β-内酰胺抗生素合成酶的高通量筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，它按以下步骤进行：在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，在微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出活性高、合成能力好的酶；所述合成液是将β-内酰胺抗生素的母核与侧链溶解于KPB溶液中制成；所述待测酶样品为β-内酰胺抗生素合成酶。本发明可以用于用于内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，适合大规模高通量筛选合成用酶。
【专利说明】β-内酰胺抗生素合成酶的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及高通量筛选技术，具体的说是β-内酰胺抗生素合成酶的高通量筛选方法。
技术背景
[0002]目前内酰胺类抗生素合成用酶主要集中在7-ACA、6_APA、阿莫西林、氨苄西林等的工业生产中，其中应用最广的为青霉素酰化酶(EC 3.5.1.11)，其最早用于6^?八母核的生产。近几年随着生物技术的发展，酶分子改造技术的突破，各种用于内酰胺类抗生素酶法合成的酶分子相继出现，DSM公司已经实现了阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等抗生素的产业化；国内联邦制药也实现了阿莫西林的酶法合成。
[0003]新型酶的发现可以通过自然突变的方法筛选得到，但这种方法因其效率低、目的性差，目前已不多用，人们现在更主要倾向于通过分子改造的手段获得新型的合成酶。使用分子改造的方法对现有的合成酶进行突变时，通常会形成数量巨大的文库，从而高通量的筛选方法成为筛选适合的合成酶的关键。目前人们普遍使用的筛选方法是高压液相色谱(HPLC)，但该方法的准确性虽然比较高，但也存在检测成本高的问题，并且HPLC法检测时间长，从筛选效率上受到限制，不能提高筛选效率。专利CN102264904A公开一种利用检测合成产物浓度的方法，用于高通量的筛选，该方法原理是利用头孢氨苄在碱性条件下在490nm具有最大吸收峰的原理进行的检测，因其只是针对于头孢氨苄的筛选，不能用于头孢克洛、阿莫西林等其它抗生素的筛选，不具有普遍适用性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种内酰胺类抗生素合成酶的高通量筛选方法，以解决现有方法检测效率低、适用范围窄的问题。
[0005]本发明的目的是这样实现的:
一种β_内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，它按以下步骤进行:
在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，放入微孔板振荡反应器中，10-30°C，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出吸光值较早到达最低值且吸光值最低值较低的酶，即为活性高、合成能力好的β_内酰胺抗生素合成酶；
所述合成液是:将母核与侧链溶解于KPB溶液中制成合成液，备用；所述的母核为6-APA、7-ADCA、7-ACCA、7-ACA和7-AVCA中的任意一种，所述的侧链为HPGMEHCL或PGMEHCL ；
所述待测酶样品为内酰胺抗生素合成酶。
[0006]本发明所述β -内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，所述的合成液是每毫升所述KPB溶液中加入母核3~10mg、侧链ri2mg。[0007]本发明所述β -内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，所述β -内酰胺抗生素合成用酶为催化合成阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄或氨苄西林的合成酶。
[0008]所述β -内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法的一个更好的实现方案是，在进行筛选的过程中，加入对照组，即按以下步骤进行:
在酶标板的板孔中加入合成液，然后将板孔分为实验组和对照组，在实验组板孔中加入待测酶样品，在对照组板孔中加入与所述待测酶样品等量的KPB溶液；然后放入微孔板振荡反应器中，10_30°C，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，分别酶标测定实验组和对照组在415nm处的吸光值；根据实验组与对照组吸光值差值的变化趋势及实验组与对照组吸光值差值的大小，筛选出吸光值差值较早到达最最大值且吸光值差值较大的酶，即为活性高、合成能力好的β_内酰胺抗生素合成酶。
[0009]本发明所述的PDAB显色液是:称取0.4g-l.8g PDAB,加入20mL甲醇和44mL纯水制成溶液I ;在16mL冰醋酸中加入60mL纯水，再加入0.08gNa0H溶解制成溶液II ;将溶液I和溶液II混合均匀即得PDAB显色液，避光4°C保存备用。
[0010]本发明的筛选过程的具体条件是:在96孔酶标板的板孔中按10-200 μ L/孔加入合成液，然后将板孔分为实验组和对照组，所述实验组中按10-200 μ L/孔加入待测酶样品，所述对照组中按10-200 μ L/孔加入KPB溶液；然后放入微孔板振荡反应器中，10-30°C，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入10-50 μ L的PDAB显色液，然后分别酶标测定实验组和对照组在415nm处的吸收值。
[0011]本发明建立了一种高通量筛选方法，其是通过显色液与母核反应显色，检测反应液中母核浓度，利用检测母核浓度的方法，反应出其转化率大小。酶标检测的吸光值大小反映出反应体系中母核的浓度大小，因而通过吸光值的大小变化以及根据实验组与对照组吸光值的差值大小，判断出·酶对于相应母核的转化能力大小。本发明方法适用范围广可以用于6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ACCA、7-AVCA等类似母核的检测，用于内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，适合大规模高通量筛选合成用酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是酶标检测6-APA吸光值变化趋势。
[0013]图2是HPLC检测6-APA浓度变化趋势。
[0014]图3是酶标检测7-ADCA吸光值变化趋势。
[0015]图4是PLC检测7-ADCA浓度变化趋势。
[0016]图5是酶标检测7-ACCA吸光值变化趋势。
[0017]图6是HPLC检测7-ACCA浓度变化趋势。
[0018]图7是阿莫西林用合成酶筛选结果。
【具体实施方式】
[0019]以下实施例出现的英文缩写说明为:PDAB:对二甲氨基苯甲醛；6-APA:6-氨基青霉烷酸；7_ACA:7-氨基头孢烷酸；7-ADCA -J-氨基去乙氧基头孢烷酸；7_ACCA -J-氨基-3-氯-3-头孢环-4-羧酸；7-AVCA:7-氨基-3-乙烯基-3-头孢环-4-羧酸；HPGME *HCL:D-对羟基苯甘氨甲酯酸盐酸盐；PGME.HCL:D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐。
[0020]以下实施例用到的仪器为:酶标仪、控温微孔板振荡培养器、控温摇床、冷冻离心机、多道移液器(排枪)。
[0021]以大肠杆菌青霉素酰化酶(EC:3.5.1.11，GeneBank:YP_002295891.1)为出发基
因，根据《精编分子生物学实验指南第四版》第8章方法和《分子克隆试验指南第三版》第15章方案2方法构建得到大肠杆菌文库(Clonef 12、Cf 8)，所构建的文库菌落在大肠杆菌青霉素酰化酶原始蛋白序列的基础上有如下突变:
Clonel在第35位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，Clone2在第95位异亮氨酸突变为丙氨酸，Clone3在第246位脯氨酸突变为精氨酸，Clone4在第478位甘氨酸缺失；Clone5在第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸，Clone6在第478位甘氨酸突变为酪氨酸，Clone7在第801位丙氨酸突变为赖氨酸，CloneS在第838位丝氨酸突变为天冬氨酸；Clone9在第51位色氨酸缺失，ClonelO在第159位天冬氨酸突变为异亮氨酸，Clonell在第300位丙氨酸突变为精氨酸，Clonel2在第819位天冬氨酸缺失；
Cl:第51位色氨酸缺失+第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸，C2 --第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸+第159位天冬氨酸突变为异亮氨酸，C3 --第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸+第300位丙氨酸突变为精氨酸，C4 --第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸+第819位天冬氨酸缺失，C5:第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸+第478位甘氨酸突变为酪氨酸，C6:第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸十第801位丙氨酸突变为赖氨酸，C7 --第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸+第838位丝氨酸突变为天冬氨酸，CS --第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸+第478位甘氨酸缺失。
[0022]实施例1
本实施例中用到的试剂配制方法如下:
①LB 培养基:I % Trptone; 0.5% Yeast Etract ; 1% NaCl ；
②Lysis Buffer 裂解缓冲液:10mM-50mM Tris-Hcl (pH 7.2) ; 1-5% Glycerol;10mM-50mM NaCl ；
③KPB 溶液:配置 0.02-0.2M KH2PO4 和 0.02-0.2M K2HPO4，调节 pH 值 5.0-7.0 ；
④PDAB显色液:称取0.4g-l.8g PDAB,加入20mL甲醇和44mL纯水置成溶液I ;16mL冰醋酸加入60mL纯水，加入0.08gNa0H溶解制备溶液II ;混合溶液I和溶液II，避光4°C
保存；
⑤合成液:分别称取30-1OOmg6-APA、7-ADCA或7-ACCA β -内酰胺抗生素母核和40-120mg HPGME.HCL或PGME.HCL等合成侧链溶解在IOmL KPB溶液中。
[0023]本实施例将文库中的Clonef 12按如下分组进行筛选:
【权利要求】
1.一种β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，其特征在于它按以下步骤进行: 在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，放入微孔板振荡反应器中，10-30°C，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出吸光值较早到达最低值且吸光值最低值较低的酶，即为活性高、合成能力好的酶； 所述合成液是:将母核与侧链溶解于KPB溶液中制成合成液，备用；所述的母核为6-APA、7-ADCA、7-ACCA、7-ACA 和 7-AVCA 中的任意一种，所述的侧链为 HPGME.HCL 或PGME.HCL ； 所述待测酶样品为内酰胺抗生素合成酶。
2.根据权利要求1所述β_内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，其特征是，所述的合成液是每毫升所述KPB溶液中加入母核3~10mg、侧链ri2mg。
3.根据权利要求1或2所述β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，其特征是，所述内酰胺抗生素合成用酶为催化合成阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄或氨苄西林的合成酶。
【文档编号】C12Q1/34GK103667418SQ201310696643
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】刘力强, 贾娟娟, 牛昆, 范俊辉, 石晨光, 王召业, 吕娜, 武芳, 王欢, 杨丽萍, 邸胜苗, 刘 东 申请人:华北制药河北华民药业有限责任公司