联合检测基因pten、vegf相对表达量的寡核苷酸和方法
【专利摘要】本发明提供基于荧光定量PCR技术联合检测基因PTEN、VEGF相对表达量的寡核苷酸和方法，主要涉及检测基因PTEN的上游引物PTEN-F、下游引物PTEN-R和探针PTEN-Probe；检测基因VEGF的上游引物VEGF-F、下游引物VEGF-R和探针VEGF-Probe；检测内参基因actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R和探针Actin-Probe，将所检测的基因PTEN、VEGF相对表达量分别地与健康人基因PTEN、VEGF相对表达量基准值进行比较，可用于各类癌症的辅助诊断。
【专利说明】联合检测基因PTEN、VEGF相对表达量的寡核苷酸和方法
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】，涉及联合检测基因PTEN、VEGF相对表达量的寡核苷酸和方法，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类各类癌症组织中的PTEN、VEGF相对表达量进行检测，可有效地节约检测时间，提高检测精度。
【背景技术】
[0002]位于10号染色体上的磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten, PTEN)基因，是1997年发现的新抑癌基因，也是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因(LI J, YEN C，LIAW DU, et al.PTEN, aputative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast andprostate cancer.Science, 1997，275 (5308): 1943-1947)。据吴元清报道 PTEN 基因位于染色体10q23，其表达产物PTEN蛋白具有诱导细胞凋亡、抑制细胞周期进展以及抑制细胞迁移、铺展和局部黏附的生理功能(吴元清.PTEN在非小细胞肺癌研究中的进展.国外医学:生理病理科学与临床分册，2003，23 (6): 577)。PTEN是近年来发现的肿瘤抑制基因，又称MMAC1/TEP1，位于染色体10q23.3，可通过对细胞内外信号传导的负调控发挥其抑癌作用。在结直肠癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌等多种癌组织中都已报道该基因的缺失或突变。国内外有关研究表明PTEN蛋白在正常组织、良性病变和癌组织中的表达差异具有显著性，并且PTEN蛋白的表达降低及缺失多发生在癌证中晚期，提示PTEN蛋白的表达与癌的发生发展有关。近年来的研究发现肿瘤对抗肿瘤药物产生耐受性是肿瘤内科治疗失败的主要原因，其中PTEN mRNA表达量降低能介导肿瘤对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)、单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab)、N0TCH1抑制剂耐药、顺钼、阿霉素和紫杉醇等的耐受性，从而降低化疗药物的作用(吴新刚，闾四平.PTEN基因与肿瘤耐药.中国新药杂志，2008，17 (15): 1291-1294)。因此，对癌症患者进行PTEN表达水平的检测对于指导后期治疗有着积极的作用。
[0003]肿瘤血管生成在肿瘤的生长、侵袭、转移过程中起着重要作用，血管内皮生长因子(VEGF)能刺激血管内皮细胞生长和增殖，是多种肿瘤血管生长因子的重要组分(LI J, YENC，LIAW DUjet al.PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated inhuman brain, breast and prostate cancer.Science，1997，275 (5308): 1943-1947)，并通过促进肿瘤血管生成，增加血管通透性和下调宿主抗肿瘤免疫应答等机制，参与实体瘤的发生与发展。VEGF的表达水平反应了肿瘤的生长速度和转移倾向，过度的VEGF表达使血管生成急剧增加，导致肿瘤扩展，VEGF具有重要的肿瘤生物学意义。Bevacizumab (商品名Avastin)是一种重组的人类单克隆IgGl抗体，通过抑制人类血管内皮生长因子的生物学活性而起作用。也就是说Avastin可结合VEGF并防止其与内皮细胞表面的受体(Flt-1和KDR)结合。在体外血管生成模型上，VEGF与其相应的受体结合可导致内皮细胞增殖和新生血管形成。有研究表明，VEGF基因表达水平高的患者的中位无进展生存期较长，而VEGFR基因表达水平低的患 者中位无进展生存期较短，疗效不明显。[0004]近年来，随着肿瘤个性化诊断的不断发展，肿瘤靶向位点表达水平检测的普及度也不断提升，但是在实际检测中还是出现了不少的问题，其中“单一靶向位点检测”结果的不稳定性已经成为限制肿瘤个性化诊断的一大瓶颈，此外“单一靶向位点检测”也难以提供全面的诊断和预后信息。因此，越来越多的研究集中到了 “多靶向位点联合检测”，这既对检测结果进行了双重验证，也为医生的诊断和制定后期治疗方案提供了可靠的参考信息。VEGF和PTEN正是这样的一对基因，近期关于联合检测癌症组织中基因VEGF、PTEN的表达的报道在国内外大量出现，研究发现两者的表达多数呈现负相关，联合检测PTEN和VEGF表达可作为各类癌症生物学行为和预后判断的重要指标。
[0005]在实际操作中， 用于检测PTEN、VEGF mRNA相对表达量的方法主要为免疫组化，尽管该法原理简单，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测PTEN、VEGF mRNA表达水平。
[0006]实时荧光定量PCR技术具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时在线检测，反映PTEN、VEGF在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR Green I染料法、双探针杂交法以及Taqman探针法等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman探针法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。
[0007]此外，利用结合Taqman探针法的实时荧光PCR技术定量检测待测样品中的目的基因PTEN、VEGF相对表达量，仅仅通过设置内参基因actin，来计算出待测样品中PTEN、VEGF基因表达量与待测样品内参基因actin表达量的比值仍然不足以判断这两种基因的表达量是否处于正常范围。
【发明内容】
[0008]为解决实时荧光定量PCR技术中SYBR Green I染料法、双探针杂交法的不足，本发明采用结合Taqman探针法的实时荧光定量PCR方法，它综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了 PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、防污染和有较大的线性范围等优点。
[0009]为此，本发明设计了联合检测目的基因(PTEN、VEGF)和内参基因actin的上下游引物和探针，用荧光定量PCR技术检测基因PTEN、VEGF相对表达量。通过调整这两种目的基因和内参基因的上下游、探针浓度及其比例，优化PCR的反应体系和反应条件，能够准确地确定样品中PTEN、VEGF基因相对表达量。
[0010]同时为了解决仅通过设置内参基因actin来确定基因PTEN、VEGF的相对表达量，并不足以判断这两种基因的相对表达量是否处于正常范围，本发明利用健康人中的基因PTEN、VEGF相对表达量基准值作为参照，就可以非常准确地判断所述相对表达量是否处于正常的表达范围。
[0011]本发明提供用于联合检测样品中基因PTEN、VEGF相对表达量的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括:[0012](I)检测基因PTEN的上游引物PTEN-F、下游引物PTEN-R和探针PTEN-Probe，其碱基序列为:
[0013]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0014]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG
[0015]PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA
[0016](2)检测基因VEGF的上游引物VEGF-F、下游引物VEGF-R和探针VEGF-Probe，其碱基序列为:
[0017]VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0018]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0019]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
[0020](3)检测内参基因actin的上游引物Actin_F、下游引物Actin-R和探针Actin-Probe,其喊基序列为:
[0021 ] Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0022]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0023]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
[0024]进一步地，检测基因PTEN的上游引物、下游引物和探针的使用浓度比为:PTEN-F:PTEN-R:PTEN-Probe=2:2:1。
[0025]进一步地，检测基因VEGF的上游引物、下游引物和探针的使用浓度比为:VEGF-F:VEGF-R:VEGF-Probe=2:2:1。
[0026]进一步地，内参基因actin的上游引物、下游引物和探针的使用浓度比为:Actin_F:Actin-R:Actin-Probe=2:2:1。
[0027]进一步地，分别利用检测基因PTEN、VEGF和内参基因actin的上游引物、下游引物和探针，在相同扩增条件下进行实时PCR扩增，然后确定样品中基因PTEN相对表达量Fsp，以及样品中基因VEGF相对表达量Fsv。
[0028]进一步地，根据所述Fsp和Fsv的值分别计算Fsp与Frp的比值Fp, Fsv与Frv的比值Fv，Frp和Frv分别为健康人中的基因PTEN、VEGF相对表达量基准值。
[0029]进一步地，所述Frp的值为0.72，所述Frv的值为0.55。
[0030]进一步地，所述扩增条件为:95°C预变性lmin，95°C 15s，58°C 35s，40个循环，荧光信号于58°C 35s时采集。
[0031]本发明还提供一种联合检测样品中基因PTEN、VEGF相对表达量的方法，包括以下步骤:
[0032](I)提取样品中的RNA ；
[0033](2)将(I)中提取出的RNA逆转录为cDNA ；
[0034](3)加入⑵中所述的cDNA到反应管中，分别利用检测基因PTEN的PTEN-F、下游引物PTEN-R和探针PTEN-Probe，检测基因VEGF的上游引物VEGF-F、下游引物VEGF-R和探针VEGF-Probe,检测内参基因actin的上游引物Actin_F、下游引物Actin-R和探针Actin-Probe， 获得基因PTEN、VEGF和内参基因actin的Ct值，其特征在于，
[0035]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0036]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG[0037]PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA
[0038]VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0039]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0040]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA[0041 ] Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0042]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0043]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ；
[0044](4)根据(3)中的基因PTEN、VEGF和内参基因actin的Ct值，并结合各自的标准定量曲线，计算样品中基因PTEN的相对表达量Fsp和基因VEGF的相对表达量Fsv ；
[0045](5)根据(4)中的Fsp和Fsv值分别计算Fsp与Frp的比值Fp, Fsv与Frv的比值 Fv，其中 Frp=0.72，Frv=0.55 ；
[0046](6)根据Fp和Fv的值进行判断:对Fp而言，当Fp>l.5时，基因PTEN相对表达量偏高，当Fp〈l.5时，基因PTEN相对表达量偏低，当0.5≤Fp≤1.5时，基因PTEN相对表达量正常；而对Fv而言，当Fv>25时，基因VEGF相对表达量偏高，当Fv〈15时，基因VEGF相对表达量偏低，当15≤Fv≤25时，基因PTEN相对表达量正常。
[0047]本发明还提供一种联合检测样品中基因PTEN、VEGF相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括样品RNA提取液；红细胞裂解液；检测基因PTEN的上游引物PTEN-F、下游引物PTEN-R和探针PTEN-Probe，检测基因VEGF的上游引物VEGF-F、下游引物VEGF-R和探针VEGF-Probe,检测内参基因actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R和探针Actin-Probe ；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，
[0048]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0049]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG
[0050]PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA[0051 ] VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0052]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0053]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
[0054]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0055]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0056]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
[0057]本发明的有益效果:本发明将实时荧光PCR技术和Taqman探针技术结合在一起，定量检测受测者体内PTEN、VEGF基因相对表达量，并与健康人的PTEN、VEGF基因相对表达量基准值进行比较，而能够更准确地衡量受测者体内PTEN、VEGF基因相对表达量是否正常。该发明特异性好，灵敏度高，操作简单，降低了检测成本，节约了检测时间。此外，鉴于基因PTEN和VEGF的表达在肿瘤靶基因上的作用相反，联合检测基因PTEN和VEGF的相对表达量，能够更加准确和更为全面地预测各类癌症进展，具有更为可靠的诊断价值，应用前景广泛。
[0058]鉴于仅仅通过设置基因actin作为内参，计算出待测样品目的基因PTEN、VEGF相对表达量Fsp和Fsv，仍然不足以判断它们的相对表达量是否处于正常范围，为此本发明根据健康人样品的大量临床检测结果，利用统计学方法创造性地计算出健康人的PTEN相对表达量基准值Frp和健康人的VEGF相对表达量基准值Frv。Frp是根据1000例健康人样品中基因PTEN和内参基因actin的Ct值，并结合各自的标准定量曲线，获得每例健康人样品中的PTEN和actin拷贝数，然后计算每例健康人样品中的PTEN相对表达量，即PTEN拷贝数与actin拷贝数的比值，再求这些比值的平均数而计算出来的，其值为0.72，即Frp=0.72。而Frv是根据1000例健康人样品中基因VEGF和内参基因actin的Ct值，并结合各自的标准定量曲线，获得每例健康人样品中的VEGF和actin拷贝数，然后计算每例健康人样品中的VEGF相对表达量，即VEGF拷贝数与actin拷贝数的比值，再求这些比值的平均数而计算出来的，其值为0.55,即Frv=0.55。根据Frp和Frv的值,分别计算Fp和Fv,其中Fp=Fsp/Frp, Fv=Fsv/Frv。
[0059]接着，根据对大量PTEN相对表达量偏高的临床样品进行分析，所测得的Fp值均大于1.5，因此设定当Fp>l.5时，PTEN相对表达量偏高；根据对大量PTEN相对表达量处于正常范围的临床样品进行分析，所测得的Fp值均不小于0.5且不大于1.5，因此设定当
0.5 ≤ Fp ≤ 1.5时，PTEN相对表达量正常；根据对大量PTEN相对表达量偏低的临床样品进行分析，所测得的Fp值均小于0.5，因此设定当Fp〈0.5时，PTEN相对表达量偏低。
[0060]与此同时，根据对大量VEGF相对表达量偏高的临床样品进行分析，所测得的Fv值均大于25，因此设定当Fv>25时，VEGF相对表达量偏高；根据对大量VEGF相对表达量处于正常范围的临床样品进行分析，所测得的Fv值均不小于15且不大于25，因此设定当15 ≤ Fv ≤ 25时，VEGF相对表达量正常；根据对大量VEGF相对表达量偏低的临床样品进行分析，所测得的Fv值均小于15，因此设定当Fv〈15时，VEGF相对表达量偏低。
[0061]此外，正是因为引入了健康人的PTEN相对表达量基准值Frp和健康人的VEGF相对表达量基准值Frv作为对照，通过计算出待测样品目的基因PTEN相对表达量Fsp与Frp的比值Fp，以及待测样品目的基因VEGF相对表达量Fsv与Frv的比值Fv，这样就可将Fp和Fv作为一种衡量指标来判定待测者体内的基因PTEN、VEGF相对表达量是否正常，从而能够对待测者的基因PTEN、VEGF相对表达量进行全面的评价，并指导后期治疗与用药。这是因为仅仅根据Fsp和Fsv只能评估待测者体内的基因PTEN、VEGF相对表达量在一段时间内的波动，但是这些相对表达量本身是否处于正常范围之内，人们无法评判，而且实际中还存在Fsp升高但是待测者体内的基因PTEN相对表达量仍然偏低或Fsv值下降但是待测者体内的基因VEGF相对表达量仍然偏高的情形，这时如果根据Fsp升高和Fsv值下降就以为待测者健康状况好转从而停止治疗或者不更换药物而继续使用原有药物，那么就会错过最好的治疗时机，甚至导致病情恶化。但是如果依据Fp和Fv的值，就可很好地克服这种Fsp升高但Fp仍然偏低或Fsv下降但Fv仍然偏高的情形。另外，鉴于在很多癌症中，基因PTEN、VEGF相对表达量存在负相关的关系，仅仅检测PTEN或VEGF相对表达量，或者仅仅判断PTEN或VEGF相对表达量是否在正常范围，不能准确地和全面地反应疾病特征，而将对这两种基因的检测和判断有机结合在一起，就不存在这个问题，而且还可更好地评估疾病预后。
[0062]总之，本发明不但能够对待测者体内的基因PTEN、VEGF相对表达量进行检测，同时还能够指导后期治疗方案的确定和药物选择，还可用于辅助临床各类癌症的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。
【专利附图】
【附图说明】[0063]图1是利用基于荧光定量PCR技术联合检测基因PTEN、VEGF相对表达量的试剂盒检测样品I的结果图
[0064]图2是利用基于荧光定量PCR技术联合检测基因PTEN、VEGF相对表达量的试剂盒检测样品2的结果图
【具体实施方式】
[0065]下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》 第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0066]实施例1用于联合检测PTEN和VEGF的寡核苷酸和试剂盒
[0067]用于联合检测样品中基因PTEN、VEGF相对表达量的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括:
[0068](I)检测基因PTEN的上游引物PTEN-F、下游引物PTEN-R和探针PTEN-Probe，其碱基序列为:
[0069]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0070]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG
[0071 ] PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA
[0072](2)检测基因VEGF的上游引物VEGF-F、下游引物VEGF-R和探针VEGF-Probe，其碱基序列为:
[0073]VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0074]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0075]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
[0076](3)检测内参基因actin的上游引物Actin_F、下游引物Actin-R和探针Actin-Probe,其喊基序列为:
[0077]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0078]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0079]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
[0080]一种联合检测样品中基因PTEN、VEGF相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括样品RNA提取液；红细胞裂解液；基因PTEN检测体系PCR反应液；基因VEGF检测体系PCR反应液；内参基因actin检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
[0081]RNA 提取液:QIAGEN RNeasy FFPE Kit。
[0082]IOX 红细胞裂解液配方为:NH4C182g，NaHC038.4g，EDTA_Na23.72g，加 ddH20 定容至 1000ml0
[0083]基因PTEN 检测体系 PCR 反应液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X )、上游引物PTEN-F0.8uM (10μM)、下游引物PTEN-R0.8uM (10 μ M),PTEN-probe (探针)0.4uM (10μΜ),其中:
[0084]PTEN-F:CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
[0085]PTEN-R:GTGAAACAACAGTGCCACTG
[0086]PTEN-Probe:FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA[0087]基因VEGF 检测体系 PCR 反应液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X )、上游引物VEGF-F0.8uM (10 μ M)、下游引物 VEGF-R0.8uM (10 μ M)、VEGF_probe (探针)0.4uM (10 μ Μ),其中:
[0088]VEGF-F:CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
[0089]VEGF-R:ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
[0090]VEGF-Probe:FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
[0091]阳性对照品:含VEGF或PTEN基因的溶液；
[0092]阴性对照品:不含VEGF或PTEN基因的溶液；
[0093]空白对照品:生理盐水或不加任何物质。
[0094]基因actin 检测体系 PCR 反应液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X)、上游引物 Actin-F0.8uM (10 μ M)、下游引物 Actin-R0.8uM (10 μ M)、Actin-probe (探针)0.4uM(10μΜ)，其中:
[0095]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0096]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0097]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
[0098]实施例2检测流程
[0099](I)抽提石蜡切片中的组织RNA:切去组织或者石蜡片样品于1.5ml离心管中(刮拭)；加入Iml组织透明液,振荡混匀后13000rpm离心Imin ;去除上清,加入500ml组织透明液，振荡混匀后13000rpm离心Imin ;去除上清,加入Iml无水乙醇振荡混匀后13000rpm离心Imin ;去除上清后至于37°C金属浴IOmin (开盖)，直至液体干燥；参考QIAGEN RNeasyFFPEKit石蜡RNA抽提试剂盒说明书，提取样品RNA。
[0100](2)参考Τ0Υ0Β0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。(3)试剂配置:按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X μ I,每人份25 μ I分装:
[0101]Χ=25μ1反应液X (8份内参基因(标准定量曲线)+8份目的基因(标准定量曲线)+η份样品+1份阳性对照品+1份阴性对照品+1份空白对照品)。如下表所示:
[0102]
【权利要求】
1.用于联合检测样品中基因PTEN、VEGF相对表达量的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括: (1)检测基因PTEN的上游引物PTEN-F、下游引物PTEN-R和探针PTEN-Probe，其碱基序列为:
PTEN -F: CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
PTEN -R: GTGAAACAACAGTGCCACTG
PTEN -Probe: FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA (2)检测基因VEGF的上游引物VEGF-F、下游引物VEGF-R和探针VEGF-Probe，其碱基序列为:
VEGF-F: CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
VEGF-R: ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
VEGF-Probe: FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA (3)检测内参基因actin的上游引物Actin_F、下游引物Actin-R和探针Actin-Probe,其碱基序列为:
Actin-F: TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R: TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe: FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，检测基因PTEN的上游引物、下游引物和探针的使用浓度比为:PTEN-F: PTEN-R: PTEN-Probe=2:2:1。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，检测基因VEGF的上游引物、下游引物和探针的使用浓度比为:VEGF-F:VEGF-R:VEGF-Probe =2:2:1。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，内参基因actin的上游引物、下游引物和探针的使用浓度比为:Actin_F:Actin-R:Actin_Probe=2:2:1。
5.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，分别利用检测基因PTEN、VEGF和内参基因actin的上游引物、下游引物和探针，在相同扩增条件下进行实时PCR扩增，然后确定样品中基因PTEN相对表达量Fsp，以及样品中基因VEGF相对表达量Fsv。
6.如权利要求5所述的寡核苷酸,其特征在于，根据所述Fsp和Fsv的值分别计算Fsp与Frp的比值Fp，Fsv与Frv的比值Fv，Frp和Frv分别为健康人中的基因PTEN、VEGF相对表达量基准值。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸，其特征在于，所述Frp的值为0.72，所述Frv的值为0.55。
8.如权利要求5所述的寡核苷酸，其特征在于，所述扩增条件为:95°C预变性lmin，95°C 15s，58°C 35s，40个循环，荧光信号于58°C 35s时采集。
9.一种联合检测样品中基因PTEN、VEGF相对表达量的方法，包括以下步骤: (1)提取样品中的RNA； (2)将⑴中提取出的RNA逆转录为cDNA； (3)加入⑵中所述的cDNA到反应管中，分别利用检测基因PTEN的PTEN-F、下游引物PTEN-R和探针PTEN-Probe，检测基因VEGF的上游引物VEGF-F、下游引物VEGF-R和探针VEGF-Probe,检测内参基因actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R和探针Actin-Probe，获得基因PTEN、VEGF和内参基因actin的Ct值，其特征在于，
PTEN -F: CAAAAAGGGAGTAACTATTCC
PTEN -R: GTGAAACAACAGTGCCACTG
PTEN -Probe: FAM-CCTGTTAAAGAATCATCTGGATTA-TAMRA
VEGF-F: CCTTGCCTTGCTGCTCTAC
VEGF-R: ACCACTTCGTGATGATTCTGCC
VEGF-Probe: FAM-TGGTCCCAGGCTGCACCCA-TAMRA
Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R: TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe: FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ； (4)根据(3)中的基因PTEN、VEGF和内参基因actin的Ct值，并结合各自的标准定量曲线，计算样品中基因PTEN的相对表达量Fsp和基因VEGF的相对表达量Fsv ； (5)根据(4)中的Fsp和Fsv值分别计算Fsp与Frp的比值Fp,Fsv与Frv的比值Fv,其中 Frp=0.72, Frv=0.55 ； (6)根据Fp和Fv的值进行判断:对Fp而言，当Fp>1.5时，基因PTEN相对表达量偏高，当Fp〈1.5时，基因PTEN相对表达量偏低，当0.5≤Fp≤1.5时，基因PTEN相对表达量正常；而对Fv而言，当Fv>25时，基因VEGF相对表达量偏高，当Fv〈15时，基因VEGF相对表达量偏低，当15≤Fv ^ 25时，基因PTEN相对表达量正常。
【文档编号】C12N15/11GK103740820SQ201310722709
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】周晓犊, 薛群, 王淑一 申请人:合肥艾迪康临床检验所有限公司