一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒，属于生物【技术领域】。本发明针对柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列，设计了6对特异性引物，这些引物的扩增区域涵盖了FS-577的全序列。将扩增片段经双酶切后依次插入到改造后的双元载体pUC119-Δ9后获得的全长侵染性克隆与野生型FS-577相比，在序列、侵染能力和寄主范围等性状上完全一致。利用该方法建立的试剂盒，包括有第一链cDNA合成、PCR扩增、双酶切缓冲液，以及链接反应缓冲液等，这些试剂盒可用于构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆。本发明为研究柑桔衰退病毒致病和蚜传等机理，以及柑桔衰退病防治提供了极其重要的技术平台。
【专利说明】一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒，尤其涉及一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]中国的柑桔种植面积和产量均居世界第一。柑桔衰退病毒(Citrus tristezavirus，CTV)引起的柑桔衰退病是一种重要的世界性柑桔病害，通过蚜虫和带病苗木传播。我国广泛分布着柑桔衰退病毒的多种强毒株和强力传媒褐色桔蚜，随着20世纪80年代末我国开始进行柑桔产业结构调整，柚类和甜橙的种植比例增加，柑桔衰退病对柚类和某些甜橙的为害日益加剧。
[0003]植物病毒侵染性载体是研究病毒功能基因组的至关重要的平台，在分子生物学水平上研究病毒基因组结构与功能以及寄主与病毒直接的互作，必须要获得病毒的侵染性克隆，在此基础上才能获得野生型分子或者突变型分子的均一群体，进而利用DNA重组技术进行突变、缺失、插入、置换以及互补实验对病毒基因组进行功能区域的定位，从而能在寄主植物表型水平上反映和评价基因功能的表达，该技术是深入研究病毒的基因功能以及病毒与寄主植物互作的有效手段。
[0004]目前主要通过弱毒株交叉保护技术来防治柑桔衰退病，但是由于对柑桔衰退病毒的致病和蚜传机理，以及交叉保护作用原理的认识还不全面，因此在防治上还存在许多局限，影响了防治效果。构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆是进行上述研究的关键环节。由于柑桔衰退病毒基因组通常含有19296个核苷酸，是已知最大的植物病毒，病毒颗粒极易断裂，且缺乏适宜的草本寄主，因此构建全长侵染性克隆的难度极大。我国尚未开展此类研究。
【发明内容】
[0005]针对我国现有柑桔衰退病防治及研究中的瓶颈问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒。
[0006]本发明所提供的柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤:
[0007]1)提取柑桔病株中柑桔衰退病毒分离株FS-577的总RNA ；
[0008]2)以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA ；
[0009]3)用柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段:cDNA片段1~6，所述的特异性引物的核苷酸序列分别为:
[0010]弓丨物1上游引物序列ZYC214:
[0011]5 ’ -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0012]弓丨物1下游引物序列ZYC1293:
[0013]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；[0014]引物2上游引物序列ZYC749:
[0015]5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；
[0016]弓丨物2下游引物序列ZYC1894:
[0017]5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ；
[0018]弓丨物3上游引物序列ZYC253:
[0019]5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；
[0020]弓丨物3下游引物序列ZYC1436:
[0021]5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ；
[0022]引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；
[0023]弓丨物4下游引物序列ZYC1493:
[0024]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0025]弓丨物5上游引物序列ZYC431:
[0026]5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；
[0027]弓丨物5下游引物序列ZYC1478:`[0028]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0029]弓丨物6上游引物序列ZYC2158:
[0030]5’ -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；
[0031]引物6 下游引物序列 ZYC114:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ；
[0032]4)将步骤3中扩增得到的cDNA片段I与双元载体pUC119_ Λ 9分别进行PmeI/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-143 ;将35S-143与cDNA片段2分别进行Pstl/Swal双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-144 ;将35S-144与cDNA片段3分别进行Xmal/Pmel双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-145 ;将35S-145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-146 ;将35S-146与cDNA片段5分别进行Rsr II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-147 ;将35S-147与cDNA片段6分别进行Rsr II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148。
[0033]所选的酶切位点使得扩增片段可以成功地插入双元载体PUC119-A9中。所述步骤4中的双元载体为PUC119-A9，使用该双元载体可极大的提高柑桔衰退病毒全长克隆的侵染能力。通过生物学验证表明，35S-148具有侵染能力不仅能侵染草本植物本生烟，还能侵染大翼来檬等不同的柑桔品种。由此证明本发明构建的35S-148是柑桔衰退病毒FS-577的全长侵染性克隆，具有与FS-577相同的侵染能力和寄主范围。该全长侵染性克隆为研究柑桔衰退病毒致病和蚜传等机理，以及柑桔衰退病防治提供了极其重要的技术平台。
[0034]所述步骤3 中 PCR 扩增的反应条件为 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec，72°C，4min循环35次；最后72°C延伸lOmin，终止反应。
[0035]本发明还提供了一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的试剂盒，包括:
[0036]柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列扩增的6对引物:[0037]弓丨物1上游引物序列ZYC214:
[0038]5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0039]弓丨物1下游引物序列ZYC1293:
[0040]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；
[0041 ]弓丨物2上游引物序列ZYC749:
[0042]5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；
[0043]引物2下游引物序列ZYC1894:
[0044]5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ；
[0045]弓丨物3上游引物序列ZYC253:
[0046]5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；
[0047]弓丨物3下游引物序列ZYC1436:[0048]5， -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3，；
[0049]引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；
[0050]弓丨物4下游引物序列ZYC1493:
[0051]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0052]弓丨物5上游引物序列ZYC431:
[0053]5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；
[0054]弓丨物5下游引物序列ZYC1478:
[0055]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0056]弓丨物6上游引物序列ZYC2158:
[0057]5’ -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；
[0058]引物6 下游引物序列 ZYC114:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ；
[0059]所述的一种用于构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的试剂盒，其特征在于:还包括以下溶液:
[0060]反应缓冲液:2X反应缓冲液:200mM ρΗ8.8Tris_HCl，lOOmM(NH4)2S04, lOOmMKCl,20mM MgS04, l%Triton X-100, lOmM dNTP，0.02M DTT,5mM MgCl2 ;反转录缓冲液:10X 反转录缓冲液:lOOmM ρΗ9.0Tris-HCl, 500mM KC1, l%TritonX-100, lOmM MgCl2，0.02M DTT ；
[0061]PCR 缓冲液:10XPCR 缓冲液:200mM pH8.8Tris_HCl，lOOmM(NH4)2S04, lOOmMKCl,20mM MgS04, l%Triton X-100, lOmM dNTP ；
[0062]双酶切缓冲液:100XBSA，lOmMBis-Tris-Propane-HCl，lOmM MgCl2, ImM DTT ;链接反应缓冲液:300mM ρΗ7.8Tris_HCl，lOOmM MgCl2, lOOmM DTT, lOmMATP ；
[0063]裂解液I:2mg/ml 溶菌酶，1M pH8.0Tris HC1，0.5M EDTA ；
[0064]裂解液I1:0.2M NaOH, 1%SDS。
[0065]有益效果:本发明根据已公布的柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列，在FS-577上筛选出6个可供使用的单一酶切位点，并由此设计了 6对特异性引物，这些引物的扩增区域涵盖了 FS-577的全部序列。获得的扩增序列按照筛选出的酶切位点进行不同的双酶切，并将其依次插入改造后的双元载体PUC119-Λ 9，从而获得具有侵染力的全长克隆。该全长侵染性克隆不仅与野生型FS-577的序列完全一致，而且具有野生型FS-577同样的侵染能力和寄主范围，可以侵染本生烟和柑桔。利用该方法建立的试剂盒，包括有第一链cDNA合成、PCR扩增、双酶切缓冲液，以及链接反应缓冲液等，这些试剂盒可用于构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆。本发明为研究柑桔衰退病毒致病和蚜传等机理，以及柑桔衰退病防治提供了极其重要的技术平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0066]图1为本发明35S-147和片段6经RsrII/AscI双酶切产物电泳图；A:35S_147经RsrII/AscI双酶切产物；B:片段6经RsrII/AscI双酶切产物；M:标准分子量为12000bpmarker ；
[0067]图2为本发明本生烟接种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆后表现的症状;A:健株；B:接种植株；
[0068]图3为本发明大翼来檬接种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆后鉴定结果；1:正对照，16:负对照，2-15为待测样品。
【具体实施方式】
[0069]本发明的柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列公布在NCBI网站上，ID号为KC517488.1。
[0070]本发明中的DTT为Dithiothreitol的简称，中文名称为二硫苏糖醇(鼎国，中国)。Triton X-100中文名称为聚乙二醇辛基苯基酿(鼎国，中国)。Bis-Tris-Propane为1，3- 二 [三(轻甲基)甲氨基]丙烷(Sigma，美国)，用HCl调节为ρΗ7.8，得到Bis-Tris-Propane-HCl。ATP 为 Adenosine Triphosphate 的简称，中文名称为三憐酸腺苷(鼎国，中国)。EDTA为Ethylene Diamine Tetraacetic Acid的简称，中文名称为乙二胺四乙酸(鼎国，中国)。SDS为Sodium lauryl sulfate的简称，中文名称为十二烷基硫酸钠(鼎国，中国)。BSA为bovine serum albumin,中文名称为小牛血清白蛋白(Bio Basic Inc,加拿大)。溶菌酶为来源于鸡蛋白的溶菌酶(Sigma，美国)。
[0071]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
[0072]实施例一、柑桔衰退病毒分离株FS-577的鉴定、分离和保存
[0073](I)柑桔衰退病毒的鉴定、分离
[0074]从田间植株的四个不同方向采集已经老熟且带有叶片的枝条。采用直接组织点免疫的方法进行检测，具体操作如下:用剃须刀片横切样品的茎干或叶柄，随即均匀地压在硝酸纤维素膜上，并设置正负对照，室温下干燥15min以上。将印迹膜置于含1%BSA的0.02Μ，ρΗ7.2 的磷酸缓冲液(0.13Μ NaCl, 0.02MNa2HP04.12H20，14mM KH2PO4, 20mM KCl,20mMNaN3)中封闭Ih后直接加入1000:1 (v/v)碱性磷酸酯酶(Ap)标记的CTV专化抗体IgG(BioRad，美国)中，在室温下摇动反应2h。倒去含Ap-1gG的缓冲液，加入磷酸吐温缓冲液(0.13M NaCl, 0.02M Na2HPO4.12H20,14mM KH2PO4, 20mM KCl,20mM NaN3,0.5% 吐温-20)洗膜3次，每次在室温下摇动反应5min。倒出磷酸吐温缓冲液，依次加入5ml碱性磷酸缓冲液(1M Tris_base，0.15M NaCl, 0.34M MgCl2), 1.7 μ g 氯化硝基四氮唑蓝(Promega，美国)和
0.85 μ g5-溴-4-氯_3_ Π引哚基-磷酸盐(Promega,美国),在室温下避光摇动15min后,用蒸馏水冲洗硝酸纤维素膜终止反应。通过观察待测样品的叶柄或枝条在硝酸纤维素膜上的印记是否与正对照一样在其韧皮部处出现了黑褐色环状物的方式来判断植株是否感染了柑桔衰退病毒。如果在韧皮部出现了黑褐色环状物，则说明感染了柑桔衰退病毒。
[0075]由于柑桔衰退病毒FS-577属于T36基因型，因此使用Hilf Μ E等(Phytopathology，2005)发表的针对Τ36基因型柑桔衰退病毒的外壳蛋白基因、5’非翻译区、K17和P0L的特异性引物对T36CP (正向引物:5’-ATGGACGACGAAACAAAGAAATTG_’3，反向引物:5 ’ -TCAACGTGTGTTGAATTTCCCA-3 ’ )，T36-5 (正向引物:5 ’ -AATTTCACAAATTCAACCTG-3 ’，反向引物:5’ -CTTTGCCTGACGGAGGGACC-3’)，T36K17F (正向引物:5 ’ -GTTTTCTCGTTTGAAGCGGAAA-3，，反向引物:5 ’ -CAACACATCAAAAATAGCTAGT-3 ’ )，T36P0L (正向引物:5 ’ -TGACGCTAACGACGATAACG-3，，反向引物:5 ’ -ACCCTCGGCTTGTTTTCTTATG-3 ’ )进行鉴定。具体操作如下:使用RNAisoplus试剂盒(Takara,日本)提取感染了柑桔衰退病毒的植株叶片中的总RNA。5 μ L总RNA在95°C下变性3min后置于冰上，并混入4 μ L7K，40 μ L2 X反应缓冲液(200mM ρΗ8.8Tris-HCl, lOOmM (NH4)2S04, lOOmM KCl,20mM MgS04, l%TritonX-100, lOmM dNTP，0.02M DTT,5mM MgCl2，lOmM 正反向引物)，1 μ L RT/Taq 酶(Invitrogen，美国)。反应条件为:42°C，20min，94°C，lmin，[94°C，30sec，45°C，30sec，72°C，60sec]循环35次，72°C，5min。RT-PCR产物经切胶纯化后取lyL纯化产物，与1 μ L平末端载体pSIMPLE-19EcoRV/BAP (Takara,日本)，2 μ L 水，5 μ L 链接缓冲液(300mM ρΗ7.8Tris_HCl，100mMMgCl2, lOOmM DTT, lOmM ATP), 1 μ L3U/μ L T4DNA连接酶(Promega，美国)混合，16°C反应30min，加入50yL感受态细胞JM109 (Promega，美国)轻轻混匀，冰上放置30min。42V水浴热激90sec，冰浴2min。沿管壁轻轻加800 μ L室温平衡后的LB液体培养基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37 °C，150rpm复苏培养lh。吸取50 μ L菌液涂布于含抗生素的LB培养基(0.1%氨苄青霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中。37 °C过夜培养。挑取单个白斑在1ml LB液体培养基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中37 °C，150rpm培养10h。按照质粒纯化试剂盒(Takara,日本)纯化质粒。纯化方法参照试剂盒操作说明书，在此不做赘述。对分别插入到质粒中的4个PCR片段进行测序分析。如果上述4个PCR片段分别与NCBI数据库中ID号为KC517488.1序列中的外壳蛋白基因、5’端区域、K17区域和P0L区域的序列都完全匹配时，则可确认分离到了柑桔衰退病毒分离株FS-577。
[0076](2 )柑桔衰退病毒FS-577的保存:
[0077]将田间感染了 FS-577的植株枝条的皮和芽嫁接于锦橙实生苗。每株锦橙实生苗上腹接毒源植株枝条的一个芽和两块皮，并各设立3株作为正负对照，接种后保存在网室中。每半个月观察一次，若发现有接芽或接皮死亡，需立即补接，至少每株有两块皮存活。每隔一个月施用一次复合肥。接种3个月后用步骤1 “柑桔衰退病毒的鉴定、分离”中的直接组织点免疫方法检测FS-577是否保存成功。
[0078]实施例二、一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，按照以下步骤操作:
[0079](1)总RNA提取:采用Trizol试剂盒(Invitrogen,美国)提取病株中柑桔衰退病毒分离株FS-577的总RNA。提取方法参照Trizol试剂盒操作说明书，在此不做赘述。
[0080](2)第一链cDNA的合成:将8 μ L提取的总RNA，与1 μ L50ng/ μ L随机引物(Promega公司，美国)，1 μ LlOmM dNTP混合后65°C下反应5min,冰上放置lmin。随后在此反应液中加入 10μ L10X 反转录缓冲液(lOOmM pH9.0Tris-HCl, 500mM KC1, l%TritonX-100, lOmM MgC l2,0.02M DTT)，4U RNaseOUT (Invitrogen，美国)，2U SuperScript IIIRT (Invitrogen，美国)。混匀后分别在25°C下反应lOmin，50°C下反应50min，85°C下反应5min。随后在冰上至少放置Imin再加入I μ L2U/ μ L RnaseH (Invitrogen,美国),在37。。下反应20min终止反应。-20°C保存。
[0081](3)cDNA片段的扩增:根据NCBI已公布的柑桔衰退病毒FS-577全序列(ID号KC517488.1)设计 6 对特异性引物 ZYC214/ZYC1293, ZYC749/ZYC1894, ZYC253/ZYC1436,ZYC126/ZYC1493, ZYC431/ZYC1478和ZYC2158/ZYC114，从而依次合成柑桔衰退病毒分离株FS-577 全序列上 PmeI 到 PstI (cDNA 片段 I), PstI 到 SwaI (cDNA 片段 2)，PmeI 到 XmaI(cDNA 片段 3)，XmaI 到 Bsu36I (cDNA 片段 4)，Rsr II 到 Bsu36I (cDNA 片段 5)和 Rsr II到AscI (cDNA片段6)的序列。200 μ L扩增体系中含有140 μ L10XPCR缓冲液(200mMpH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2SO4, IOOmM KCl，20mM MgSO4, l%Triton X-100, IOmM dNTP),10 μ M正反向引物，2 μ L4U/μ L Vent DNA聚合酶(ΝΕΒ，美国)，50 μ L水和4 μ L第一链cDNA。其中 cDNA 片段 I 使用引物 ZYC214/ZYC1293，cDNA 片段 2 使用引物 ZYC749/ZYC1894，cDNA片段3使用引物ZYC253/ZYC1436，cDNA片段4使用引物ZYC126/ZYC1493，cDNA片段5使用引物 ZYC431/ZYC1478，cDNA 片段 6 使用引物 ZYC2158/ZYC114。反应条件为 94°C，2min，[94°C，30sec，58°C，45sec，72°C，4min]循环 35 次，最后在 72°C延伸 lOmin，终止反应。
[0082]所述的根据柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列设计的6对特异引物序列如下:
[0083]弓丨物I上游引物序列ZYC214:
[0084]5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0085]弓丨物I下游引物序列ZYC1293:
[0086]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；
[0087]弓丨物2上游引物序列`ZYC749:
[0088]5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；
[0089]弓丨物2下游引物序列ZYC1894:
[0090]5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ；
[0091]弓丨物3上游引物序列ZYC253:
[0092]5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；
[0093]弓丨物3下游引物序列ZYC1436:
[0094]5， -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3，；
[0095]引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；
[0096]弓丨物4下游引物序列ZYC1493:
[0097]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0098]弓丨物5上游引物序列ZYC431:
[0099]5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；
[0100]弓丨物5下游引物序列ZYC1478:
[0101]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0102]弓丨物6上游引物序列ZYC2158:
[0103]5’ -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；
[0104]引物6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ；
[0105](4) PCR 产物的浓缩:200 μ L cDNA 片段 I 的 PCR 产物加入 20 μ L3M pH5.2Na0Ac和200 μ L无水乙醇。充分混匀后置于-80°c中15分钟。12000rpm离心lOmin，去除上清。加入700 μ L70%乙醇清洗、干燥后用87 μ L双蒸水溶解待用。同样的方法用于浓缩其余的cDNA 片段 2-6。
[0106](5)改造pUC119获得双元载体pUC119-A9:在华大基因公司(中国)合成2条双链DNA片段:多克隆位点I (其为ASC1-RSrI1-BSu361-XmaI酶切位点的序列:5’ -AGGCGCGCCTGCWGGWCCG CCTNAGGCCCCCGGGGG-3’，及相应的互补链)和多克隆位点 2 (为Xmal-Pmel-Pst1-Swa1-SacI 酶切位点的序列:CCCCCCGGGGGGITTAAACCTGCACTGCAGTGCAITTAAATTCCGAGCTCGGA，W:A/T, N:A/C/G/T)以及相应的互补链，由此构成双链的多克隆位点I和双链的多克隆位点2。
[0107]将5 μ g多克隆位点I的双链DNA与25 μ L pUC119(Promega，美国)分别进行AscI/XmaI双酶切。酶切体系为限制性内切酶AscI (NEB，美国)和XmaI (NEB，美国)各10U，10 μ L双酶切缓冲液(100 X BSA，IOmMBis-Tris-Propane-HCl, IOmM MgCl2, ImM DTT)，其余用水将总体积定为100 μ L0 37°C下反应过夜。多克隆位点I和PUC119经Ascl/Xmal双酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，用20 μ L水溶解切胶回收、纯化后的双酶切产物，并取15.5 μ L混入
3.5μ L链接缓冲液(300mM pH7.8Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT，IOmM ΑΤΡ)，I μ L3U/μ L T4DNA连接酶(Promega，美国)。16°C下反应过夜。链接液中加入50 μ L感受态细胞JM109 (Promega，美国)，冰上放置30min，42°C水浴热激90sec后，冰浴2min，加入400 μ LLB液体培养基(l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm复苏培养Ih，菌液涂布于含卡那霉素的LB培养基(0.1%卡那霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1.5%琼脂粉)中，37°C培养过夜。挑取阳性克隆置于40ml含卡那霉素的LB培养基(0.1%卡那霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中，37°C，220rpm，过夜培养。
[0108]提取上述菌液中的质粒并进行纯化:将上述培养过夜的菌液4°C，4000rpm离心15min，用 3ml 裂解液 I (2mg/ml 溶菌酶，IM pH8.0Tris HCl, 0.5Μ EDTA)溶解沉淀，并依次加入 6ml 裂解液 II (0.2M NaOH，1%SDS)，和 3.75ml3M pH5.8Na0Ac。12000rpm 离心 15min后在上清中加入20 μ L100mg/ml RnaseA。37°C处理30min。取上清，并加入等体积95%冰乙醇，-20°C过夜。4°C 1000Orpm离心lOmin。70%乙醇清洗沉淀。沉淀干燥后用300 μ L水溶解，从而得到PUC119- Λ 7。通过测序进行验证。
[0109]5 μ g多克隆位点2的DNA与25 μ LpUCl 19-Δ 7分别进行Xmal/SacI双酶切。双酶切时，除限制内切酶为XmaI (NEB，美国)和SacI (NEB，美国)各10U外，其余酶切体系与多克隆位点I和PUC119双酶切时相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒的纯化方法都与获得PUC119- Λ 7时的方法一致。由此得到改造后的载体pUC119- Δ 9，通过测序进行验证。
[0110](6)355-143的获得:将25 4 1^ pUCl 19-Λ 9载体与浓缩后的87 μ L cDNA片段I分别进行Pmel/PstI双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为PmeI (NEB，美国)和PstI (NEB，美国)各10U外，其余酶切条件与步骤5中的双酶切条件一致。后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。从而将cDNA片段I插入到pUCl 19- Δ 9中，由此得到35S-143。
[0111](7) 35S-144的获得:取20 μ L35S-143与浓缩后87 μ L的cDNA片段2分别进行Pstl/Swal双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为PstI (NEB，美国)和SwaI (NEB，美国)各10U外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1和2的35S-144。[0112](8) 35S-145的获得:取20 μ L35S-144与浓缩后87 μ L的cDNA片段3分别进行Xmal/Pmel双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为Xmal (NEB，美国)和Pmel (NEB，美国)各10U外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-3的35S-145。
[0113](9) 35S-146的获得:取20 μ L35S-145与浓缩后87 μ L的cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为Xmal (NEB，美国)和Bsu36I (NEB，美国)各10U外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-4的35S-146。
[0114](10) 35S-147的获得:取20 μ L35S-146与浓缩后87 μ L的cDNA片段5分别进行RsrII/Bsu36I双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为RsrII/Bsu36I各10U外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-5的35S-147。
[0115](11) 35S-148的获得:取20 μ L35S-147与浓缩后87 μ L的cDNA片段6分别进行RsrII/AscI双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为Rsr II (NEB，美国)和AscI (NEB，美国)各10U外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-6的35S-148，即柑桔衰退病毒全长克隆35S-148。
[0116]35S-147和cDNA片段6经RsrII/AscI双酶切产物电泳图如图1所示。
[0117]将获得的全长克隆35S-148测序，到NCBI网站与野生型FS-577序列(ID号KC517488.1)进行Blast比对，序列完全一致。
[0118]实施例二、柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148的应用实例
[0119]将2 μ g35S-148加入到50 μ L农杆菌ΕΗΑ105感受态细胞中，37°C热激5min，冰上放置5min后加入1ml LB培养基(l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，28°C，220rpm摇动生长4h后。菌液4000rpm离心5min，用lOOyL LB (l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)溶解沉淀，并涂布于含抗生素的LB培养基(0.1%卡那霉素，0.1%利福平，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1.5%琼脂粉)，28°C生长2天。挑单斑在5ml含抗生素的LB培养基(0.1%卡那霉素，0.1%利福平，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中28°C,220rpm生长1-2天。取50 μ 1菌液接种到10ml LB (l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，10mMpH5.85MES，20 μ Μ乙酰丁香酮，50 μ g/ml卡拉霉素，50 μ g/ml利福平)28°C摇菌过夜。菌液5000rpm 离心 15min。用 15ml 接种缓冲液(10mMpH5.85MES, 10mMMgC12,150 μ Μ 乙酰丁香酮)溶解沉淀。最后将溶液注射接种于1月龄的本生烟(25°C，16h光照，8h黑暗)。如图2所示，接种1个月后植株发病，叶片出现斑驳症状。由此证明35S-148具有侵染性，是柑桔衰退病毒分离株FS-577的全长侵染性克隆。
[0120]称取5g表现症状的本生烟叶片在液氮中研磨后，加入10ml40mM KP04，4°C，12000rpm离心15min。取上清液在其底部加入lml40mM ΚΡ04 (含70%鹿糖)进行鹿糖密度梯度离心(4°C，38000rpm离心1.5h)，穿刺取出病毒层溶液。将获得的病毒提取液汁液接种于1年生大翼来蒙。接种3个月后，按照实施例一中步骤1“柑桔衰退病毒的鉴定、分离”的直接组织点免疫方法进行检测，结果在待测样品中发现韧皮部的印迹处出现了黑褐色环状物，因此进一步证明本发明中构建的柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148具有与柑桔衰退病毒分离株FS-577 —致的侵染能力。如图3所示，1为正对照，16为负对照，其余为待测样品，如果韧皮部出现黑褐色环状物，则说明植株感染了柑桔衰退病毒分离株FS-577的全长侵染性克隆35S-148。待测样品2-11中均在韧皮部出现黑褐色环状物，说明植株感染了柑桔衰退病毒分离株FS-577的全长侵染性克隆35S-148，而样品12-15未在韧皮部出现黑褐色环状物，说明植株暂时未感染全长侵染性克隆35S-148。
[0121]将感染了柑桔裳退病毒全长侵染性克隆35S-148的大翼来檬植株的皮和芽分别嫁接接种于锦橙-北碚447，墨西哥来檬和邓肯葡萄柚。每株接种2块长度为10mm宽5mm的皮和1个芽。接种后植株放于25-28°C的温室保存。接种3个月后，用上述直接组织点免疫方法对新梢进 行检测，结果发现接种的植株都感染了柑桔衰退病毒。由此进一步证明全长侵染性克隆35S-148与野生型FS-577具有相同的侵染能力和寄主范围。
【权利要求】
1.一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤: 1)提取柑桔病株中柑桔裳退病毒分尚株FS-577的总RNA； 2)以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA； 3)用柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段:cDNA片段I~6,所述的特异性引物的核苷酸序列分别为: 引物I上游引物序列ZYC214 :
5’ -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3’ ； 引物I下游引物序列ZYC1293:
5’ -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3’ ； 引物2上游引物序列ZYC749:
5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ； 引物2下游引物序列ZYC1894:
5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ； 引物3上游引物序列ZYC253:
5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ； 引物3下游引物序列ZYC1436:
5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ； 引物 4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ； 引物4下游引物序列ZYC1493:
5’ -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3’ ； 引物5上游引物序列ZYC431:
5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ； 引物5下游引物序列ZYC1478:
5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，； 引物6上游引物序列ZYC2158:
5’ _CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ； 引物 6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ； 4)将步骤3中扩增得到的cDNA片段I与双元载体pUC119-Δ 9分别进行Pmel/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-143 ；将35S-143与cDNA片段2分别进行Pstl/Swal双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-144 ;将35S-144与cDNA片段3分别进行Xmal/Pmel双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-145 ;将35S-145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-146 ;将35S-146与cDNA片段5分别进行Rsr II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-147 ;将35S-147与cDNA片段6分别进行Rsr II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148。
2.根据权利要求1所述的一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，其特征在于:所述步骤 3 中 PCR 扩增的反应条件为 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec, 72°C，4min循环35次；最后72°C延伸lOmin，终止反应。
3.一种用于构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的试剂盒，其特征在于:包括柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列扩增的6对引物:引物1上游引物序列ZYC214:5’ -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3’ ；引物1下游引物序列ZYC1293:5’ -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3’ ；引物2上游引物序列ZYC749:5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；引物2下游引物序列ZYC1894:5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ；引物3上游引物序列ZYC253:5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；引物3下游引物序列ZYC1436:5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ；引物 4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；引物4下游引物序列ZYC1493:5’ -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3’ ；引物5上游引物序列ZYC431:5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；引物5下游引物序列ZYC1478:5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；引物6上游引物序列ZYC2158:5’ _CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；引物 6 下游引物序列 ZYC114:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’。
4.根据权利要求3所述的一种用于构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的试剂盒，其特征在于:还包括以下溶液:反应缓冲液:2X 反应缓冲液:200mM pH8.8Tris_HCl，100mM(NH4)2S04, lOOmMKCl, 20mMMgS04, l%Triton X-100, lOmM dNTP，0.02M DTT,5mM MgCl2 ;反转录缓冲液:10X 反转录缓冲液:100mM ρΗ9.0Tris-HCl,500mM KC1,l%TritonX_100,lOmM MgCl2，0.02M DTT ；PCR 缓冲液:10XPCR 缓冲液:200mM pH8.8Tris-HCl, 100mM(NH4)2S04, lOOmMKCl, 20mMMgS04,l%Triton X-100,lOmM dNTP ；双酶切缓冲液:100XBSA，lOmM Bis-Tris-Propane-HCl, lOmM MgCl2, ImM DTT ;链接反应缓冲液:300mM ρΗ7.8Tris-HCl, lOOmM MgCl2, lOOmM DTT, lOmMATP ；裂解液 I:2mg/ml 溶菌酶，1M pH8.0Tris HC1，0.5M EDTA ；裂解液 II:0.2M NaOH, 1%SDS。
【文档编号】C12N15/82GK103642835SQ201310703583
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】周彦, 周常勇, 李中安 申请人:中国农业科学院柑桔研究所