一种人表皮生长因子的制备和纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，包括构建重组质粒pBSAZ1.1myc-His6、构建重组质粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF、重组质粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞和hEGF蛋白的分泌和纯化的步骤。本发明采用现代生物技术，构建了微生物表达载体重组质粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的CHO细胞，构建稳定的高分泌型工程菌，实现人表皮生长因子的生产。表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的生物蛋白质分子，经过Balb/c3t3细胞的活性测定实验显示与标准品相比具有较高生物学活性，可达到1×105U/mg。
【专利说明】一种人表皮生长因子的制备和纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，特别涉及一种人表皮生长因子的制备和纯化方法。。
【背景技术】
[0002]人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor,简称hEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽，分子量为6216道尔顿。hEGF是一种多功能细胞生长因子，通过与细胞膜上hEGF受体结合发挥生理作用。研究表明:表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的细胞膜上都含有hEGF受体，其中表皮细胞含量最高。hEGF接近细胞后与细胞膜上的hEGEF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应，使得RNA、DNA和蛋白质合成增加，最终促进细胞生长繁殖，加速细胞新陈代谢。
[0003]人的尿液、血液、乳汁及胃液等含有的内源性hEGF很少，并且为与受体结合的生理状态，从生物来源中提取hEGF比较困难，仅仅限于理论研究。目前生产hEGF主要有2种途径:一种是化学合成法，虽然产物纯度高但是产率不高，而且蛋白质不能像生物合成一样折叠，无法工业化生产。另一种方法是采用基因工程技术构建重组质粒表达hEGF。基因重组hEGF的基本策略是首先从制备hEGF目的基因，然后将目的基因连接至表达载体上，从而构建出含hEGF目的基因的重组质粒，最后将质粒转化至基因工程菌中表达，分离纯化得到hEGF目的蛋白。目前表达载体主要有大肠杆菌和酵母菌，hEGF在这两种表达载体中的表达量小，发酵液中的产物浓度低，提取和纯化工艺复杂，而且所获得的hEGF活性不高。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供提供一种高效、稳定的表达hEGF工程菌的构建、筛选，以及分离纯化目的蛋白hEGF的方法，解决重组人表皮生长因子在哺乳动物细胞中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)中分泌表达的问题。
[0005]一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤:
(a)构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6:
提取质粒pcDNA3.l(+)/myc-His A，经限制性内切酶汝./ II和I双酶切处理，得到3392bp的片段；
提取质粒pSecTag2 A，经限制性内切酶汝./ II和泣? I双酶切处理，得到2186bp的片
段；
将3392bp片段与2186bp片段以体积比2:3的比例用连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶汝./ II和泣? I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6 ；
(b)构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF:
提取重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6，经限制性内切酶I和沿ο I酶切，得到5525bp的片段，酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理；
提取含hEGF基因片段的质粒pMD18-T-His6-SUM0-hEGF，经限制性内切酶汉挪H I和沿οI酶切得到486bp的hEGF基因片段；
将5525bp片段与486bp片段以体积比1:4的比例用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和沿ο I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF ；
(c)重组质粒pBSAZ1.1 myc-His6-SUM0-hEGF转染CHO细胞:在转染试剂存在下将重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF转染CHO细胞，筛选得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株；
(d)hEGF蛋白的分泌和纯化:将转染后稳定细胞株于培养基中培养，收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心取上清液；亲和层析，用清洗液除去杂蛋白后，加入洗脱液将hEGF洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白；将含有目的蛋白的样品缓慢加入N1-NTA柱，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用PBS缓冲液洗3个柱体积；最后加入SUMO特异性切割酶Ulpl室温反应10-30分钟或4°C下2-6小时；用PBS洗脱酶切下来的hEGF，收集流出液。
[0006]步骤c中所述的CHO细胞的培养方法为:100mm的培养皿中以3X IO6个细胞的浓度接种CHO细胞，培养基为含5%的小牛血清的DMEM/F12培养基，转染前一天加入7ml含血清，不含抗生素的培养基，37°C置于恒温培养箱，5%C02培养，至转染时要求80%-90%细胞汇
合
[0007]步骤c中的转染方法具体为:分别把4ug的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF质粒和12ul的转染试剂稀释到200ul无血清培养基中，室温放置五分钟再混合，将混合液在室温放置10 — 15分钟后滴入CHO细胞培养基中，培养4h后换液，继续筛选培养24-48小时得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株。
[0008]步骤d中所述的清洗液含有 20mmol/L咪唑,300mmol/L NaC, 150 mmol/L NaH2P04,pH值为8.0。
[0009]步骤d 中所述的洗脱液含有 250mmol/L 咪唑,300mmol/L NaCl, 150 mmol/LNaH2PO4, pH 值为 8.0。
[0010]步骤d中所述SUMO特异性切割酶Ulpl由以下方法制备得到:
(a)构建重组质粒pET-28a-Ulpl:提取含Ulpl基因片段的质粒pMD18-T_Ulpl，经限制性内切酶I和通ο I酶切得到Ulpl基因片段；与经同样双酶切的质粒pET-28a连接得到 pET-28a-Ulpl ；
(b)构建重组菌株BL21/pET-28a-Ulpl:将重组质粒pET-28a_Ulpl加入感受态细胞BL21，冰上放置30分钟，然后42°C水浴中热激90-120秒，冰上放置2_3分钟，涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，置37°C恒温培养箱过夜培养；
(c)Ulpl的诱导表达及纯化:挑取重组菌株BL21/pET-28a-Ulpl单克隆于含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡过夜培养，待0D_值0.6-0.8时加入IPTG至终浓度0.2mM,22°C诱导过夜；离心收菌，用破菌缓冲液重悬沉淀，加入PMSF，超声波破菌；细菌破碎液离心，取上清；上N1-NTA柱纯化，N1-NTA洗脱下来了的蛋白用FPLC进一步纯化。
[0011]本发明采用现代生物技术，构建了微生物表达载体重组质粒pBSAZ 1.1myc-His6-SUM0-hEGF,再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，构建稳定的高分泌型工程菌，实现人表皮生长因子的生产。哺乳动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的生物蛋白质分子。胞外分泌型表达是目前最先进的且适于工业化的表达方式，细胞外表达可以避免蛋白在保内聚集形成包涵体，使目的蛋白的下游纯化更加简单，利于大规模处理。
[0012]通过本发明的方法得到的hEGF，经过Balb/c 3t3细胞的活性测定实验显示与标准品相比具有较高生物学活性，可达到I X 105u/mg。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是重组质粒pET-28a-Ulpl构建不意图。
[0014]图2是重组质粒pET-28a_Ulpl经限制性内切酶I和沿ο I双酶切验证电泳图。
[0015]图3是重组质粒pBSAZ 1.1 myc_His6构建示意图。
[0016]图4是重组质粒pBSAZ 1.1 myc_His6经限制性内切酶奴7 II和汾? I双酶切验证电泳图。
[0017]图5 是重组质粒 pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF 构建示意图。
[0018]图6是重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF经限制性内切酶I和ZAoI双酶切验证电泳图。
[0019]图7是hEGF蛋白纯化SDS-PAGE蛋白电泳图。
【具体实施方式】
[0020]实施例1:重组质粒pET-28a_Ulpl的构建 一)试验材料
(I)质粒和菌株
质粒pET-28a和大肠杆菌JM109购自Takara生物科技有限公司。
[0021](2)试剂
限制性内切酶Ue 1和通0 I,卡纳青霉素购自NEB公司。去磷酸化酶购自Takara生物科技有限公司。
[0022](3)基因片段 Ulpl由华大基因合成。
[0023]二)实施方案
1.质粒pET-28a的酶切
大量提取重构质粒pET-28a，纯化后加入限制性内切酶I和ZAo I，置于37°C恒温培养箱l_4h做双酶切处理，将酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理，将去磷酸化产物纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0024]2.Ulpl基因片段的获得
大量提取含Ulpl基因片段的质粒pMD18-T-Ulpl，纯化后加入限制性内切酶I和Xho I，置于37°C恒温培养箱l_4h做双酶切处理，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收729bp片段，纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0025]3.重组质粒pET-28a_Ulpl的构建
重组质粒pET-28a-Ulpl构建示意图如图1所示。[0026]将步骤I和步骤2中4°C冰箱保存的基因片段按照以下配比加连接酶进行连接处理:线性化 pET-28a I μ L ；Ulpl 基因片段 4 μ L ;连接酶 0.5 μ L ；dd H2O 3.5 μ L ；BufferI μ Lo
[0027]将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过卡纳青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和ZA0 I双酶切鉴定，得到重组质粒pET-28a-Ulpl。重组质粒pET-28a_Ulpl经限制性内切酶I和通ο I双酶切验证电泳图如图2所示。
[0028]实施例2:重组菌株BL21/pET-28a_Ulpl的构建 一)试验材料
(I)菌株
大肠杆菌BL21(DE3)购自Takara生物科技有限公司。
[0029](2)试剂
卡纳青霉素购自NEB公司。
[0030]二)实施方案
1.质粒pET-28a-Ulpl的提取
大量提取重构质粒pET-28a-Ulpl，纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0031]2.转化BL21感受态细胞
感受态细胞BL21(DE3)从_70°C取出`，放在冰上1_5分钟使其融化，在超净台中取pET-28a-Ulpl质粒0.5-lul加入感受态细胞中，冰上放置15-30分钟，然后42°C水浴中热激90-120秒，冰上放置1-3分钟，涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，置37°C恒温培养箱过夜培养。
[0032]实施例3.=Ulpl的诱导表达及纯化
一)试验材料
(I)试剂
卡纳青霉素、IPTG购自NEB公司。
[0033]二)实施方案 1.Ulpl的诱导表达
挑取单克隆于IOml含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡过夜培养。将过夜培养物按1:100比例转接到新的IL含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养约2_3小时，待OD600值0.2-1.2时加入IPTG至终浓度0.2mM, 22°C诱导过夜。
[0034]2.Ulpl 的纯化
5000rpml5分钟离心收菌，弃上清倒置I分钟使残余培养基流尽。用破菌缓冲液(50mMNaH2P04,500mM NaCl，pH8.0)重悬沉淀，5000rpml0分钟离心收菌，弃上清。取50ml破菌缓冲液加入到沉淀中并吹打均匀，1:200加入苯甲基磺酰氟PMSF，超声波破菌5-15分钟，至半透明。细菌破碎液15000rpml5分钟离心，取上清。上N1-NTA柱纯化，样品缓慢滴下使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用梯度洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4, 500mM NaCl,250mM 咪唑，pH8.0)洗脱，15% SDS-PAGE 检测蛋白洗脱情况。N1-NTA洗脱下来了的蛋白用快速蛋白液相色谱FPLC进一步纯化。
[0035]实施例4:重组质粒pBSAZ 1.1 myc_His6的构建一)试验材料 (I)质粒和菌株
质粒pcDNA3.1/mys-His A由江苏大学医学生物化学系郑学明教授惠赠；质粒pSecTag2 A购自Invitrogen公司；大肠杆菌JM109购自Takara生物科技有限公司。
[0036]⑵引物
限制性内切酶汝./ II和I购自NEB公司；
二)实施方案
1.质粒 pcDNA3.1/mys-His 的酶切
将质粒pcDNA3.1 (+) /myc-His A电转化法转入大肠杆菌JM109感受态,接种阳性转化子37°C摇床过夜培养，大量提取质粒纯化，加限制性内切酶汝./ II和I置于37°C恒温培养箱进行双酶切处理，将处理产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收3392bp的片段，纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0037]2.质粒 pSecTag2 A 的酶切
将质粒pSecTag2 A电转化法转入大肠杆菌JM109感受态，接种阳性转化子37°C摇床过夜培养，大量提取质粒纯化，加限制性内切酶ife./ II和I置于37°C恒温培养箱进行双酶切处理，将处理产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收2186bp的片段，纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0038]3.重组质粒 pBSAZ 1.1 myc_His6 的构建
重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6构建示意图如图3所示。
[0039]将步骤I和步骤2中得到的片段按照以下配比加连接酶进行连接处理:3392bp的片段 2 μ L ；2186bp 的片段 3 μ L ;连接酶 0.5 μ L ；dd H2O 3.5 μ L ；Buffer I μ L。将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶汝./ II和泣? I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6。重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6经限制性内切酶汝./ II和I双酶切验证电泳图如图4所示。
[0040]实施例5:重组质粒 pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF 的构建
一)试验材料
(I)质粒和菌株
大肠杆菌JM109购自Takara生物科技有限公司。
[0041](2)试剂
限制性内切酶I和通ο I购自NEB公司。去磷酸化酶购自Takara生物科技有限公司。
[0042](3)基因片段 hEGF由华大基因合成。
[0043]二)实施方案
1.质粒 pBSAZ 1.1 myc_His6 的酶切
大量提取重构质粒pBSAZ 1.1 myc-His6，纯化后加入限制性内切酶SaMl I和ZAo I，置于37°C恒温培养箱l_4h做双酶切处理，得5525bp的片段。将酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理，将去磷酸化产物纯化后置4°C冰箱保存待用。[0044]2.hEGF基因片段的获得
大量提取含hEGF基因片段的质粒PMD18-T-His6-SUM0-hEGF，纯化后加入限制性内切酶脑H I和通ο I，置于37°C恒温培养箱l_4h做双酶切处理，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收486bp片段，纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0045]3.重组质粒 pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF 的构建
重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF构建示意图如图5所示。
[0046]I步骤和2步骤中所得的4°C冰箱保存的基因片段按照以下配比加连接酶进行连接处理:5525bp 的片段 I μ L ；486bp 的片段 4 μ L ;连接酶 0.5 μ L ；dd H2O 3.5 μ L ；BufferI μ Lo
[0047]将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和通ο I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF。
[0048]重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF经限制性内切酶汉猜H I和ZAo I双酶切验证电泳图如图6所示。
[0049]实施例6:重组质粒 pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF 转染 CHO 细胞
一)试验材料
(I)质粒和菌株` 中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)由上海交通大学系统生物医学研究院吴方老师惠赠。
[0050](2)试剂
G418购自购自Invitrogen公司；
二)实施方案
1.重组质粒提取
大量提取重构质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF，纯化后置4°C冰箱保存待用。
[0051]2.CHO细胞的培养
IOOmm的培养皿中以3X IO6个细胞的浓度接种CHO细胞，培养基为含5%的小牛血清的DMEM/F12培养基，转染前一天加入7ml培养基(含血清，不含抗生素)，37°C置于恒温培养箱，5%C02培养，至转染时要求80%-90%细胞汇合。
[0052]3.重组质粒转染CHO细胞
分别把 l_6ug 的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF质粒和 3-18ul 的转染试剂Polyjet?稀释到200ul无血清培养基中，室温放置5-10分钟再混合，将混合液在室温放置5-15分钟后滴入CHO细胞培养基中，培养2-7h后换液(G418+培养基)，继续筛选培养24-48小时得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株。
[0053]实施例7:hEGF蛋白的纯化
收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心去除不容性的杂质，取上清。上清液利用AKTA purifier 100系统经过His Trap? FF crude亲和层析,用清洗液(20mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl, 150 mmol/L NaH2PO4, pH8.0)洗去杂蛋白，再用洗脱液(250mmol/L 咪唑，300mmol/L NaCl, 150 mmol/L NaH2PO4,pH8.0)洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白。含有目的蛋白的样品缓慢加入N1-NTA柱，使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗 5 个柱体积，再用 PBS (pH7.3,140 mM NaCl, 2.7mM NaCl，50 mM NaH2PO4)洗 3 个柱体积。向结合有 Ig kappa-chain-His6-SUM0-hEGF 蛋白的 N1-NTA 柱中加入 0.1mg 的 SUMO 特异性切割酶Ulpl室温反应半小时或4°C下2-6小时。酶切下来的hEGF用PBS洗脱下来，收集流出液进行SDS-PAGE电泳检测。
[0054]过柱纯化的hEGF蛋白进行SDS-PAGE电泳，最后在凝胶成像仪上成像，得到结果如图7所示。
[0055]实施例8 =MTT法测定hEGF蛋白的活性 一)试验材料
1.小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/c 3t3细胞)购自ATCC。
[0056]2.试剂:
①RPMI 1640培养基1000ml加青霉素105IU和链霉素105IU，再加NaHCO3 2.lg，溶解后，混匀，除菌过滤，4度保存
@维持培养液牛血清4ml加RPMI1640 1000ml ；
@完全培养液牛血清100mL加RPMI1640 1000ml ；
④ PBS NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO3 1.44g KH2PO3 0.24g 加水至 1000ml 经 121度15分钟灭菌；
C'噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末0.1g加PBS20ml溶解，经0.22 μ m滤膜过滤除菌，
4度避光保存。
[0057]二)实施方案`
1.取重组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个控。无菌操作；
2.取样品复溶后，用维持培养液稀释。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个控。无菌操作；
Balb/c 3t3细胞株用完全培养液于37度，5%C02培养，控制细胞浓度为每1ml含
1.0X 105-5.0X IO5个细胞，传代后24-36h用于生物活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0X 104-8.0X IO4个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μ I。在37度，5%C02培养培养15_24h。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和样品溶液，每孔100 μ I。于37度，5%C02培养60-72h。每孔加入MTT溶液20 μ 1，于37度，5%C02培养2_8h。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养液中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO) 100 μ 1，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
[0058]Balb/c 3t3细胞的活性测定实验显示与标准品相比hEGF样品具有较高生物学活性，检测到hEGF样品的活性为I X 105U/mg。
[0059]本【技术领域】中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。
【权利要求】
1.一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤: (a)构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6: 提取质粒pcDNA3.l(+)/myc-His A，经限制性内切酶汝./ II和I双酶切处理，得到3392bp的片段； 提取质粒pSecTag2 A，经限制性内切酶汝./ II和泣? I双酶切处理，得到2186bp的片段； 将3392bp片段与2186bp片段以体积比2:3的比例用连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶汝./ II和泣? I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6 ； (b)构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF: 提取重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6，经限制性内切酶I和沿ο I酶切，得到5525bp的片段，酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理； 提取含hEGF基因片段的质粒pMD18-T-His6-SUM0-hEGF，经限制性内切酶汉挪H I和沿οI酶切得到486bp的hEGF基因片段； 将5525bp片段与486bp片段以体积比1:4的比例用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和沿ο I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF ；
(c)重组质粒pBSAZ1.1 myc-His6-SUM0-hEGF转染CHO细胞:在转染试剂存在下将重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF转染CHO细胞，筛选得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株； (d)hEGF蛋白的分泌和纯化:将转染后稳定细胞株于培养基中培养，收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心取上清液；亲和层析，用清洗液除去杂蛋白后，加入洗脱液将hEGF洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白；将含有目的蛋白的样品缓慢加入N1-NTA柱，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用PBS缓冲液洗3个柱体积；最后加入SUMO特异性切割酶Ulpl室温反应10-30分钟或4°C下2-6小时；用PBS洗脱酶切下来的hEGF，收集流出液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述的CHO细胞的培养方法为:IOOmm的培养皿中以3X IO6个细胞的浓度接种CHO细胞，培养基为含5%的小牛血清的DMEM/F12培养基，转染前一天加入7ml含血清，不含抗生素的培养基，37°C置于恒温培养箱，5%C02培养，至转染时要求80%-90%细胞汇合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中的转染方法具体为:分别把4ug的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF质粒和12ul的转染试剂稀释到200ul无血清培养基中，室温放置五分钟再混合，将混合液在室温放置10 — 15分钟后滴入CHO细胞培养基中，培养4h后换液，继续筛选培养24-48小时得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中所述的清洗液含有20mmol/L咪唑，300mmol/L NaC, 150 mmol/L NaH2P04, pH 值为 8.0。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中所述的洗脱液含有250mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl, 150 mmol/L NaH2PO4, pH 值为 8.0。
6.如权利要求1所述的方法 ，其特征在于，步骤d中所述SUMO特异性切割酶Ulpl由以下方法制备得到: (a)构建重组质粒pET-28a-Ulpl:提取含Ulpl基因片段的质粒pMD18-T_Ulpl，经限制性内切酶I和通ο I酶切得到Ulpl基因片段；与经同样双酶切的质粒pET-28a连接得到 pET-28a-Ulpl ； (b)构建重组菌株BL21/pET-28a-Ulpl:将重组质粒pET-28a_Ulpl加入感受态细胞BL21，冰上放置30分钟，然后42 °C水浴中热激90-120秒，冰上放置2_3分钟，涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，置37°C恒温培养箱过夜培养； (c)Ulpl的诱导表达及纯化:挑取重组菌株BL21/pET-28a-Ulpl单克隆于含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡过夜培养，待OD_值0.6-0.8时加入IPTG至终浓度0.2mM,22°C诱导过夜；离心收菌，用破菌缓冲液重悬沉淀，加入PMSF，超声波破菌；细菌破碎液离心，取上清；上N1-NTA柱纯化，N1`-NTA洗脱下来了的蛋白用FPLC进一步纯化。
【文档编号】C12N15/85GK103882055SQ201310651408
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】王喆明, 郑学明, 张宏波, 马经纬 申请人:杭州拜善晟生物科技有限公司