一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法
【专利摘要】一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，包括以下步骤：(1)从红斑狼疮患者的非发病期采集100ml外周静脉血；(2)血液中分离得到单个核细胞：对抗凝处理后的血液进行离心，离心后，得到上层血浆层和下层血细胞层吸掉上层血浆；(3)用混合酶消化液除去残留抗原，净化单个核细胞。本发明设计蛋白酶和DNA酶混合消化步骤，去除残余红斑狼疮有毒物质。
【专利说明】一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学领域，具体为一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法。
【背景技术】
[0002]红斑狼疮为全身性、慢性进行性反复发作和缓解的典型自身免疫性结缔组织病之一。女性发病多，可侵犯全身多脏器，免疫学技术的发展使早期轻型和不典型的病例能及时诊治，因此除少数重症或重要器官受损者外，有些病例可自行缓解，有些只呈一次性发作，经数月或短暂病程后，症状完全消失。治疗上由于合理应用皮质类固醇激素、免疫调节剂、血浆交换疗法、中西医结合等，红斑狼疮患者的十年存活率已达85%。近年有人认为本病为病谱性疾病，其两极为局限性盘状红斑狼疮和系统性红斑狼疮，中间为亚急性皮肤型红斑狼疮和深部红斑狼疮，二者均可向两端演变。
[0003]红斑狼疮的特征是自身抗原驱动和T细胞依赖性，疾病活动期往往有自身抗体滴度升高；这些自身抗体的靶抗原位于细胞(细胞核、细胞膜、细胞浆)的不同位壁，包括核蛋白粒子DNA和其他RNA，后者又包括小核糖核蛋白SnRNAs、胞浆RNA(SSA / Ro)、核糖体，以及带负电荷的磷脂。促进红斑狼疮发病和加重的因素如感染、妊娠、日晒、药物等与自身抗体滴度升高密切相关。
[0004]细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞,经过体外培养,使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功，由于身体内外原因形成的自身抗原，是红斑狼疮致病的外在根源，对红斑狼疮患者的治疗和研究过程，需要研究分析自身抗原的起因和本质，需要具有对自身抗原的处理能力。同时，基于细胞免疫治疗技术在红斑狼疮治疗中的应用，获取有用的无自身抗原污染的正常细胞，如外周血单核细胞等，将会对红斑狼疮治疗产生重要作用。现有分离外周血单个核细胞的方法主要采用密度梯度离心法，该技术仅用于常规血液单个核细胞的分离，为了从红斑狼疮患者的血液中分离出有效的无抗原、抗体物质的单个核细胞，需要对该产物进行消化处理。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题在于提供一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:
[0007]—种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，包括以下步骤:
[0008](1)从红斑狼疮患者的非发病期采集100ml外周静脉血
[0009]针对红斑狼疮患者，在患者病情稳定期无症状时，使用医疗采血技术采取100ml血液到采血袋中，如果是初次患者，可以立即采血或者在症状稳定后，使用医疗采血技术采取100ml血液到采血袋中，采血后的采血袋放入4°C环境中运输，2h内使用；
[0010](2)血液中分离得到单个核细胞
[0011]I)取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中；
[0012]2)对抗凝处理后的血液进行离心，离心后，得到上层血浆层和下层血细胞层吸掉上层血浆；
[0013]3)向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，用移液器混匀； [0014]4)再取4支含有淋巴细胞分离液的离心管，缓慢的将血细胞混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；
[0015]5)进行离心分层；
[0016]6)离心后将中间白膜层吸入到新的离心管中；
[0017]7)用注射用生理盐水补液后，再次进行离心，清洗单核细胞；
[0018]8)重新加入注射用生理盐水，混匀后离心清洗单核细胞；
[0019](3)用混合酶消化液除去残留抗原，净化单个核细胞
[0020]I)准备胰酶和胶原酶III的混合消化液，加入到步骤(2)中剩下的离心管中，吹匀，消化一段时间后，加入注射用生理盐水，混匀后，进行离心；
[0021]2)准备DNA酶液，消化上一步剩下的细胞，再加入注射用生理盐水，进行离心清洗细胞；
[0022]3)最后得到的即无自身抗原的单个核细胞，用无血清培养液培养。
[0023]所述外周静脉血必须按照医院进行医疗级别抗凝血处理。
[0024]所述单个核细胞是一类具有近似密度的细胞群，是血细胞层通过密度梯度分离法分离到的白膜层细胞，密度梯度分离法所用的分离液密度是1.077g / ml ο
[0025]所述注射用生理盐水属于医疗试剂，实验室可以使用磷酸盐缓冲液(PBS)代替。
[0026]所述混合酶消化液有两种，第一种为胰酶和胶原酶III的混合液，第二种为DNA酶，混合消化液中酶的作用是消化液体中细胞外的游离蛋白和DNA存在，包括可能致病的抗原和抗体，如自身抗原。
[0027]有益效果
[0028]本发明利用多酶消化法去除残余红斑狼疮有毒物质:这里的消化液分两步:第一步是蛋白消化步骤，主要消化酶类为:胰酶和胶原蛋白酶III，属于常规的蛋白消化液，对组织细胞影响较小；第二步消化步骤为DNA消化酶,使用的是DNAase。
【具体实施方式】
[0029]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030]实施例1
[0031]一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，包括以下步骤:[0032](I)从红斑狼疮患者的非发病期采集100ml外周静脉血
[0033]针对红斑狼疮患者，在患者病情稳定期无症状时，使用医疗采血技术采取100ml血液到采血袋中，如果是初次患者，可以立即采血或者在症状稳定后，使用医疗采血技术采取100ml血液到采血袋中，采血后的采血袋放入4°C环境中运输，2h内使用；
[0034](2)血液中分离得到单个核细胞
[0035]I)取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中；
[0036]2) 300g尚心IOmin,尚心后，得到上层血衆层和下层血细胞层吸掉上层血衆；
[0037]3)向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合液，用移液器混匀；
[0038]4)再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；
[0039]5) 400g 离心 2O 分钟；
[0040]6)离心后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中；
[0041]7)用注射用生理 盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，清洗单核细胞；
[0042]8)重新加入注射用生理盐水45ml，混匀后离心清洗单核细胞；
[0043](3)用混合酶消化液除去残留抗原，净化单个核细胞
[0044]I)准备37°C温浴的0.25%胰酶和0.1 %胶原酶III的混合消化液1ml，加入到上一步剩下的50ml离心管中，吹匀，消化I分钟后，加入45ml注射用生理盐水，混匀后，200g，离心5分钟；
[0045]2)准备Iml于37°C温浴的4%的DNA酶液，消化上一步剩下的细胞10分钟。再加入45ml注射用生理盐水，200g，5分钟离心清洗细胞；
[0046]3)最后得到的即无自身抗原的PBMC细胞，用无血清培养液培养。
[0047]所述外周静脉血必须按照医院进行医疗级别抗凝血处理。
[0048]所述单个核细胞是一类具有近似密度的细胞群，是血细胞层通过密度梯度分离法分离到的白膜层细胞，密度梯度分离法所用的分离液密度是1.077g / ml ο
[0049]所述注射用生理盐水属于医疗试剂，实验室可以使用磷酸盐缓冲液(PBS)代替。
[0050]所述混合酶消化液有两种，第一种为胰酶和胶原酶III的混合液，第二种为DNA酶，混合消化液中酶的作用是消化液体中细胞外的游离蛋白和DNA存在，包括可能致病的抗原和抗体，如自身抗原。
[0051]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0052]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1.一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，其特征是，包括以下步骤: (1)从红斑狼疮患者的非发病期采集100ml外周静脉血 针对红斑狼疮患者，在患者病情稳定期无症状时，使用医疗采血技术采取100ml血液到采血袋中，如果是初次患者，可以立即采血或者在症状稳定后，使用医疗采血技术采取100ml血液到采血袋中，采血后的采血袋放入4°C环境中运输，2h内使用； (2)血液中分离得到单个核细胞 1)取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中； 2)对抗凝处理后的血液进行离心，离心后，得到上层血浆层和下层血细胞层吸掉上层血浆； 3)向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，用移液器混匀； 4)再取4支含有淋巴细胞分离液的离心管，缓慢的将血细胞混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层； 5)进行离心； 6)离心后将中间白膜层吸入到新的离心管中； 7)用注射用生理盐水补液后，再次进行离心，清洗单核细胞； 8)重新加入注射用生理盐水，混匀后离心清洗单核细胞； (3)用混合酶消化液除去残留抗原，净化单个核细胞 1)准备胰酶和胶原酶III的混合消化液，加入到上一步中剩下的离心管中，吹匀，消化一段时间后，加入注射用生理盐水，混匀后，进行离心； 2)准备DNA酶液，消化上一步剩下的细胞，再加入注射用生理盐水，进行离心清洗细胞； 3)最后得到的即无自身抗原的单个核细胞，用无血清培养液培养。
2.根据权利要求1所述的一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，其特征是，所述外周静脉血必须按照医院进行医疗级别抗凝血处理。
3.根据权利要求1所述的一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，其特征是，所述单个核细胞是一类具有近似密度的细胞群，是血细胞层通过密度梯度分离法分离到的白膜层细胞，密度梯度分离法所用的分离液密度是1.077g / ml ο
4.根据权利要求1所述的一种从红斑狼疮病人外周血在中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，其特征是，所述注射用生理盐水属于医疗试剂，实验室使用磷酸盐缓冲液代替。
5.根据权利要求1或4所述的一种从红斑狼疮病人外周血中分离无自身抗原的单个核细胞的方法，其特征是，所述混合酶消化液有两种，第一种为胰酶和胶原酶III的混合液，第二种为DNA酶。混合消化液中酶的作用是消化液体中细胞外的游离蛋白和DNA存在，包括可能致病的抗原和抗体。
6.根据权利要求5中所述的DNA酶可以是任何降解DNA，使其完全失去链状结构，且同时对细胞没有影响的蛋白酶类，可以是一种或者多种酶的组合。
【文档编号】C12N5/078GK103725647SQ201310500133
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年10月13日 优先权日:2013年10月13日
【发明者】易银沙, 张万明, 朱海强, 邹义洲, 许澎, 李娜, 刘彩云, 袁炳秋, 吴小宁 申请人:长沙赢润生物技术有限公司