的制备、SE-gDNA标准物质的包装与储存、标准物质的定值。具体步骤如下:
(1)总gDNA的提取
取新鲜菌液，菌浓度达到0.5-1.5X 109cells，提取gDNA，并进行gDNA纯度和浓度的初检测，将提取的符合要求的gDNA溶液合并混匀，利用荧光仪结合PicoGreen染料对提取的总gDNA进行浓度的测定；
(2)总gDNA的特征性验证
以invA-l、invA-2作为引物，PCR扩增后进行凝胶电泳，另取10 μ L的总gDNA溶液进行核酸凝胶电泳；对总gDNA的PCR反应产物进行纯化，回收纯化的样品进行克隆测序；
(3)SE-gDNA标准物质的制备
将符合标准物质制备要求的总gDNA溶液用TE溶液稀释至适当浓度，用已灭菌的小型离心管分装，使每支gDNA含量为I μ g ;于-70°C预冻6h后，置于冷冻干燥机冻干；
(4)SE-gDNA标准物质的包装与储存
将冻干好的样品放入塑料袋中，立即用封口机封口，贮存于_20°C ；
(5)标准物质的定值
利用荧光值法进行定值，定值结果表示为:标准值土总不确定度。
[0011]其中，所述的步骤(1)总gDNA提取的纯度在1.75-1.90，浓度在70-100 μ g/mL范围内。
[0012]所述的步骤(2)弓丨物invA-1、invA-2的序列为:
【权利要求】
1.一种肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备方法，其特征在于:包括肠炎沙门氏菌的液体培养、鸡肉基质前处理、标准物质的制备、标准物质的包装与储存、标准物质的定值。
2.根据权利要求1所述的肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备方法，其特征在于具体步骤如下: (1)肠炎沙门氏菌的液体培养 挑取单菌落于6mL无菌水中，涡旋振荡器上混匀，吸取ImL菌悬液于盛有IOOmLBPW增菌液的锥形瓶中，36±1°C培养22h ； (2)鸡肉基质前处理 鸡肉切成小块，挑除非肉组织，搅碎至肉糜状，收集于均质袋，用拍击式均质器匀质后保存，选择高压蒸汽121°C，灭菌15min或钴-60灭菌，计量为6KGY ； (3)标准物质的制备 根据肠炎沙门氏菌液体培养的OD_，用无菌生理盐水将其稀释至IO3级，将保护剂与稀释至IO3级的新鲜菌悬液按照5:1比例配制混合液，测定其pH值并调pH值至7±0.1，于无菌均质袋中与25g基质混合后，均质器上拍击10s，倒入已灭菌的50mLPP瓶，轻轻旋上瓶盖，将制备好的样品于_70°C预冻5h后冻干； (4)标准物质的包装与储存 冻干后的样品，连PP瓶一同装入铝箔袋中，在真空封口机上封口，制备好的标准物质于_20°C保存； (5)标准物质的定值 用无菌水对冻干物进行溶解复原，静置后全部倒入无菌带滤膜均质袋中，吸取25mL无菌磷酸盐缓冲液混合，拍击均质，制成初始菌悬液；用移液管吸取500 μ L初始悬浮液的滤过部分于沙门氏菌显色培养基，涂布平板，静置，使液体被琼脂吸收后倒置放入培养箱中培养，36±1°C培养If 24h，计数典型菌落数，即为标准值；定值结果表示为:标准值土总不确定度。
3.根据权利要求2所述的肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备方法，其特征在于:所述的步骤(3)中保护剂配方为20%脱脂奶+10%蔗糖+3%L-谷氨酸钠-水+纯水，pH=6.7 + 0.10
4.一种肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备方法，其特征在于:包括总gDNA的提取、总gDNA的特征性验证、SE-gDNA标准物质的制备、SE-gDNA标准物质的包装与储存、标准物质的定值。
5.根据权利要求4所述的肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备方法，其特征在于具体步骤如下: (1)总gDNA的提取 取新鲜菌液，菌浓度达到0.5-1.5X 109cells，提取gDNA，并进行gDNA纯度和浓度的初检测，将提取的符合要求的gDNA溶液合并混匀，利用荧光仪结合PicoGreen染料对提取的总gDNA进行浓度 的测定； (2)总gDNA的特征性验证 以invA-l、invA-2作为引物，PCR扩增后进行凝胶电泳，另取10 μ L的总gDNA溶液进行核酸凝胶电泳；对总gDNA的PCR反应产物进行纯化，回收纯化的样品进行克隆测序； (3)SE-gDNA标准物质的制备将符合标准物质制备要求的总gDNA溶液用TE溶液稀释至适当浓度，用已灭菌的小型离心管分装，使每支gDNA含量为I μ g ;于-70°C预冻6h后，置于冷冻干燥机冻干； (4)SE-gDNA标准物质的包装与储存 将冻干好的样品放入塑料袋中，立即用封口机封口，贮存于_20°C ； (5)标准物质的定值 利用荧光值法进行定值，定值结果表示为:标准值土总不确定度。
6.根据权利要求5所述的肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备方法，其特征在于:所述的步骤(1)总gDNA提取的纯度在1.75-1.90，浓度在70-100 μ g/mL范围内。
7.根据权利要求5所述的一种肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备方法，其特征在于:所述的步骤(2)引物invA-1、invA-2的序列为:
【文档编号】C12Q1/68GK103627790SQ201310411939
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】黄晓蓉, 柯璐, 郑晶, 林杰 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心