用于检测b型tel-abl融合基因的方法和寡核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸，所述寡核苷酸包括检测B型TEL-ABL融合基因的引物TA-F、TA-R以及探针TA-Probe；检测内参基因abl的引物abl-F、abl-R以及探针abl-Probe。该寡核苷酸经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。可用于检测人类白血病患者体内B型TEL-ABL融合基因是否存在及其表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查，可有效地节约检测时间，提高检测精度。
【专利说明】用于检测B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别是一种用于检测B型TEL-ABL融合基因的方法和寡核苷酸，采用实时荧光定量PCR技术，可用于检测人类白血病患者体内B型TEL-ABL融合基因是否存在及其表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查，可有效地节约检测时间，提闻检测精度。
【背景技术】
[0002]TEL-ABL (又可称为ETV6-ABL)融合基因于1995年首次被报道于国外学者Papadopoulos的研究中。TEL基因位于人类12号染色体短臂I区3带,ABL基因位于人类9号染色体长臂3区4带。这两种基因融合时可能会产生三种断裂方式，但在mRNA水平上，最终只会出现两种转录体，即A型融合基因和B型融合基因。这两种类型的融合基因在ABL端的断裂位置是一致的，即在A型融合基因和B型融合基因中，ABL端均起始自ABL基因的2号外显子。不同的是:A型融合基因在TEL端的断裂位置位于TEL基因的4号外显子出型融合基因在TEL端的断裂位置位于TEL基因的5号外显子。这样的融合方式也说明了 TEL基因的5号外显子不是TEL-ABL融合基因导致白血病产生所必需的。
[0003]现有的研究已发现TEL蛋白的HLH结构域可通过寡聚化让酪氨酸激酶不依赖配体而持续激活，从而形成血液肿瘤。TEL蛋白的HLH结构域也可与一些转录因子形成融合蛋白。TEL-ABL融合基因编码的TEL-ABL融合蛋白是由TEL蛋白的HLH结构域和ABL蛋白的酪氨酸蛋白激酶活性域嵌合而成的。TEL基因和BCR基因均有使ABL受体酪氨酸激酶寡聚化的能力，因而使得T EL-ABL融合基因的致病机理与BCR-ABL融合基因有些类似:TEL蛋白提供氨基端的HLH结构域，在产生的融合蛋白中HLH结构域的二聚化作用下，使得非受体型酪氨酸激酶ABL基因持续表达而使细胞恶性增殖,导致白血病发生。
[0004]在已报道的TEL-ABL融合基因阳性病例中，患者的男女比率为2.6:1，平均诊断年龄为48岁，其中多数患者为慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia, CML)患者，其它也包括了急性髓系白血病未分化型(acute myeloid leukemia-Ml，AML-M1)、慢性骨髓增生瘤(chronic myeloproliferative neoplasm, cMPN)及急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia, ALL)患者。
[0005]目前，抑制这种融合基因的有效药物仍以酪氨酸激酶抑制剂为主(与BCR-ABL融合基因相似)。多篇研究报道了在体外实验中，酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼和尼罗替尼，可以控制TEL-ABL融合基因阳性细胞的生长。即便如此，TEL-ABL融合基因阳性患者的预后仍较不理想。在已报道的TEL-ABL融合基因阳性患者中，死亡率约为65%，而且对ALL幼儿患者而言，TEL-ABL融合基因阳性将会是一个预后不良的指标。因此，对TEL-ABL融合基因进行定量监测，是判断和追踪该融合基因阳性的白血病患者疗效的良好指标，可以较好地反映患者微小残留病灶(Minimal Residua Disease, MRD)的动态变化。
[0006]目前临床上已经将TEL-ABL融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、逆转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RQ-PCR)等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是实验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，判读结果存在较大的主观性。而单纯的RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。鉴于MRD是白血病患者复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对TEL-ABL融合基因mRNA的MRD进行检测。
[0007]RQ-PCR方法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时在线检测，反映TEL-ABL融合基因在样品中的初始含量，从而节约了大量的检测时间，还避免了污染的发生。常见的实时荧光定量PCR法有SYBR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman探针法等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman探针法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。
[0008]结合Taqman探针法的RQ-PCR方法，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了 PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、防污染和有较大的线性范围等优点。该方法能够满足对B型TEL-ABL融合基因mRNA的MRD的检测需求。因此本发明采用RQ-PCR结合Taqman探针法检测B型TEL-ABL融合基因。
【发明内容】
[0009]鉴于利用现有技术检测B型TEL-ABL融合基因的不足，本发明设计了检测B型TEL-ABL融合基因和内参基因abl的寡核苷酸，采用荧光定量PCR技术检测B型TEL-ABL融合基因。通过调整引物和探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，可使扩增效率和速率均达到最佳。
[0010]本发明提供用于检测B型TEL-ABL融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括:
[0011](1)检测B型TEL-ABL融合基因的引物TA_F、TA-R及探针TA-Probe，其碱基序列为:
[0012]
【权利要求】
1.用于检测B型TEL-ABL融合基因的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括: (1)检测B型TEL-ABL融合基因的引物TA_F、TA-R及探针TA-Probe，其碱基序列为:
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，TA-F、TA-R和TA-Probe的使用浓度比为 1:1:1。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，abl-F、abl_R和abl-Probe的使用浓度比为1:1:1。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的反应条件为:95°C预变性Imin ;95°C 15s，58°C 35 sec，40个循环，荧光信号于58°C 35 sec时采集。
5.一种检测样品中B型TEL-ABL融合基因的方法，包括如下步骤: (1)提取样品中的组织RNA; (2)将(I)中提取出的组织RNA逆转录为cDNA； (3)配置B型TEL-ABL融合基因检测qPCR反应液和内参基因abl检测qPCR反应液，其中所述B型TEL-ABL融合基因检测qPCR反应液包括检测B型TEL-ABL融合基因的引物TA-F、TA_R和探针TA-Probe，所述内参基因abl检测qPCR反应液包括检测内参基因abl的引物 abl_F、abl-R 和探针 abl-Probe ； (4)将(2)中获得的cDNA分别加入到(3)中配置的B型TEL-ABL融合基因检测qPCR反应液和内参基因abl检测qPCR反应液中； (5)利用实时荧光PCR仪进行扩增反应，获得内参基因abl的Ct值和B型TEL-ABL融合基因的Ct值； (6)根据(5)中的两种Ct值，确定B型TEL-ABL融合基因是否存在，其特征在于，
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述确定B型TEL-ABL融合基因是否存在的具体过程如下， 1)首先依据内参基因abl的Ct值，确定内参基因abl是否为阳性，当Ct< 35时，为阳性，则检测有效，当所述Ct > 35时，为阴性，则样品需要重新检测； 2)若内参基因abl为阳性，则根据B型TEL-ABL融合基因的Ct值判断B型TEL-ABL融合基因是否为阳性，其判断标准为=Ct〈35，为阳性；35 ^ Ct ^ 38，为疑似阳性；Ct > 38，为阴性； 3)若B型TEL-ABL融合基因为疑似阳性，需要再次验证，直到确定所述样品到底是B型TEL-ABL融合基因阴性或阳性时为止。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)的反应条件:95°C预变性Imin ;950C 15s，58°C 35 sec，40个循环，荧光信号于58°C 35 sec时采集。
【文档编号】C12Q1/68GK103757102SQ201310718489
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】陈奕磊, 李文静, 王淑一 申请人:成都艾迪康医学检测实验室有限公司