一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，步骤如下：（1）将栖热菌菌株的液体种子接种到液体培养基中，培养，制得菌株细胞培养液；（2）将菌株细胞培养液置于压力反应器内，在压力下发酵，制得发酵液；（3）将发酵液离心，收集菌体细胞，破碎细胞，制得细胞破碎液，将细胞破碎液采用双水相萃取体系制备海藻糖合成酶。本发明的方法可以提高栖热菌细胞内的海藻糖合成酶含量，降低酶的生产成本；本发明的方法可以实现海藻糖合成酶生产的连续化、规模化，并且酶的生产工艺简便。
【专利说明】一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，属于生物工程【技术领域】。【背景技术】 [0002]海藻糖合成酶(Trehalose synthase,EC5.4.99.16)是一种分子内葡糖苷转移酶，能够特异性地催化麦芽糖的α-1，4糖苷键转化为α-1，I糖苷键生成海藻糖。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的一种非还原性双糖，具有在逆境下保护生物体的生物膜和生物大分子的特殊功能，能赋予低等动物、植物和微生物等抵抗营养缺乏、高温、高渗透压、干燥、有毒物质等恶劣环境的能力，因而在生物制品、食品、药品、作物育种及精细化工等领域有着广泛的应用前景。
[0003]酶合成法是生产海藻糖的主要方法之一，是利用酶制剂所具有的转糖基作用在离体条件下作用于麦芽糖、蔗糖等底物生产海藻糖，该方法具有较高的特异性、快速温和、生产成本低等特点。酶法生产海藻糖有多种生物合成途径，可由不同的酶分别催化淀粉、葡萄糖、麦芽糖、寡糖等合成海藻糖。
[0004]利用海藻糖合成酶以麦芽糖为底物合成海藻糖的流程仅需一步反应，海藻糖的产率高且不受底物麦芽糖浓度的影响，工艺简单，易于调控，是酶法生产海藻糖的最简单途径，因而海藻糖合成酶已被广泛应用于海藻糖的工业化生产。在耻垢分枝杆菌{Mycobacterium smegmatis)、脂肪杆菌 QPimelobacter sp.)、食尼古丁节杆菌(Arthrobacter flicoiiflOFiaras)、恶臭假单胞菌putida)和一些栖热菌(Sazmz1S)等菌株中都发现了海藻糖合成酶，但上述菌株细胞内的海藻糖合成酶含量低，酶的活性低，导致酶的生产成本较高，因此如何提高海藻糖合成酶的含量、降低生产成本是目前急需解决的技术问题。
[0005]研究发现当微生物细胞处于饥饿、高温、高渗透压等外界刺激时会发生应激反应，提高细胞内合成海藻糖酶系的活性，从而增加海藻糖产量以抵抗外界胁迫。目前对部分微生物在上述条件下细胞内海藻糖和海藻糖合成酶的变化已有一定的研究，如段作营(生物加工过程，2007.5)在进行热激对恶臭假单胞菌SI胞内海藻糖合成酶的影响研究时，采用热刺激的方法使海藻糖合成酶的酶活提高了 76%;如中国专利文献CN 12190715A (申请号03129701.3)公开了一种以葡萄糖为基质两步发酵法生产酵母胞外海藻糖的方法，首先采用氮饥饿、热休克、渗透胁迫等方法，诱导酵母细胞产生较多的应激酶-海藻糖合成酶系，然后利用酵母细胞中的海藻糖合成酶系大量合成胞外海藻糖；外界压力也是一种刺激条件，生物反应器的压力对微生物胞内特定产物的含量也有显著影响，如中国专利文献CN1480535A (申请号03130410.9)公开了利用高压提高酵母菌海藻糖产量的方法，该方法较常压对照条件下胞内海藻糖含量提高了 20~70%。目前关于利用压力提高栖热菌海藻糖合成酶含量的研究还没有相关报道或专利。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有技术的不足，提供一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法。
[0007]本发明采用的技术方案为: 一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，其特征是，步骤如下:
(O从试管斜面上挑取1-2环栖热菌菌株接种到液体种子培养基中，在65~70°C、100~150r/min下培养12~16h,制得活化后的液体种子,然后将液体种子按体积比3%~5%的接种量接种到液体培养基中，在60~70°C、150~200r/min下培养20~24h，制得菌株细胞培养液；
(2)将菌株细胞培养液置于压力反应器内，在0.5~2.0MPa压力下发酵I~6h，发酵条件为60~70°C、150~200r/min，制得发酵液；
(3)将发酵液离心，收集菌体细胞，破碎细胞，制得细胞破碎液，然后将细胞破碎液采用双水相萃取体系制备海藻糖合成酶。
[0008]所述步骤(1)中的栖热菌菌株为水生栖热菌)ATCC33923或栖热菌属菌iThermus sp.) ATCC 43815,以上菌株均保藏于美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)，可以通过购买的方式获得。
[0009]所述步骤(1)中的液体种子培养基的组分为:葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L, NaC15g/L, ρΗ7.5，蒸馏水 1000mL0
[0010]所述步骤(1)中的液体培养基的组分为:葡萄糖20g/L，麦芽糖5~10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨 5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 lg/L，ρΗ7.5，蒸馏水 1000mL0
[0011]所述步骤(3)中的采用双水相萃取体系制备海藻糖合成酶的步骤如下:向细胞破碎液中加入硫酸铵和分子量为2000的聚乙二醇，在总体系中使硫酸铵的质量百分比浓度为8wt%~ 10wt%、聚乙二醇的质量百分比浓度为10wt%~12￥丨％，混合均匀，静置分相，制得硫酸铵下相溶液和含有海藻糖合成酶的聚乙二醇上相溶液；向聚乙二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为5wt%~ 6wt%，调节溶液的pH值为7.0~
8.0，混合均匀，静置分相，制得含有海藻糖合成酶的硫酸铵下相溶液和聚乙二醇上相溶液；将制得的硫酸铵下相溶液，采用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得海藻糖合成酶。
[0012]有益效果
(I)本发明使用的栖热菌细胞内含有海藻糖合成酶，该酶能够特异性地催化麦芽糖转化为海藻糖并且催化产率高，是海藻糖酶法生产中最具应用前景的酶制剂。
[0013](2)本发明的方法是利用压力作为一种外界刺激因素，在压力作用下栖热菌细胞内的海藻糖合成酶含量增加、酶活性升高，从而降低了海藻糖合成酶的生产成本。
[0014](3)本发明的方法可以实现海藻糖合成酶生产的连续化、规模化，并且酶的生产工艺简便。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
[0016]本发明中采用的压力反应器是一套带有搅拌装置的压力可测定和控制的不锈钢加压反应装置，其体积为3000mL，样品可用注射器注入。使用高纯空气为加压介质，以0.05MPa/min的速度升压，保压，以0.05MPa/min的速度降压至常压。在操作过程中，所测定的压力值为反应器的罐压值。
[0017]本发明中海藻糖合成酶的酶活力测定步骤如下:
取细胞培养液在5000r/min下离心20min，收集菌体，用蒸馏水洗涤菌体三次，制得湿菌体。取1.0g湿菌体加入到19.6mL的0.03mol/L、pH7.2的磷酸缓冲液中，再加入0.4mL的甲苯，在35°C下处理2h，制得细胞处理液。取细胞处理液在4°C、12000r/min下离心15min，收集上清液，上清液经0.45Mffl的微孔滤膜过滤，收集过滤液，制得粗酶液。取10.0mL粗酶液加入到10.0mL的10wt%麦芽糖溶液中，在50°C、150r/min下，反应10h，反应液再在沸水浴中保温lOmin。取反应液在5000r/min下离心20min,收集上清液。取上清液,采用高效液相色谱仪(购自上海天普分析仪器有限公司)测定海藻糖的含量。
[0018]海藻糖合成酶的酶活力单位定义为:上述反应条件下，每小时转化生成Img海藻糖的酶量为1U。
[0019]原料来源:甲苯、硫酸铵均购自天津市致远化学试剂有限公司，聚乙二醇购自美国陶氏化学公司。
[0020]实施例1
一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，步骤如下:
(1)从试管斜面上挑取2环栖 热菌菌株接种到液体种子培养基中，在70°C、150r/min下培养16h，制得活化后的液体种子，然后将液体种子按体积比5%的接种量接种到液体培养基中，在70°C、200r/min下培养24h，制得菌株细胞培养液；
(2)将步骤(1)制得的菌株细胞培养液置于压力反应器内，在1.5MPa压力下发酵4h，发酵条件为70°C、200r/min，制得发酵液；
(3)将步骤(2)制得的发酵液1000mL在5000r/min下离心20min，收集菌体细胞，将菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量浓度为30wt%的悬浮液，将悬浮液冷却至10°C左右，采用德国APV公司生产的APV-2000-1型高压细胞破碎机进行三次细胞破碎，破碎机操作压力为60MPa，制得含有海藻糖合成酶的细胞破碎溶液216mL ;向细胞破碎液中加入硫酸铵和分子量为2000的聚乙二醇，在总体系中使硫酸铵的质量百分比浓度为10wt%、聚乙二醇的质量百分比浓度为llwt%，混合均匀，静置分相，制得硫酸铵下相溶液和含有海藻糖合成酶的聚乙二醇上相溶液；向聚乙二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为5wt%，调节溶液的pH值为7.0，混合均匀，静置分相，制得含有海藻糖合成酶的硫酸铵下相溶液和聚乙二醇上相溶液；将制得的硫酸铵下相溶液，采用截留分子量为20000 Dal的超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得海藻糖合成酶932mg。
[0021]经检测，栖热菌细胞内的海藻糖合成酶活力为82.5U/g湿细胞。
[0022]所述步骤(1)中的栖热菌菌株为水生栖热菌(?6?τ.Λ5)ATCC33923,该菌种购自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)。
[0023]所述步骤(1)中的液体种子培养基的组分为:葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L, NaC15g/L, ρΗ7.5，蒸馏水 1000mL0
[0024]所述步骤(1)中的液体培养基的组分为:葡萄糖20g/L，麦芽糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨 5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 lg/L, ρΗ7.5，蒸馏水 1000mL0
[0025]实施例2一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，步骤如下:
(1)从试管斜面上挑取I环栖热菌菌株接种到液体种子培养基中，在65°C、100r/min下培养12h，制得活化后的液体种子，然后将液体种子按体积比3%的接种量接种到液体培养基中，在60°C、150r/min下培养20h，制得菌株细胞培养液；
(2)将步骤(1)制得的菌株细胞培养液置于压力反应器内，在2.0MPa压力下发酵lh，发酵条件为60°C、150r/min，制得发酵液；
(3)将步骤(2)制得的发酵液1000mL在5000r/min下离心20min，收集菌体细胞，将菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量浓度为35wt%的悬浮液，将悬浮液冷却至10°C左右，采用德国APV公司生产的APV-2000-1型高压细胞破碎机进行三次细胞破碎，破碎机操作压力为60MPa，制得含有海藻糖合成酶的细胞破碎溶液198mL ;向细胞破碎液中加入硫酸铵和分子量为2000的聚乙二醇，在总体系中使硫酸铵的质量百分比浓度为8wt%、聚乙二醇的质量百分比浓度为12wt%，混合均匀，静置分相，制得硫酸铵下相溶液和含有海藻糖合成酶的聚乙二醇上相溶液；向聚乙二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为5wt%，调节溶液的pH值为8.0，混合均匀，静置分相，制得含有海藻糖合成酶的硫酸铵下相溶液和聚乙二醇上相溶液。将制得的硫酸铵下相溶液，采用截留分子量为20000 Dal的超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得海藻糖合成酶663mg。
[0026]经检测，栖热菌细胞内的海藻糖合成酶活力为54.lU/g湿细胞。
[0027]所述步骤(1)中的液体种子培养基的组分为:葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L, NaC15g/L, ρΗ7.5，蒸馏水 1000mL0
[0028]所述步骤(2)中的液体培养基的组分为:葡萄糖20g/L，麦芽糖5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨 5g/L, KH2PO4 2g/L，MgSO4 lg/L, ρΗ7.5，蒸馏水 1000mL0
[0029]实施例3
如实施例1所述的提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，不同之处在于:
步骤(2 )中，将菌株细胞培养液置于压力反应器内，在0.5MPa压力下发酵6h，制得发酵液。
[0030]在此条件下，制得海藻糖合成酶862mg。
[0031]经检测，栖热菌细胞内的海藻糖合成酶活力为78.lU/g湿细胞。
[0032]实施例4
如实施例2所述的提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，不同之处在于: 步骤(2)中，将菌株细胞培养液置于压力反应器内，在1.0MPa压力下发酵2h，制得发酵液。
[0033]在此条件下，制得海藻糖合成酶824mg。
[0034]经检测，栖热菌细胞内的海藻糖合成酶活力为73.2U/g湿细胞。
[0035]实施例5
如实施例1所述的提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，不同之处在于:
步骤(1)中，栖热菌菌株为栖热菌属菌(Sezmz1S sp.) ATCC 43815，该菌种购自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)。
[0036]在此条件下，制得海藻糖合成酶9ISmg。
[0037]经检测，栖热菌细胞内的海藻糖合成酶活力为84.2U/g湿细胞。[0038]实施例6
如实施例2所述的提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，不同之处在于:
步骤(1)中，栖热菌菌株为栖热菌属菌(Se/mAs sp.) ATCC 43815，该菌种购自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)。
[0039]在此条件下，制得海藻糖合成酶657mg。
[0040]经检测，栖热菌细胞内的海藻糖合成酶活力为52.2U/g湿细胞。
[0041]对比例I
如实施例1所述的提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，不同之处在于:
步骤(2)中，将菌株细胞培养液置于压力反应器内，在常压下发酵4h，发酵条件为70°C、200r/min，制得发酵液。
[0042]在此条件下，制得海藻糖合成酶506mg。
[0043]经检测，栖热菌细胞内的海藻糖合成酶活力为43.3U/g湿细胞。
[0044]对比例2 如实施例6所述的提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，不同之处在于:
步骤(2)中，取菌株细胞培养液置于压力反应器内，在常压下发酵lh，发酵条件为600C、150r/min,制得发酵液。
[0045]在此条件下，制得海藻糖合成酶502mg。
[0046]经检测，栖热菌细胞内的海藻糖合成酶活力为41.7U/g湿细胞。
[0047]在上述实施例和对比例中，当栖热菌菌株在压力条件下发酵时，其细胞内的海藻糖合成酶含量增加，酶活力也升高。在实施例1和对比例I中，栖热菌菌株在1.5MPa压力下发酵4h比常压发酵4h，其细胞内的海藻糖合成酶含量增加84.19%、酶活力升高90.53% ；在实施例6和对比例2中，栖热菌菌株在2.0MPa压力下发酵Ih比常压发酵lh，其细胞内的海藻糖合成酶含量增加30.88%、酶活力升高25.18%。由此表明，压力可明显提高栖热菌细胞内的海藻糖合成酶的含量。
【权利要求】
1.一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，其特征是，步骤如下: (O从试管斜面上挑取1-2环栖热菌菌株接种到液体种子培养基中，在65~70°C、100~150r/min下培养12~16h,制得活化后的液体种子,然后将液体种子按体积比3%~5%的接种量接种到液体培养基中，在60~70°C、150~200r/min下培养20~24h，制得菌株细胞培养液； (2)将菌株细胞培养液置于压力反应器内，在0.5~2.0MPa压力下发酵I~6h，发酵条件为60~70°C、150~200r/min，制得发酵液； (3)将发酵液离心，收集菌体细胞，破碎细胞，制得细胞破碎液，然后将细胞破碎液采用双水相萃取体系制备海藻糖合成酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的栖热菌菌株为水生栖热菌(Thermos aquatics ) ATCC33923 或栖热菌属菌(Jhermos sp.) ATCC 43815。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的液体种子培养基的组分为:葡萄糖 10g/L，酵母膏 10g/L,蛋白胨 10g/L, NaC15g/L, pH7.5，蒸懼水 1000mLo
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的液体培养基的组分为:葡萄糖 20g/L，麦芽糖 5 ~10g/L，酵母膏 5g/L，蛋白胨 5g/L，KH2P04 2g/L，MgSO4 lg/L，pH7.5，蒸懼水1000mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的采用双水相萃取体系制备海藻糖合成酶的步骤如下:向细胞破碎液中加入硫酸铵和分子量为2000的聚乙二醇，在总体系中使硫酸铵的质量百分比浓度为8wt%~10wt%、聚乙二醇的质量百分比浓度为10wt%~12wt%，混合均匀，静置分相，制得硫酸铵下相溶液和含有海藻糖合成酶的聚乙二醇上相溶液；向聚乙二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为5wt%~6wt%，调节溶 液的pH值为7.0~8.0，混合均匀，静置分相，制得含有海藻糖合成酶的硫酸铵下相溶液和聚乙二醇上相溶液；将制得的硫酸铵下相溶液，采用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得海藻糖合成酶。
【文档编号】C12R1/01GK103695407SQ201310729535
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】董永胜, 马蕾, 段元良 申请人:齐鲁工业大学