一种大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体及其应用的制作方法

一种大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体及其应用。所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体为含有酵母DNA复制子和酵母筛选标记基因的双元载体。所述应用为大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体在向真菌或植物细胞转化DNA中的应用。本发明的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体是世界上首次报道的、可以同时在酵母、大肠杆菌和农杆菌内复制、增殖并稳定存在的质粒，该穿梭表达载体可以直接通过农杆菌介导的方式转化真菌或植物细胞，缩短了基因操作的流程和时间，使用方便、工作效率高，且制备过程简便、快速、高效。
【专利说明】一种大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及一种大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002]转基因技术是一种把人工分离或修饰过的DNA片段导入到生物体基因组中，弓丨起某种基因的表达或不表达，使生物体的性状发生可遗传的改变。在生产和科学研究中，植物和真菌是两类广泛进行的转基因对象。转化的DNA片段一般用于基因表达、基因敲除或基因沉默等，目的在于研究基因的功能，提闻植物的抗病能力、增广、改善品质，提闻工业真菌的生产效率等。植物和真菌的DNA转化有许多方法，其中农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)是一种效率最高的方法。农杆菌介导需要利用双元载体(binary vector),双元载体含有一段T-DNA序列,农杆菌通过侵染植物或真菌细胞，可将T-DNA插入到植物基因组中。
[0003]目前使用的双元载体有pCAMBIA 系列(如 pCAMBIA1300)、pBHtl、pSN1301、PUN1301、PSN1301等。这些双元载体一般含有大肠杆菌的DNA复制子和细菌筛选标记(如Amp>Kana>TET等抗性基因)，同时含有农杆菌的DNA复制子(如pVSl_origin、pVSl_REP等)和T-DNA序列。因而，这些双元载体为大肠杆菌-农杆菌穿梭表达载体，可以在大肠杆菌和农杆菌内复制、增殖。但是目前所有这些双元载体都不能在酵母细胞内复制、增殖。
[0004]用于转化真菌或植物的DNA片段一般是由几个小片段组成，进行DNA转化时，通常是先将这些片段通过限制性内切酶酶切的方法插入到大肠杆菌体内的双元载体中构建重组载体，然后从大肠杆菌提取重组载体DNA，转化到农杆菌(如AGLl)体内，再转化到植物或真菌细胞。`
[0005]上述载体构建方法不足之处在于，效率非常低、耗时长、不适于高通量的DNA转化和基因敲除操作。
[0006]而酵母同源重组是一个高效、快速、而且适于高通量DNA转化的载体构建方法。具有酵母复制子和酵母筛选标记的DNA载体可以用于DNA的同源重组。这些载体有PYES2、pYIP5、pPICZ、pRS426等等，其特点在于含有一个酵母DNA复制子(如2micro2_origin)、酵母筛选标记基因(如URA3、LEU2、HIS3等)，同时这些载体一般还含有大肠杆菌的DNA复制子和细菌筛选标记(如Amp.Kana.TET等抗性基因)。因而，这些酵母质粒为大肠杆菌-酵母穿梭表达载体，可以在酵母和大肠杆菌细胞内复制、增殖。
[0007]但是目前所有这些大肠杆菌-酵母穿梭表达载体都不能在农杆菌细胞内复制、增殖，因此不能直接用于农杆菌介导的DNA转化过程。利用酵母同源重组法构建的DNA融合片段(基因表达序列、基因敲除结构等)需要从酵母质粒使用限制性内切酶切下目的DNA片段后，再插入大肠杆菌-农杆菌穿梭表达载体，然后用于农杆菌介导的DNA转化。这使得载体构建的效率低下、不适于高通量的ATMT操作。
【发明内容】

[0008]本发明提供了一种大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体，该穿梭表达载体能在大肠杆菌、农杆菌和酵母细胞内复制增殖，可用于向真菌或植物细胞进行高效、快速、高通量的DNA转化。
[0009]一种大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体，它为含有酵母DNA复制子和酵母筛选标记基因的双元载体。
[0010]双元载体是一种大肠杆菌-农杆菌穿梭载体，既有大肠杆菌复制起点又有农杆菌复制起点，本发明将酵母DNA复制子重组到双元载体中，酵母DNA复制子的复制起点被酵母细胞的复制相关蛋白识别，从而使所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体获得在酵母细胞中复制、增殖以及稳定存在的能力，用于进行高效、快速、高通量的DNA转化。
[0011]作为优选，所述双元载体为pCAMBIA系列载体、？8价1、？3附301或？^1301。作为进一步优选，所述双元载体为pCAMBIA系列载体。作为最优选，所述双元载体为pCAMBIA1300。
[0012]pCAMBIA1300质粒中含有大肠杆菌的DNA复制子pBR322_origin以及农杆菌的DNA复制子pVSl_origin和T-DNA序列，还含有Kana抗性基因，Kana抗性基因是大肠杆菌和农杆菌共同的筛选基因，可直接作为筛选标记，不必另外插入抗性基因。当然，根据需要也可将Kana抗性基因替换为Amp、Tet、Cmr和Spec抗性基因。
[0013]本发明中，所述酵母DNA复制子可选用2micro2_origin、25ym、ARSl、ARS3002或ARS3003。对酵母DNA复制子在所述双元载体中的插入位置没有特殊要求。
[0014]为便于该大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体在转化酵母细胞后筛选转化成功的菌落，所述大肠杆菌-酵母`-农杆菌穿梭表达载体还含有酵母筛选标记基因。作为优选，所述酵母筛选标记基因为 URA3、HI S3、LEU2、LYS2、TRP1、MET 15、ADE2 或 ADEI。
[0015]本发明所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体还包含H3启动子和荧光蛋白基因，所述荧光蛋白基因可选用绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因，用于指示本发明大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体携带的目的基因是否在受体细胞中表达。
[0016]H3启动子用于驱动荧光蛋白基因在受体细胞中表达，其碱基序列如SEQ ID N0.1所示。荧光蛋白基因的启动子可以根据受体细胞的种类而选择，优选受体细胞自身含有的强启动子。SEQ ID N0.2所示的碱基序列是稻瘟病菌H3启动子序列的一部分，稻瘟病菌H3启动子序列是一个强启动子，在稻瘟病菌的菌丝、孢子和附着胞阶段都具有强启动作用。利用H3启动子启动荧光蛋白基因表达作为负筛选标记，可以提高转化子的筛选效率。
[0017]所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体的构建方法，包括:
[0018]先将H3启动子序列和荧光蛋白基因依次插入所述植物双元载体中，获得初始重组载体；
[0019]再将酵母DNA复制子、酵母筛选基因和初始重组载体混合，转化酵母细胞，经酵母同源重组后获得所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体。
[0020]本发明还提供了含有所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体的重组菌株。所述重组菌株为酵母或大肠杆菌。
[0021 ] 本发明还提供了所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体在向真菌或植物细胞转化DNA中的应用。利用该穿梭表达载体能够实现含有目的基因的重组载体的快速构建、在真菌或植物细胞中的快速转化以及突变体的高效筛选。[0022]具体地,所述应用包括:
[0023]( I)将目的基因与所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体一起转化酵母细胞，经酵母同源重组获得重组表达载体；
[0024](2)通过农杆菌介导转化法将所述重组表达载体转入真菌或植物细胞中，并在选择性培养基上挑取转化子。
[0025]当用于基因敲除时，从受体细胞基因组中克隆待敲除基因的上游同源序列和下游同源序列，将该上游同源序列和下游同源序列、适宜的抗性基因以及酶切过的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体混合，转化酵母感受态细胞；经酵母同源重组获得含有基因敲除结构(待敲除基因的上游同源序列-抗性基因-待敲除基因的下游同源序列)的基因敲除载体；将该基因敲除载体转化农杆菌，然后经ATMT法转化到受体细胞中，并在选择性培养基上挑取转化子；在荧光显微镜下，发荧光的转化子为随机插入的转化子，不发荧光的转化子为基因敲除突变体。
[0026]当用于基因表达时，克隆目的基因及其启动子，或者仅克隆目的基因的编码区、另外PCR克隆其他来源的合适的启动子；然后将带有启动子的目的基因或者目的基因的编码区和适宜启动子、适宜的抗性基因以及酶切过的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体混合，转化酵母感受态细胞；经酵母同源重组获得含有目的基因的基因表达载体；将该基因表达载体转化农杆菌，然后经ATMT法转化到受体细胞中，并在选择性培养基上挑取转化子；提取转化细胞(植物或真菌)的总蛋白，根据目的蛋白的特性，采用Western blot或酶活测定等方法鉴定目的基因是否表达及其表达量。
[0027]本发明的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体虽然都能用于向真菌或植物细胞中转化DNA，但由于植物细胞的特殊性，致使DNA重组效率非常低，因此该大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体只能用于实现植物细胞中的基因表达，无法用于实现植物细胞中的基因敲除。`
[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0029]本发明的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体是世界上首次报道的、可以同时在酵母、大肠杆菌和农杆菌内复制、增殖并稳定存在的质粒，该穿梭表达载体可以直接通过农杆菌介导的方式转化真菌或植物细胞，缩短了基因操作的流程和时间，使用方便、工作效率高，且制备过程简便、快速、高效。
【专利附图】

【附图说明】
[0030]图1为pCAMBIA1300载体的质粒图谱；
[0031]图2为ρΚΟΙΑ载体的质粒图谱；
[0032]图3为ρΚΟΙΑ-RED载体的质粒图谱；
[0033]图4为ρΚΟΙΒ载体的质粒图谱；
[0034]图5为ρΚΟΙΒ-RED载体的质粒图谱；
[0035]图6为pK01B-HIS3载体的质粒图谱；
[0036]图7为pK01B-LEU2载体的质粒图谱；
[0037]图8为pK01B-LYS2载体的质粒图谱；
[0038]图9为ρΚΟΙΒ-TRPl载体的质粒图谱；[0039]图10为pK01B-MET15载体的质粒图谱；
[0040]图11为pK01B-ADE2载体的质粒图谱；
[0041]图12为ρΚΟΙΒ-ADEl载体的质粒图谱；
[0042]图13为使用绿色荧光标记筛选基因敲除突变体的结果图；
[0043]图14为对基因敲除突变体进行PCR验证的电泳结果图。
【具体实施方式】
[0044]实施例1
[0045]大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体ρΚΟΙΒ或ρΚΟΙΒ-RED的构建方法，包括:
[0046]I构建携带H3启动子和荧光蛋白基因的大肠杆菌-农杆菌穿梭表达载体
[0047](I)获取稻瘟病菌H3启动子
[0048]以pKD5质粒为模板，利用引物al/a2进行高保真PCR扩增，获取H3启动子序列(长度为1.5kb)的部分序列(长度为1.2kb)，引物al/a2的碱基序列如下:
[0049]h游引物 a 1:5’-TTCTCGAGGTGTATTTTCTTTCTGCTCG-3’ (下划线处为 Xho I 酶切位点)；
[0050]下游引物a2:5，-TTGAATTCGGCCATTGTGATTGATTTGT-3，(下划线处为 EcoRI 酶切位点)。`
[0051]PCR 反应体系为:pKMDNAlOng，高保真 DNA 聚合酶 0.5μ L，dNTP (50mM) 0.4μ L,上下游引物各0.5 μ L，IOx PCR缓冲液5 μ L，加水至50 μ L。
[0052]PCR反应条件为:94V 3分钟，35个循环(94°C 30秒，58°C I分钟，72°C I分钟20秒)，72°C 10分钟。
[0053]PCR产物经琼脂糖电泳，切下1.2kb大小的目的条带，经胶回收纯化，连接到PGEM-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。
[0054]将酶切鉴定正确的Η3启动子经Xho I和EcoR I双酶切后插入pCAMBIA1300载体(如图1所示)的Xho I和EcoR I位点之间，重组pCAMBIA1300载体经酶切验证后命名为ρΚΟΙΟ。
[0055](2)插入绿色荧光蛋白基因
[0056]以pEGFP质粒为模板，利用引物bl/b2进行PCR扩增，获取0.7kb的GFP基因片段，引物bl/b2的碱基序列为:
[0057]上游引物bl:5，-ATGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3，(下划线处为 EcoRI 酶切位点)；
[0058]下游引物b2:5’ -ATGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3，(下划线处为 Sac I 酶切位点)；
[0059]PCR 反应体系为:pEGFP DNAlOng,高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下游引物各0.5 μ L，IOx PCR缓冲液5 μ L，加水至50 μ L。
[0060]PCR 反应条件为:94 °C 3 分钟，35 个循环(94 °C 30 秒，56 °C 30 秒，72 °C 40 秒)，72 °C 10 分钟。
[0061]PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收纯化后克隆到pGEM-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。
[0062]酶切鉴定正确的重组pGEM-T载体用EcoR I和Sac I酶切，将酶切片段(GFP基因片段)插入ρΚΟΙΟ载体的EcoR I和Sac I位点之间；重组ρΚΟΙΟ载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定，将验证正确的载体命名为ρΚΟΙΑ (如图2所示)。
[0063](3)插入红色突光蛋白基因
[0064]以pDsRED2质粒为模板，利用引物cl/c2进行PCR扩增，获取0.7kb的DsRED2基因片段，引物Cl (上游引物)/c2 (下游引物)的碱基序列为:
[0065]cl:5，-AAGAATTCATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3> ；
[0066]c2:5， -AAGAGCTCCAGGAACAGGTGGTGGCG-3，；
[0067]PCR 反应体系为:pDsRED2DNA10ng，高保真 DNA聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下游引物各0.5 μ L，IOx PCR缓冲液5 μ L，加水至50 μ L。
[0068]PCR 反应条件为:94 °C 3 分钟，35 个循环(94 °C 30 秒，56 °C 30 秒，72 °C 40 秒)，72 0C 10 分钟。
[0069]PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收纯化后克隆到pGEM-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。
[0070]酶切鉴定正确的重组`pGEM-T载体用EcoR I和Sac I酶切，将酶切片段(DsRED基因片段)插入ρΚΟΙΟ载体的EcoR I和Sac I位点之间；重组ρΚΟΙΟ载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定，将验证正确的载体命名为ρΚΟΙΑ-RED (如图3所示)。
[0071 ] 2构建大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体
[0072]以pYES2质粒为模板，利用引物dl/d2进行PCR扩增，获取2.9kb的2micro2_origin和URA3基因的DNA片段，引物dl/d2的碱基序列为:
[0073]上游引物dl:5’ -GTATCGACGGAGCCGATTTTGAAA
[0074]CCGCGGGGAACAACACTCAACCCTA-3，(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0075]下游引物也:5’ -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCA
[0076]CCGCGGTTCGATGTAACCCACTCG-3，(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0077]PCR 反应体系为:pYES2DNA10ng，高保真 DNA聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下游引物各0.5 μ L，IOx PCR缓冲液5 μ L，加水至50 μ L。
[0078]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94 °C 30秒，57 °C 30秒，72 °C 3分钟)，72 0C 10 分钟。
[0079]PCR产物经电泳验证正确后，取4 μ L PCR产物和IOOng Sac II酶切后的ρΚΟΙΑ载体或ρΚΟΙΑ-RED载体混合，使用Invitrogen公司的商品化试剂盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)转化酿酒酵母菌株FY834的感受态细胞；
[0080]转化酵母细胞涂在SC-URA筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-URA筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒；质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5ci，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，测序鉴定。将验证正确的载体命名为ρΚΟΙΒ (如图4所示)或ρΚΟΙΒ-RED (如图5所示)。
[0081]实施例2
[0082]大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体PK01B-HIS3的构建方法，包括:
[0083]I根据实施例1步骤1- (I) (2)的方法构建ρΚΟΙΑ载体；
[0084]2 构建 pK01B-HIS3
[0085](I)获取 2micro2_origin DNA 片段
[0086]以pYES2质粒为模板，利用引物el/e2进行PCR扩增，获取1.1kb的2micro2_originDNA片段,引物el/e2的碱基序列为:
[0087]上游引物e 1: 5 ’ -GTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGG
[0088]GCTAGCTTTTCAATTCAATTCATC-3’(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0089]下游引物e2:5，-TTCGATGTAACCCACTCGTGCA-3，；
[0090]PCR 反应体系为:pYES2DNA10ng，高保真 DNA聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下游引物各0.5 μ L，IOx PCR缓冲液5 μ L，加水至50 μ L。
[0091]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分钟10秒)，72°C 10分钟。`
[0092]获得的PCR产物(2micro2_origin DNA片段)经电泳验证,并胶回收纯化。
[0093](2)获取HIS3基因片段
[0094]利用HIS3的PCR引物，从pTAL3_His载体经PCR获得1.3kb长的HIS3基因的DNA片段，
[0095]上游引物fl:5’ -ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0096]CGAAGTTCGTATAAATACTTACTGACA-3’ ；
[0097]下游引物f2:5 ’ -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0098]CTTCATTCCGTAACTCTTCTACCT-3’(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0099]PCR 反应体系为:pTAL3_His DNAIOng,高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下游引物各 0.5 μ L, IOx PCR 缓冲液 5 μ L，加水至 50 μ L。
[0100]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分钟20秒)，72°C 10分钟。
[0101]获得的PCR产物(HIS3基因的DNA片段)经电泳验证，并胶回收纯化。
[0102]各取4μ L上述2种PCR产物(2micro2_origin DNA片段和HIS3基因片段)和IOOngSac II酶切后的ρΚΟΙΑ载体混合,使用Invitrogen公司的商品化试剂盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)转化酿酒酵母菌株FY834的感受态细胞。转化酵母细胞涂在SC-HIS筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-HIS筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，测序鉴定。将验证正确的载体命名为pK01B-HIS3(如图6所示)。
[0103]实施例3
[0104]大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体PK01B-LEU2的构建方法，包括:[0105]I根据实施例1步骤1- (I) (2)的方法构建ρΚΟΙΑ载体；
[0106]2 构建 pK01B-LEU2
[0107](I)根据实施例2步骤2- (I)的方法获取2micro2_origin DNA片段；
[0108](2)获取LEU2基因片段
[0109]以pTAL4_Leu质粒为模板，利用引物gl/g2进行PCR扩增，获取2.2kb长的LEU2基因片段，引物gl/g2的喊基序列为:
[0110]上游引物gl:5，-ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0111]CGAATCATATAATTTCTGTTGAATTAC-3’ ；
[0112]下游引物g2:5 ’ -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0113]CGTCTACCCTATGAACATATTCCA-3’(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0114]PCR 反应体系为:pTAL4_Leu DNAIOng,高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下游引物各 0.5 μ L, IOx PCR 缓冲液 5 μ L，加水至 50 μ L。
[0115]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C 2分钟20秒)，72°C 10分钟。
[0116]获得的PCR产物(LEU`2基因片段)经电泳验证，并胶回收纯化。
[0117]各取4μ L上述2种PCR产物(2micro2_origin DNA片段和LEU2基因片段)和IOOngSac II酶切后的ρΚΟΙΑ载体混合,使用Invitrogen公司的商品化试剂盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)转化酿酒酵母菌株FY834的感受态细胞；转化酵母细胞涂在SC-LEU筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-LEU筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，测序鉴定。将验证正确的载体命名为PK01B-LEU2(如图7所示)。
[0118]实施例4
[0119]大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体PK01B-LYS2的构建方法，包括:
[0120]I根据实施例1步骤1- (I) (2)的方法构建ρΚΟΙΑ载体；
[0121]2 构建 pK01B-LYS2
[0122](I)根据实施例2步骤2- (I)的方法获取2micro2_origin DNA片段；
[0123](2)获取LYS2基因片段
[0124]以pRS307质粒为模板，利用引物hl/h2进行PCR扩增，获取5.0kb的LYS2基因片段；引物hl/h2的喊基序列为:
[0125]上游引物h 1: 5 ’ -ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0126]CGAATCTCCTAATTCATATTTAATTATTGT-3’ ；
[0127]下游引物h2:5 ’ -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0128]GCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGC-3’(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0129]PCR 反应体系为:pRS307DNA10ng，高保真 DNA 聚合酶(λ 5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下游引物各0.5 μ L，IOx PCR缓冲液5 μ L，加水至50 μ L。
[0130]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 5分钟10#),72°C 10 分钟。
[0131]获得的PCR产物(LYS2基因片段)经电泳验证，并胶回收纯化。
[0132]各取4μ L上述2种PCR产物(2micro2_origin DNA片段和LYS2基因片段)和IOOngSac II酶切后的ρΚΟΙΑ载体混合,使用Invitrogen公司的商品化试剂盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)转化酿酒酵母菌株FY834的感受态细胞。转化酵母细胞涂在SC-LYS筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-LYS筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，测序鉴定。将验证正确的载体命名为pK01B-LYS2(如图8所示)。
[0133]实施例5
[0134]大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体ρΚΟΙΒ-TRPl的构建方法，包括:
[0135]I根据实施例1步骤1- (I) (2)的方法构建ρΚΟΙΑ载体；
[0136]2 构建 pKOlB-TRPl
[0137](I)根据实施例2步骤2- (I)的方法获取2micro2_origin DNA片段；
[0138](2)获取TRPl基因片段
[0139]以pYES2.1-TRPl质粒为模板，利用引物il/i2进行PCR扩增，获取1.6kb长的TRPl基因片段，引物il/i2的喊基序列为:`[0140]上游引物i 1: 5，-ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0141]CGAAGATGATCCACTAGTACGGATTAGA-3’ ；
[0142]下游引物i 2:5 ’ -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0143]TTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCA-3’(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0144]PCR 反应体系为:pYES2.1-TRPlDNAlOng,高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下游引物各 0.5 μ L，IOx PCR 缓冲液 5 μ L，加水至 50 μ L。
[0145]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分钟40#),72°C 10 分钟。
[0146]获得的PCR产物(TRP1基因片段)经电泳验证，并胶回收纯化。
[0147]各取4μ L上述2种PCR产物(2micro2_origin DNA片段和TRPl基因片段)和IOOngSac II酶切后的ρΚΟΙΑ载体混合,使用Invitrogen公司的商品化试剂盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)转化酿酒酵母菌株FY834的感受态细胞。转化酵母细胞涂在SC-TRP筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-TRP筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，测序鉴定。将验证正确的载体命名为ρΚΟΙΒ-TRPl (如图9所示)。
[0148]实施例6
[0149]大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体PK01B-MET15的构建方法，包括:
[0150]I根据实施例1步骤1- (I) (2)的方法构建ρΚΟΙΑ载体；
[0151]2 构建 pK01B-MET15
[0152](I)根据实施例2步骤2- (I)的方法获取2micro2_origin DNA片段；[0153](2)获取MET15基因片段
[0154]以PXP214质粒为模板，利用引物jl/j2进行PCR扩增，获取1.7kb长的MET15基因片段，引物jl/j2的碱基序列为:
[0155]上游引物j 1: 5 ’ -ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCG
[0156]AAATCCCCGGGATAACTTCGTATA-3’ ；
[0157]下游引物j2:5 ‘-ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0158]AGCTCGGTACCCGGGATAACTTCGT-3’(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0159]PCR 反应体系为:pXP214DNA10ng，高保真 DNA 聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下游引物各0.5 μ L，IOx PCR缓冲液5 μ L，加水至50 μ L。
[0160]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分钟50秒)，72°C 10分钟。
[0161]获得的PCR产物(MET15基因片段)经电泳验证，并胶回收纯化。
[0162]各取4μ L上述2种PCR产物(2micro2_origin DNA片段和MET15基因片段)和IOOng Sac II酶切后的ρΚΟΙΑ载体混合，使用Invitrogen公司的商品化试剂盒(S.c.EasyComp Transformation Kit)转化酿酒酵母菌株FY834的感受态细胞。转化酵母细胞涂在SC-MET筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-MET筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行`培养，提取质粒，测序鉴定。将获得的验证正确的载体命名为ΡΚ01Β-ΜΕΤ15 (如图10所示)。
[0163]实施例7
[0164]大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体PK01B-ADE2的构建方法，包括:
[0165]I根据实施例1步骤1- (I) (2)的方法构建ρΚΟΙΑ载体；
[0166]2 构建 pK01B-ADE2
[0167](I)根据实施例2步骤2- (I)的方法获取2micro2_origin DNA片段；
[0168](2)获取ADE2基因片段
[0169]以pRSII312质粒为模板，利用引物kl/k2进行PCR扩增，获取2.3kb长的ADE2基因片段，引物kl/k2的碱基序列为:
[0170]上游引物kl:5，-ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCG
[0171]AAGAATTAATTCTTGAATAATACAT-3’ ；
[0172]下游引物k2:5 ‘ -ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG
[0173]TATGTATGAAATTCTTAAAAAAGG-3’(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0174]PCR 反应体系为:pRSII312DNA10ng，高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L，dNTP (50mM) 0.4 μ L，上下游引物各 0.5 μ L, IOx PCR 缓冲液 5 μ L，加水至 50 μ L。
[0175]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C 2分钟20秒)，72°C 10分钟。
[0176]获得的PCR产物(ADE2基因片段)经电泳验证，并胶回收纯化。
[0177]各取4μ L上述2种PCR产物(2micro2_origin DNA片段和ADE2基因片段)和IOOngSac II酶切后的ρΚΟΙΑ载体混合，使用Invitrogen公司的商品化试剂盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)转化酿酒酵母菌株FY834的感受态细胞。转化酵母细胞涂在SC-ADE筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-ADE筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，测序鉴定。将获得的验证正确的载体命名为PK01B-ADE2(如图11所示)。
[0178]实施例8
[0179]大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体ρΚΟΙΒ-ADEl的构建方法，包括:
[0180]I根据实施例1步骤1- (I) (2)的方法构建ρΚΟΙΑ载体；
[0181]2 构建 ρΚΟΙΒ-ADEl
[0182](I)根据实施例2步骤2- (I)的方法获取2micro2_origin DNA片段；
[0183](2)获取ADEl基因片段
[0184]以YCpADEl质粒为模板，利用引物11/12进行PCR扩增，获取1.3kb长的ADEl基因片段，引物11/12的碱基序列为:
[0185]上游引物11:5 ’ -ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
[0186]CGACTTATTCACGAGTCAGTCTGACT-3’ ；
[0187]下游引物12:5，-ACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCACCGCGG`[0188]CGATAAAATTTGCTCTGAGAACAT-3’(下划线处为 Sac II 酶切位点)；
[0189]PCR 反应体系为:YCpADElDNA10ng，高保真 DNA聚合酶 0.5μ L，dNTP(50mM)0.4μ L，上下游引物各0.5 μ L，IOx PCR缓冲液5 μ L，加水至50 μ L。
[0190]PCR反应条件为:94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，57°C 30秒，72°C I分钟20秒)，72°C 10分钟。
[0191]获得的PCR产物(ADE1基因片段)经电泳验证，并胶回收纯化。
[0192]各取4μ L上述2种PCR产物(2micro2_origin DNA片段和ADEl基因片段)和IOOngSac II酶切后的ρΚΟΙΑ载体混合,使用Invitrogen公司的商品化试剂盒(S.c.EasyCompTransformation Kit)转化酿酒酵母菌株FY834的感受态细胞。转化酵母细胞涂在SC-ADE筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-ADE筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，测序鉴定。将获得的验证正确的载体命名为ρΚΟΙΒ-ADEl (如图12所示)。
[0193]实施例9pK01B载体在稻瘟病菌基因敲除中的应用
[0194]I转录因子基因(MGG_01833)敲除载体的构建
[0195](I)以稻瘟病菌基因组DNA为模板，利用引物ml/m2进行PCR扩增，获得MGG_01833基因的上游片段，引物ml/m2的喊基序列为:
[0196]上游引物序列ml:5’ -GCTGTACAAGTAAGAGCTCGGTACCCG
[0197]GGGATCGACGCCTTGGTCTGCCGTTGTTA-3’ ；
[0198]下游引物序列m2:5’ -CCGGGAGATGTGGGGCACTGTGGCGTT
[0199]GGCACAATGAAAGGATCTGGGGCGAAGTG-3，；[0200](2)以稻瘟病菌基因组DNA为模板，利用弓丨物nl/n2进行PCR扩增，获得MGG_01833基因的下游片段，引物nl/n2的喊基序列为:
[0201]上游引物序列nl:5’ -TTGATTATTGCACGGGAATTGCATGCTC
[0202]TCACATCTGAGCATGACAGCGCATAGCT-3，；
[0203]下游引物序列n2:5’ -TTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCC
[0204]AGTCACATCCCAAGACACTCGGCAAAGG-3，；
[0205](3)以pBS-SUR质粒为模板，利用引物ol/o2进行PCR扩增，获取SUR抗性基因片段，引物ol/o2的喊基序列为:
[0206]上游引物ol:5，-GTGCCAACGCCACAGTGCC-3，；
[0207]下游引物o2:5，-GTGAGAGCATGCAATTCCC-3，；
[0208]电泳验证上述PCR产物是否正确。
[0209](4)使用Xba I和Hind III双酶切ρΚΟΙΒ载体，取上述3种PCR产物各4 μ L和I μ L酶切过的ρΚΟΙΒ载体(100ng/l μ L)加入到50 μ L酿酒酵母FY834菌株的感受态细胞中，按照Invitrogen公司的试剂盒(S.c.EasyComp Transformation Kit)的步骤进行操作。转化酵母细胞涂在SC-URA筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-URA筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，通过PCR (3对引物同上)和测序鉴定。将获得的验证正确的MGG_01833基因敲除载体命名为pK01B_MGG_01833。
`[0210]2ATMT 法转化 pK01B-MGG_01833 到稻瘟病菌
[0211]将载体pK01B-MGG_01833通过冻融法转化到农杆菌菌株AGLl，然后经ATMT法转化稻瘟病菌萌发孢子中，具体步骤如下:
[0212](I)从新鲜培养的LB平板(含50mg/mL卡那霉素)上挑选一农杆菌单菌落接种于5mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)，200rpm, 28 °C过夜培养；
[0213](2)第二天将200-400 μ L培养液转移到5mL含50mg/mL卡那霉素的诱导液体培养基(頂)中，OD值约0.15，28°C培养5~6个小时使OD6tltl达到0.5~0.6 ；
[0214](3)稻瘟病菌分生孢子的收集:用IOmL灭菌蒸馏水从培养大约10天的CM平板上洗下稻瘟病菌的分生孢子，三层擦镜纸过滤后用血球计数板计数，并用无菌水稀释孢子浓度为IO6个/mL ；
[0215](4)取100 μ L培养好的农杆菌AGL-1 (含载体pK01B_MGG_01833)菌液和100 μ L稀释好的稻瘟病菌分生孢子悬浮液混合，混合液(200 μ L)均匀涂于AIM平板上的硝酸纤维素膜表面，AIM平板含200 μ mol/L乙酰丁香酮,22°C共培养48小时；
[0216](5)将硝酸纤维素膜转移到含真菌抗生素(磺胺嘧啶)与抗生素的选择平板(DCM)上，选择性培养基中含100 μ g/mL磺胺嘧啶、400mg/mL头孢霉素、60mg/mL链霉素，将平皿置于28°C下培养到转化子出现。将转化子接种到含100 μ g/mL磺胺嘧啶DCM平板上再次鉴定。
[0217]3转录因子基因(MGG_01833)敲除突变体的鉴定
[0218]挑取具有磺胺嘧啶(SUR)抗性的转化子在荧光显微镜下检测，如果转化子具有GFP基因表达的绿色荧光，则该转化子为随机插入的转化子，丢弃；如果转化子不发绿色荧光，则可能为基因敲除突变体，挑出并转移到另一个含100 μ g/mL磺胺嘧啶DCM平板上继续培养(图13)。
[0219]然后用CTAB法提取不发绿色荧光的转化子的基因组DNA ;通过双重PCR检测突变体中MGG_01833是否还存在:
[0220]使用的MGG_01833基因内部引物为:
[0221]上游序列p1:5’ -GCATCTCAACGGCAGTATCT-3’ ；
[0222]下游序列p2:5’ -ACCTGGCACAGCAAACAA-3’ ；
[0223]使用的beta-tubulin (阳性对照)基因引物为:
[0224]上游序列ql:5，-TTCCGCGCTGTCACCGTTCC-3’ ；
[0225]下游序列q2:5’ -GGGCCTCCTCCTCGTACTCCTCTT-3’。
[0226]PCR产物经过电泳后，如果具有2条电泳条带，I条为400bp，另一条为540bp的条带，则基因没有被敲除；如果只有一条540bp的条带，则基因被敲除了(图14)。获得的基因敲除突变体还可以继续通过PCR、qPCR、Southern blot、Western blot等方法在DNA、mRNA或蛋白质水平上进一步验证。
[0227]实施例ΙΟρΚΟΙΒ载体在稻瘟病菌的基因表达中的应用
[0228]以外源基因GFP基因在稻瘟病菌中的表达作为例子说明如何实现外源蛋白的表达。
[0229]1、GFP表达载体的构建
`[0230](I)以pCB1003质粒为模板，利用引物rl/r2进行PCR扩增，获得1.4kb长的潮酶素抗性基因的DNA片段，引物rl/r2的碱基序列为:
[0231]上游引物序列rl:5’ -GCTGTACAAGTAAGAGCTCGGTACCCGG
[0232]GGATCTAGTGGAGGTCAACAATGAATG-3，；
[0233]下游引物序列r2:5’ -TTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCC
[0234]AGTCACTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3’ ；
[0235]电泳验证上述PCR产物是否正确。
[0236](2)使用Xba I和Hind III双酶切ρΚΟΙΒ载体，取上述I种PCR产物4 μ L和I μ L酶切过的ρΚΟΙΒ载体(100ng/l μ L)加入到50 μ L酿酒酵母FY834菌株的感受态细胞中，按照Invitrogen公司的试剂盒(S.c.EasyComp Transformation Kit)的步骤进行操作。转化酵母细胞涂在SC-URA筛选平板上，30°C培养3天；用无菌水洗取SC-URA筛选平板上的酵母细胞，使用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取卡那霉素LB平板上长出的菌落进行培养，提取质粒，通过PCR (I对引物同上)和测序鉴定。将获得的验证正确的GFP表达载体命名为ρΚΟΙΒ-ΗΡΗ。
[0237]2ATMT法转化ρΚΟΙΒ-ΗΡΗ到稻瘟病菌
[0238]将载体ρΚΟΙΒ-ΗΡΗ通过冻融法转化到农杆菌菌株AGLl，然后经ATMT法转化稻瘟病菌萌发孢子中:
[0239](I) - (4)的具体步骤同实施例9的(I) 一(4)。
[0240](5)将硝酸纤维素膜转移到含真菌抗生素(潮酶素)与细菌抗生素的选择平板(CM)上，选择性培养基中含200 μ g/mL潮酶素、400mg/mL头孢霉素、60mg/mL链霉素，将平皿置于28°C下培养到转化子出现。将转化子接种到含200 μ g/mL磺胺嘧啶DCM平板上再次鉴定。
[0241]3转基因突变体的蛋白表达鉴定[0242]挑取具有潮酶素抗性的转化子在荧光显微镜下检测，如果转化子发绿色荧光，则说明GFP基因已经在稻瘟病菌内表达。获得的GFP表达突变体还可以继续通过RT-PCR和Western blot等方法在mRNA`或蛋白质水平上进一步验证。
【权利要求】
1.一种大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体，其特征在于，它为含有酵母DNA复制子和酵母筛选标记基因的双元载体。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述双元载体为 pCAMBIA 系列载体、pBHtl、pSN1301 或 pUN1301。
3.如权利要求2所述的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述双元载体为 pCAMBIA1300。
4.如权利要求1所述的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述酵母DNA 复制子为 2micro2_origin、25 μ m、ARS1、ARS3002 或 ARS3003。
5.如权利要求1所述的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述酵母筛选标记基因为 URA3、HI S3、LEU2、LYS2、TRP1、MET 15、ADE2 或 ADEI。
6.如权利要求1所述的大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体，其特征在于，包含H3启动子和荧光蛋白基因。
7.含有如权利要求1~6任一所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体的重组菌株。
8.如权利要求1~6任一所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体在向真菌或植物细胞转化DNA中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包括: (1)将目的基因与所述大肠杆菌-酵母-农杆菌穿梭表达载体一起转化酵母细胞，经酵母同源重组获得重组表达载体 ； (2)通过农杆菌介导转化法将所述重组表达载体转入真菌或植物细胞中，并在选择性培养基上挑取转化子。
【文档编号】C12N1/21GK103497969SQ201310418433
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】卢建平, 曹惠娟, 张莉林, 林福呈 申请人:浙江大学