一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用的制作方法
一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用。该类芽孢杆菌（Paenibacillus?sp.），保藏编号为CGMCC?No.8333，是类芽孢杆菌属的一个新种，其分类地位是Paenibacillus?sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus?damxungensis?sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用类芽孢杆菌做出了一定的贡献。该菌株属类芽孢杆菌属，多糖含量丰富，可作为一种微生物治疗剂，也可用来制备胞外多糖。
【专利说明】一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域,具体的涉及一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)新种及其培养方法和应用。
【背景技术】
[0002]以形态学为分类基础，早期研究将类芽孢杆菌归入芽孢杆菌属。1994年，Ash等通过PCR探针试验分析了不同芽孢杆菌种的16S rRNA序列，并发现一些芽孢杆菌与其他芽孢杆菌的表型特征差异极大，16S rRNA序列存在高度特异性。以此，Ash将多粘芽孢杆菌等11个种从芽孢杆菌属中分离出来，独立为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。
[0003]类芽孢杆菌属,其模式种为Paenibacillus polymyxa ATCC842T,细胞呈杆状,最适温度28~30°C，主要的脂肪酸为为反异式饱和脂肪酸C15:00类芽孢杆菌属G+C含量范围为45 ~54mol %。
[0004]一般认为G+C mol%差别大于5%，可判断着两株菌不属于同一个种(甚至在其他性状相似的情况下也可作上述判断)。DNA同源性的分析能够最终确定菌株的分类，也是确定新种的一个途径。在最适的条件下，DNA同源性在70%以上是属于同一种的，在20%以上是
属于同一属的。
[0005]目前研究认为，将表现性和DNA同源性结合起来划分种和属的效果是准确可取的。
[0006]类芽孢杆菌属的很多微生物对植物具有防病作用和促生作用，因此在农业生产中具有很好的应用潜力。类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质,如酶、抗菌物质、植物激素以及絮凝剂等，这些活性物质大多为蛋白质、多糖、多肽等。类芽孢杆菌产生的抗菌物质按其物质类型及分子大小可分为小分子的多肽抗生素类、大分子的拮抗蛋白(酶)类等。这些抗菌物质性质比较稳定，如耐高温、高压，对酸碱稳定，对蛋白酶不敏感等。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供类芽孢杆菌属的一个新种及其培养方法和应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
[0008]本发明的技术方案之一是:一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.),保藏编号为CGMCC N0.8333。
[0009]本发明的技术方案之二是:一种培养类芽孢杆菌CGMCC N0.8333的方法，包括以下步骤，将类芽孢杆菌CGMCC N0.8333接种于培养基中，在15~40°C和pH5.5~8.5条件
下培养。
[0010]本发明所述的培养的温度为15~40°C，优选30°C。
[0011]本发明所述的培养的pH值为5.5~8.5，优选6.0。
[0012]本发明，优选的，所述的培养的培养基中还包括不超过10%的NaCl，所述百分比为质量百分比。[0013]本发明所述的培养可以是各种微生物的培养方式，比如液体培养、固体培养、半固体培养等，可以是摇床培养，也可以是发酵罐深层发酵，优选的摇床培养。
[0014]本发明所述的培养的接种量为常规，优选2%，所述百分比为体积百分比。
[0015]本发明所述的培养基为类芽孢杆菌常规培养基，优选是TYC培养基。
[0016]本发明所述的培养是常规的类芽孢杆菌培养，较佳的在在需氧条件下进行。
[0017]本发明的技术方案之三是:类芽孢杆菌CGMCC N0.8333在制备胞外多糖中的应用。
[0018]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0019]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0020]本发明的积极进步效果在于:本发明提供了类芽孢杆菌属的一个新种，该菌株的分类地位是Paenibacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus damxungensis sp.ηον.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用类芽孢杆菌做出了一定的贡献。本发明的类芽孢杆菌BD3526，可作为一种微生物治疗剂，也可用来制备胞外多糖。
[0021]生物材料保藏信息
[0022] 本发明的类芽孢杆菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。该菌株的保藏编号为=CGMCC N0.8333。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，名称为BD3526。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的特征和有益效果。
[0024]图1显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526在TYC培养基上的菌落形态
[0025]图2显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526的生长曲线。横坐标为时间，纵坐标为96孔板中100 μ L培养液在600nm下的OD值。
[0026]图3显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526的16S rRNA系统发育进化树。【具体实施方式】
[0027]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0028]Paenibacillus hunanensis FeL05T (ACCC10718T=CGMCC N0.1.8907τ)与Paenibacillus po lymyxa ATCC842T (CGMCC N0.1.4261T)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
[0029]实施例1本发明新微生物的获得
[0030]从西藏自治区当雄县采集牦牛奶，以无菌方式取1ml，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上，30 V培养24-48小时。选取粘鼻涕状、具有良好拉丝性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到纯化的菌落。[0031]实施例2本发明新微生物的获得及其特征
[0032]Biolog微生物自动检测仪(生产厂商:Biolog公司)鉴定实验:
[0033]Biolog微生物自动检测仪(生产厂商=Biolog公司)鉴定实验,是Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源进行呼吸代谢的差异，筛选95种不同碳源或其他化学物质，配合显色物质，固定于96孔板上(Al孔为阴性对照)。接种菌悬液培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行呼吸代谢过程中产生的化学还原物质欲显色物质发生反应导致的吸光度以及由于微生物生长造成的浊度，生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得到最终鉴定结果。
[0034]I)取如上所述实施例1中的单菌落多个，分别接种到液体TYC中，30°C培养24h。
[0035]2)在10000r/min下离心20min,弃去上清液,加ImL生理盐水,在振荡器上振动5min使之混匀；再于10000r/min下离心20min,重复2次,除去其中的碳源；弃去上清液,加ImL生理盐水,在振荡器上振动5min使之混匀，于2000r/min下离心lmin。
[0036]3)取上清液倒入装有20mL已灭菌生理盐水(NaCl，0.85%)的试管中，并使其OD59tl维持在 0.13 ± 0.02。
[0037]4)将如上所述稀释液加入Biolog ECO微平板中(150 μ L /孔)，然后在20°C下培养，每隔12h用Biolog细菌自动读数仪读取数据，连续测定2d。结果如表1所示。
[0038]表1.菌株BD3526的Biolog鉴定结果
[0039]
【权利要求】
1.一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，其特征在于，其保藏编号为CGMCC N0.8333。
2.一种培养类芽孢杆菌CGMCC N0.8333的方法，其特征在于，包括以下步骤:将类芽孢杆菌CGMCC N0.8333接种于培养基中，在15~40°C和pH5.5~8.5条件下培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的温度为30°C。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的pH值为6.0。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的培养基中还包括不超过10%的NaCl，所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养为摇床培养。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的接种量为2%，所述百分比为体积百分比。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基是TYC培养基。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养在需氧条件下进行。
10.如权利要求1所述的类芽孢杆菌CGMCCN0.8333在制备胞外多糖中的应用。
【文档编号】C12P19/04GK103740618SQ201310752153
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】吴正钧, 高彩霞, 郭本恒, 刘振民, 杭锋, 韩瑨 申请人:光明乳业股份有限公司
【专利摘要】本发明公开了一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用。该类芽孢杆菌（Paenibacillus?sp.），保藏编号为CGMCC?No.8333，是类芽孢杆菌属的一个新种，其分类地位是Paenibacillus?sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus?damxungensis?sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用类芽孢杆菌做出了一定的贡献。该菌株属类芽孢杆菌属，多糖含量丰富，可作为一种微生物治疗剂，也可用来制备胞外多糖。
【专利说明】一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域,具体的涉及一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)新种及其培养方法和应用。
【背景技术】
[0002]以形态学为分类基础，早期研究将类芽孢杆菌归入芽孢杆菌属。1994年，Ash等通过PCR探针试验分析了不同芽孢杆菌种的16S rRNA序列，并发现一些芽孢杆菌与其他芽孢杆菌的表型特征差异极大，16S rRNA序列存在高度特异性。以此，Ash将多粘芽孢杆菌等11个种从芽孢杆菌属中分离出来，独立为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。
[0003]类芽孢杆菌属,其模式种为Paenibacillus polymyxa ATCC842T,细胞呈杆状,最适温度28~30°C，主要的脂肪酸为为反异式饱和脂肪酸C15:00类芽孢杆菌属G+C含量范围为45 ~54mol %。
[0004]一般认为G+C mol%差别大于5%，可判断着两株菌不属于同一个种(甚至在其他性状相似的情况下也可作上述判断)。DNA同源性的分析能够最终确定菌株的分类，也是确定新种的一个途径。在最适的条件下，DNA同源性在70%以上是属于同一种的，在20%以上是
属于同一属的。
[0005]目前研究认为，将表现性和DNA同源性结合起来划分种和属的效果是准确可取的。
[0006]类芽孢杆菌属的很多微生物对植物具有防病作用和促生作用，因此在农业生产中具有很好的应用潜力。类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质,如酶、抗菌物质、植物激素以及絮凝剂等，这些活性物质大多为蛋白质、多糖、多肽等。类芽孢杆菌产生的抗菌物质按其物质类型及分子大小可分为小分子的多肽抗生素类、大分子的拮抗蛋白(酶)类等。这些抗菌物质性质比较稳定，如耐高温、高压，对酸碱稳定，对蛋白酶不敏感等。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供类芽孢杆菌属的一个新种及其培养方法和应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
[0008]本发明的技术方案之一是:一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.),保藏编号为CGMCC N0.8333。
[0009]本发明的技术方案之二是:一种培养类芽孢杆菌CGMCC N0.8333的方法，包括以下步骤，将类芽孢杆菌CGMCC N0.8333接种于培养基中，在15~40°C和pH5.5~8.5条件
下培养。
[0010]本发明所述的培养的温度为15~40°C，优选30°C。
[0011]本发明所述的培养的pH值为5.5~8.5，优选6.0。
[0012]本发明，优选的，所述的培养的培养基中还包括不超过10%的NaCl，所述百分比为质量百分比。[0013]本发明所述的培养可以是各种微生物的培养方式，比如液体培养、固体培养、半固体培养等，可以是摇床培养，也可以是发酵罐深层发酵，优选的摇床培养。
[0014]本发明所述的培养的接种量为常规，优选2%，所述百分比为体积百分比。
[0015]本发明所述的培养基为类芽孢杆菌常规培养基，优选是TYC培养基。
[0016]本发明所述的培养是常规的类芽孢杆菌培养，较佳的在在需氧条件下进行。
[0017]本发明的技术方案之三是:类芽孢杆菌CGMCC N0.8333在制备胞外多糖中的应用。
[0018]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0019]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0020]本发明的积极进步效果在于:本发明提供了类芽孢杆菌属的一个新种，该菌株的分类地位是Paenibacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus damxungensis sp.ηον.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用类芽孢杆菌做出了一定的贡献。本发明的类芽孢杆菌BD3526，可作为一种微生物治疗剂，也可用来制备胞外多糖。
[0021]生物材料保藏信息
[0022] 本发明的类芽孢杆菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。该菌株的保藏编号为=CGMCC N0.8333。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，名称为BD3526。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的特征和有益效果。
[0024]图1显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526在TYC培养基上的菌落形态
[0025]图2显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526的生长曲线。横坐标为时间，纵坐标为96孔板中100 μ L培养液在600nm下的OD值。
[0026]图3显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526的16S rRNA系统发育进化树。【具体实施方式】
[0027]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0028]Paenibacillus hunanensis FeL05T (ACCC10718T=CGMCC N0.1.8907τ)与Paenibacillus po lymyxa ATCC842T (CGMCC N0.1.4261T)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
[0029]实施例1本发明新微生物的获得
[0030]从西藏自治区当雄县采集牦牛奶，以无菌方式取1ml，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上，30 V培养24-48小时。选取粘鼻涕状、具有良好拉丝性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到纯化的菌落。[0031]实施例2本发明新微生物的获得及其特征
[0032]Biolog微生物自动检测仪(生产厂商:Biolog公司)鉴定实验:
[0033]Biolog微生物自动检测仪(生产厂商=Biolog公司)鉴定实验,是Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源进行呼吸代谢的差异，筛选95种不同碳源或其他化学物质，配合显色物质，固定于96孔板上(Al孔为阴性对照)。接种菌悬液培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行呼吸代谢过程中产生的化学还原物质欲显色物质发生反应导致的吸光度以及由于微生物生长造成的浊度，生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得到最终鉴定结果。
[0034]I)取如上所述实施例1中的单菌落多个，分别接种到液体TYC中，30°C培养24h。
[0035]2)在10000r/min下离心20min,弃去上清液,加ImL生理盐水,在振荡器上振动5min使之混匀；再于10000r/min下离心20min,重复2次,除去其中的碳源；弃去上清液,加ImL生理盐水,在振荡器上振动5min使之混匀，于2000r/min下离心lmin。
[0036]3)取上清液倒入装有20mL已灭菌生理盐水(NaCl，0.85%)的试管中，并使其OD59tl维持在 0.13 ± 0.02。
[0037]4)将如上所述稀释液加入Biolog ECO微平板中(150 μ L /孔)，然后在20°C下培养，每隔12h用Biolog细菌自动读数仪读取数据，连续测定2d。结果如表1所示。
[0038]表1.菌株BD3526的Biolog鉴定结果
[0039]
【权利要求】
1.一种类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，其特征在于，其保藏编号为CGMCC N0.8333。
2.一种培养类芽孢杆菌CGMCC N0.8333的方法，其特征在于，包括以下步骤:将类芽孢杆菌CGMCC N0.8333接种于培养基中，在15~40°C和pH5.5~8.5条件下培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的温度为30°C。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的pH值为6.0。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的培养基中还包括不超过10%的NaCl，所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养为摇床培养。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的接种量为2%，所述百分比为体积百分比。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基是TYC培养基。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养在需氧条件下进行。
10.如权利要求1所述的类芽孢杆菌CGMCCN0.8333在制备胞外多糖中的应用。
【文档编号】C12P19/04GK103740618SQ201310752153
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】吴正钧, 高彩霞, 郭本恒, 刘振民, 杭锋, 韩瑨 申请人:光明乳业股份有限公司
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