一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法
【专利摘要】本发明涉及一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法。该方法包括如下步骤：（1）取草垛下的土壤样品中筛选出纤维素酶的嗜热菌株；（2）将嗜热菌株接种至基本培养基中，培养24小时作为种子液，接种10%的种子液至发酵培养基中，摇床振荡培养4天,浓缩后得到酶制剂；（3）将汽爆玉米秸秆置于温度为60±1.0℃的热水中浸提；（4）将步骤（2）所得的酶制剂添加至步骤(3)所得的玉米秸秆浸提液中，在60±1.0℃的条件下预酶解2小时；（5）将步骤（4）得到的酶解液降温至35±1.0℃，之后接种7%的酿酒酵母，在35±1.0℃条件下同温同步酶解发酵得到燃料乙醇。该方法能有效提高纤维燃料乙醇的得率。
【专利说明】一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种利用发酵或使用酶的方法合成目标化合物的工艺，特别涉及一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法。
【背景技术】
[0002]以植物纤维发酵生产燃料乙醇，是目前国内外关注的一个热点。近年来很有很多学者报道了高产纤维素酶的菌株，包括:霉菌、细菌和真菌。其中真菌来源的纤维素酶是目前开发得最早的酶资源。目前国内外以纤维素类生物质原料制备乙醇的研究已经取得了许多进展，但是纤维燃料乙醇的生产成本过高仍然是其大规模生产和推广应用的瓶颈。其主要的原因有:单一技术无法实现纤维素、半纤维素和木质素三组分的同时利用；酶解过程中纤维素酶用量大，乙醇生产的成本高。
[0003]目前，我国全国每年产生的农作物秸杆等农业残渣6-7亿吨，除用作饲料、肥料、燃料等外，尚余3-4亿吨作为废弃物，若用于生产乙醇，按计算可生产5000万吨生物乙醇。但不可否认，随着技术水平的不断提高，以木质纤维素为原料的生物乙醇无疑将为社会带来巨大的经济效益。玉米秸杆的主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，直接利用于纤维素酶水解，其酶解率低，利用蒸汽爆破技术很好的解决了这一问题，但是酶解成本过高的问题仍然有待解决。目前纤维素发酵生产乙醇的方法有直接发酵法、间接发酵法、同步糖化发酵法(SSF)、非等温同步糖化发酵法(NSSF)、固定化细胞发酵法等。目前最常用的方法为SSF和NSSF法，但是这两种方法也存在一些缺点，如SSF法中糖化温度和发酵温度不协调，一定浓度的乙醇对酶有抑制作用。NSSF法需要在发酵设备外增加一个水解塔，不含酵母细胞的流体在水解塔和发酵罐之间循环，增加了流程的复杂化。但是无论是哪一种酶解方式，寻找高效的纤维素酶降低酶解成本是燃料乙醇工业化生产的关键。
【发明内容】
`[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，该方法能有效提高纤维燃料乙醇的得率。
[0005]本发明解决所述技术问题的方案是:一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于:包括如下步骤，
[0006](I)取草垛下的土壤样品，稀释后涂布平板培养基，温度为60±1.(TC条件下培养5-7天，挑选平板上出现水解透明圈的耐热菌株单菌落，将单菌落转接至斜面培养基，60 ± 1.(TC条件下培养5-7天后接种含滤纸纤维的液体培养基，170r/min、60±l.(TC条件下振荡培养6-8天，测定滤纸酶解率，筛选出滤纸酶解率高的菌株；筛选得到的菌株经在平板培养基上活化培养后，接种至基本培养基中，60°C ±1.(TC条件下，170r/min条件下振荡培养6-8天后测定纤维素酶产量，筛选出纤维素酶的嗜热菌株；
[0007](2)将步骤(1)所得的嗜热菌株接种至基本培养基中，60°C ±1.0°C条件下，170r/min条件下振荡培养24小时作为种子液，接种10%的种子液至发酵培养基中，170r/min、60 ± 1.(TC摇床振荡培养4天，浓缩后得到酶制剂；
[0008](3)将汽爆玉米秸杆置于温度为60±1.(TC的热水中，在该温度条件下保温I小时浸提；
[0009](4)将步骤(2)所得的酶制剂添加至步骤(3)所得的玉米秸杆浸提液中，在60±1.(TC的条件下预酶解2小时；
[0010](5)将步骤(4)得到的酶解液降温至35±1.(TC，之后接种7%的酿酒酵母，在35±1.(TC条件下同温同步酶解发酵得到燃料乙醇。
[0011]作为进一步的技术方案，所述步骤(1)和步骤(2)中基本培养基的成分为:CMC-Na2% ;蛋白胨 0.5% ；K2HP040.2% ；MgS04.7H200.05%，其余为水。
[0012]作为进一步的技术方案，所述步骤(2)中的发酵培养基的成分为:CMC_Na2%，K2HPO40.2%, MgSO4.7H2O0.05%，蛋白胨 0.1%，CaCl20.002%, FeSO40.0004%, MnSO40.002%，其余为水；发酵培养基的pH为7.0。
[0013]作为再进一步的技术方案，所述步骤(2)中的酶制剂通过如下方法浓缩得到:
[0014]a)常温条件下，8000r/min离心发酵产物，收集上清液为粗酶液；
[0015]b)利用饱和硫酸铵沉淀法对粗酶液进行浓缩，并采用浓度为10毫摩尔/升，pH7.0的磷酸缓冲液透析12小时，得到浓缩的粗酶液；`
[0016]c)粗酶液进行不同孔径的凝胶层析以获得内切葡聚糖酶、纤维二糖酶和葡萄糖苷酶蛋白，获得酶液；
[0017]d)利用离子交换层析对酶液进一步纯化，获得纯的酶制剂。
[0018]作为再进一步的技术方案，所述步骤(4)中酶制剂的添加量为30U/g纤维素。
[0019]作为再进一步的技术方案，所述步骤(4)中添加10%的表面活性剂。
[0020]作为更进一步的技术方案，所述表面活性剂由吐温80与聚乙二醇10000以2:3的体积比混合而成。
[0021]本发明克服了目前利用玉米秸杆等纤维素发酵生产燃料乙醇工艺中纤维素酶制剂用量大、生产成本高的问题，能有效降低纤维素酶制剂的使用量，提高燃料乙醇的得率。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
[0023]一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，包括如下步骤，
[0024](I)取草垛下的土壤样品，稀释后涂布平板培养基，温度为60±1.(TC条件下培养5-7天，挑选平板上出现水解透明圈的耐热菌株单菌落，将单菌落转接至斜面培养基，60 ± 1.(TC条件下培养5-7天后接种含滤纸纤维的液体培养基，170r/min、60±l.(TC条件下振荡培养6-8天，测定滤纸酶解率，筛选出滤纸酶解率高的菌株，所谓滤纸酶解率高是指测试几个样品后选出其中滤纸酶解率相对较高的菌株；筛选得到的菌株经在平板培养基上活化培养后，接种至基本培养基中，60°C ±1.0°C条件下，170r/min条件下振荡培养6-8天后测定纤维素酶产量，筛选出纤维素酶的嗜热菌株，测定后纤维素酶产量相对较高的即是需要的纤维素酶的嗜热菌株；
[0025](2)将步骤(1)所得的嗜热菌株接种至基本培养基中，60°C ±1.0°C条件下，170r/min条件下振荡培养24小时作为种子液，接种10%的种子液至发酵培养基中，170r/min、60 ± 1.(TC摇床振荡培养4天，浓缩后得到酶制剂；
[0026](3)将汽爆玉米秸杆置于温度为60±1.(TC的热水中，在该温度条件下保温I小时浸提；
[0027](4)将步骤(2)所得的酶制剂添加至步骤(3)所得的玉米秸杆浸提液中，酶制剂的添加量为30U/g纤维素，再添加10%的表面活性剂后在60±1.(TC的条件下预酶解2小时，表面活性剂由吐温80与聚乙二醇10000以2:3的体积比混合而成，当然也可以使用其他的表面活性剂，只要能起到类似的作用即可；
[0028](5)将步骤(4)得到的酶解液降温至35±1.(TC，之后接种7%的酿酒酵母，在35±1.(TC条件下同温同步酶解发酵得到燃料乙醇。
[0029]所述步骤(1)和步骤(2)中基本培养基的成分为:CMC_Na2%;蛋白胨0.5%;K2HP040.2% ；MgS04.7H200.05%，其余为水。
[0030]所述步骤(2)中的发酵培养基的成分为:CMC-Na2%，K2HPO40.2%, MgSO4.7H200.05%,蛋白胨 0.1%, CaCl20.002%,FeSO40.0004%,MnSO40.002%，其余为水；发酵培养基的 pH 为 7.0。
[0031]所述步骤(2)中的酶制剂通过如下方法浓缩得到:
[0032]a)常温条件下，8000r/min离心发酵产物，收集上清液为粗酶液；
[0033]b)利用饱和硫酸铵沉淀法对粗酶液进行浓缩，并采用浓度为10毫摩尔/升，pH7.0的磷酸缓冲液透析12小时，得到浓缩的粗酶液；
[0034]c)粗酶液进行不同孔径的凝胶层析以获得内切葡聚糖酶、纤维二糖酶和葡萄糖苷酶蛋白，获得酶液；
[0035]d)利用离子交换层析对酶液进一步纯化，获得纯的酶制剂。
[0036]与市场上常见的纤维素酶制剂相比，在达到相同酶解效果条件下，酶制剂的用量减少了 20%以上。 与原来的预酶解和同步酶解发酵工艺相比，用本发明所述的方法，乙醇的
产量能提高40%左右。
【权利要求】
1.一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于:包括如下步骤， (O取草垛下的土壤样品，稀释后涂布平板培养基，温度为60±1.(TC条件下培养5-7天，挑选平板上出现水解透明圈的耐热菌株单菌落，将单菌落转接至斜面培养基，60 ± 1.(TC条件下培养5-7天后接种含滤纸纤维的液体培养基，170r/min、60±l.(TC条件下振荡培养6-8天，测定滤纸酶解率，筛选出滤纸酶解率高的菌株；筛选得到的菌株经在平板培养基上活化培养后，接种至基本培养基中，60°C ±1.(TC条件下，170r/min条件下振荡培养6-8天后测定纤维素酶产量，筛选出纤维素酶的嗜热菌株； (2)将步骤(1)所得的嗜热菌株接种至基本培养基中，60°C±1.0°C条件下，170r/min条件下振荡培养24小时作为种子液，接种10%的种子液至发酵培养基中，170r/min、60 ± 1.(TC摇床振荡培养4天，浓缩后得到酶制剂； (3)将汽爆玉米秸杆置于温度为60±1.(TC的热水中，在该温度条件下保温I小时浸提; (4)将步骤(2)所得的酶制剂添加至步骤(3)所得的玉米秸杆浸提液中，在60±1.(TC的条件下预酶解2小时； (5)将步骤(4)得到的酶解液降温至35±1.(TC，之后接种7%的酿酒酵母，在35± 1.(TC条件下同温同步酶解发酵得到燃料乙醇。
2.如权利要求1所述的一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(1)和步骤(2 )中基本培养基的成分为:CMC-Na2% ;蛋白胨0.5% ；K2HP040.2% ；MgS04.7H200.05%，其余为水。
3.如权利要求1或2所述的一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的发酵培养基的成分为:CMC-Na2%，K2HPO40.2%，MgSO4.7H200.05%，蛋白胨0.1%，CaCl20.002%, FeSO40.0004%, MnSO40.002%，其余为水;发酵培养基的 pH 为 7.0。
4.如权利要求1所述的一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的酶制剂通过如下方法浓缩得到: a)常温条件下，8000r/min离心发酵产物，收集上清液为粗酶液； b)利用饱和硫酸铵沉淀法对粗酶液进行浓缩，并采用浓度为10毫摩尔/升，pH7.0的磷酸缓冲液透析12小时，得到浓缩的粗酶液； c)粗酶液进行不同孔径的凝胶层析以获得内切葡聚糖酶、纤维二糖酶和葡萄糖苷酶蛋白，获得酶液； d)利用离子交换层析对酶液进一步纯化，获得纯的酶制剂。
5.如权利要求1所述的一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(4)中酶制剂的添加量为30U/g纤维素。
6.如权利要求1所述的一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(4)中添加10%的表面活性剂。
7.如权利要求6所述的一种同步糖化发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于:所述表面活性剂由吐温80与聚乙二醇10000以2:3的体积比混合而成。
【文档编号】C12P7/10GK103614418SQ201310618899
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】屠纪民, 周国庆, 钱坤, 于岚, 孙来玉, 葛海霞, 倪生良, 文良柱 申请人:屠纪民