结瘤因子水解酶、其编码基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种结瘤因子水解酶、其编码基因及应用。所述结瘤因子水解酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，利用大肠杆菌表达体系重组表达得到的重组结瘤因子水解酶MtChit5能够高效地将结瘤因子水解为脂质几丁质二糖NodSm-II(C16:2)和带硫酸基团的几丁质寡聚糖，它们是新型的研究植物与微生物互作的重要化合物，这对于豆科植物与根瘤菌互作过程中的机制研究具有重要的意义。
【专利说明】结瘤因子水解酶、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种结瘤因子水解酶、其编码基因及应用。
【背景技术】
[0002]氮是植物生长和发育必不可少的营养兀素,农作物的产量在一定程度上依赖于植物可利用氮(NH4+及N03-)的获取量。最近半个世纪以来，化学合成氮肥被广泛应用于农业增产。但是过量使用氮肥不仅需要消耗大量的化学能源，引起土壤酸化和水体富营养化，也会导致相当量的氮流失以及由细菌反硝化作用引起的N2O增加，从而导致温室效应及臭氧层破坏，进而严重破坏生态平衡。不利于我国的国民经济可持续发展。
[0003]相对于化学合成固氮，生物固氮是一种高效且环境友好型的固氮方式。根瘤菌是一种典型的生物固氮菌，它能够与豆科宿主植物共生并形成根瘤，将N2固定并转化为植物可利用的氮素。此生物固氮体系能极大程度地提高氮的利用效率，增加粮食作物的产量，减少能源的消耗和减少对环境的污染，是一种可持续的发展方式。
[0004]根瘤菌与豆科植物共生互作的过程中，植物根部会形成“根瘤”这种复杂和独特的器官。根瘤菌在根瘤里利用固氮酶将N2转化为植物可利用的NH4+。同时，植物会为根瘤菌提供由光合作用产生的碳水化合物，两者互利共生。然而这种固氮机制具有宿主特异性，根瘤菌的入侵以及植物根瘤的形成涉及到两者之间复杂而微妙的应答机制，由许多因子共同决定。由根瘤菌分泌的结瘤因子(Nod factors)是最重要的共生决定因子，它是一种脂质几丁质寡聚糖，其结构会因根瘤菌的菌株差异而有所不同。例如，中华苜蓿根瘤菌产生的结瘤因子通常由一条含二个不饱和键的十六碳脂肪酸链连在一个四糖或五糖的碳骨架上，此外还会有一个硫酸基团结合在糖骨架的还原性末端，部分类型的结瘤因子还会有一个乙酰基团结合在糖骨架的非还原性末端。
[0005]来自糖基水解酶家族18的类V型几丁质酶——结瘤因子水解酶(MtChit5)不具备任何几丁质酶特征但却能够高效地水解中华苜蓿根瘤菌分泌的结瘤因子，表明该水解酶在结瘤共生中具有重要作用。因此，研究生物固氮相关基因及其所编码水解酶对建立农业的可持续发展具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的在于提供一种新的结瘤因子水解酶。
[0007]本发明的另一个目的在于提供编码上述结瘤因子水解酶的基因。
[0008]本发明的另一个目的在于提供含有上述结瘤因子水解酶编码基因的克隆载体和表达载体。
[0009]本发明的另一个目的在于提供一种生产上述结瘤因子水解酶重组蛋白的方法。
[0010]本发明的另一个目的在于提供上述结瘤因子水解酶及其编码蛋白的应用。
[0011]本发明所采取的技术方案是:一种结瘤因子水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后仍具有结瘤因子水解酶活性的衍生蛋白。
[0012]编码上述结瘤因子水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 [0013]一种克隆载体，其含有编码上述结瘤因子水解酶的基因。
[0014]一种表达载体，其含有编码上述结瘤因子水解酶的基因。
[0015]一种生产结瘤因子水解酶的方法，包括将含有编码结瘤因子水解酶基因的表达载体导入宿主细胞中，表达得到结瘤因子水解酶。
[0016]所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0017]以上所述的结瘤因子水解酶在水解结瘤因子上的应用。
[0018]以上所述的结瘤因子水解酶在研究豆科植物与根瘤菌互作机制或在研究豆科转基因植物上的应用。
[0019]以上所述的编码结瘤因子水解酶的基因在研究豆科植物与根瘤菌互作机制上的应用。
[0020]本发明的有益效果是:本发明发现了一种新的苜蓿结瘤因子水解酶(MtChit5)及其编码基因，重组表达得到的结瘤因子水解酶能够高效地将结瘤因子水解为脂质几丁质二糖和带硫酸基团的几丁质寡聚糖，这为进一步研究豆科植物与根瘤菌互作过程中的机制提供了新的理论与实践基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为截形苜蓿故基因的PCR扩增产物的电泳图(I为MtChit5，2% DNA分子量标准品)；
图2为重组结瘤因子水解酶MtChit5的SDS-PAGE检测图(I为标准蛋白样品，2为未引入MtChit5基因的空载体对照，3为蛋白粗提取物，4为纯化后的重组蛋白MtChit5，分子量为 39 kDa)；
图3为重组结瘤因子水解酶MtChit5的Western blot检测图(I为未加入IPTG诱导的大肠杆菌蛋白对照，2为加入诱导剂IPTG后大肠杆菌蛋白，3为未插入目的基因并经过IPTG诱导后的大肠杆菌蛋白对照，4为纯化后的MtChit5蛋白)；
图4为高效液相色谱检测重组蛋白MtChit5水解结瘤因子产物结果图，其中结瘤因子NodSm-V (C16:2，S)和NodSm-1V (C16: 2，S)均可以被重组蛋白MtChit5水解为脂质几丁质二糖NodSm-1I (C16:2)和带有硫酸基团的几丁质二糖或者三糖；
图5为野生型截形苜蓿与过表达故的转基因截形苜蓿将NodSm-1V (C16:2，S)水解为脂质几丁质二糖NodSm-1I (C16:2)的结果图，其中WT-1~WT5为野生型截形苜蓿，1-1~2-7为过表达价泛/故的转基因植物；
图6为野生型截形苜蓿与RNAi W^MtChit5的转基因截形苜蓿将NodSm-1V(C16:2，
S)水解为脂质几丁质二糖NodSm-1I (C16:2)的结果图，其中WT_1、WT-2为野生型截形苜蓿，Linel-Line5为RNAi沉默的转基因株系。
【具体实施方式】[0022]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0023]下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京:科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
[0024]1、植物总DNA的提取
称取0.3 g截形苜猜(Medicago truncatula)叶片于碾钵中,加入液氮后用件碾磨至粉末状。将粉末转移至2 ml塑料管内并加入I ml预热的CTAB缓冲液(50 mM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0，0.6 M氯化钠，10 mM乙二胺四乙酸，1%十六烷基三甲基溴化铵，
0.1% β-巯基乙醇)，置于65°C水浴中30 min，期间每10 min轻柔地颠倒混匀几次。然后再加入0.8 ml氯仿/异戊醇(体积比24:1)并混匀，10000 g室温离心10 min后吸取上清液并转移至新的塑料管内，加入等体积的异戊醇后将管子轻柔地颠倒几次混匀直至出现白色絮状沉淀。用灭菌的牙签将沉淀挑出并置于含70%乙醇的溶液内洗两次，最后将沉淀出的DNA溶于双蒸水并用分光光度计(Amersham)测量其浓度。
[0025]2、基因片段的克隆
设计引物MtChit5-F和MtChit5-R，并在引物两端引入MfcI和通ol酶切位点(划线部分)，以方便其插入pET-28b载体。引物序列如下:
MtChit5~F:5，_CAAAAGTC`ATATGAGCACAACATCACCATCATCAAC_3，(SEQ ID NO:3); MtChit5~R:5’ -GCCTCGAGTTAAGAAAGTGTGTTAATTTTACC-3’ (SEQ ID N0:4)。
`[0026]以截形苜蓿基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增反应，反应体系如表I所示:
【权利要求】
1.一种结瘤因子水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后仍具有结瘤因子水解酶活性的衍生蛋白。
2.编码权利要求1所述结瘤因子水解酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
4.一种克隆载体，含有权利要求2或3所述的基因。
5.—种表达载体,含有权利要求2或3所述的基因。
6.—种生产结瘤因子水解酶的方法，包括将权利要求5所述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到结瘤因子水解酶。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.权利要求1所述的结瘤因子水解酶在水解结瘤因子上的应用。
9.权利要求1所述的结瘤因子水解酶在研究豆科植物与根瘤菌互作机制或在研究豆科转基因植物上的应用。
10.权利要求2或3所述`的基因在研究豆科植物与根瘤菌互作机制上的应用。
【文档编号】C12Q1/34GK103484442SQ201310435678
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】史德海林奥斯丁巴特瑟, 谢致平, 刘伟, 田野 申请人:中山大学